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1 2006 Chlamydomonas reinhardtii RNA

2 p.3 p.3 p.4 p.7 p.8 p.8 p.9 p.9 2

3 [ ] RNA RNA RNA aada RNA RNAi-37 aph DNA Tag RNA Tag RESDA-PCR Tag Chlamydomonas reinhardtii Tag RNAi G Tag scaffold 45 (Release ver.3.0) peptidase M14, carboxy peptidase A [ ] RNA RNA interference : RNAi RNA double-strand RNA : dsrna RNA RNA mrna RNAi 1998 mrna RNAi dsrna RNase Dicer small interfering RNAs : sirnas 2 sirnas RNA RISC sirna mrna RNAi RNAi Chlamydomonas reinhardtii spectinomycin aada Chlamydomonas P-1030 aada mrna 3

4 DNA RNAi aada mrna RNAi-37 Tag aph DNA Tag RNAi Tag RNAi RNAi RESDA-PCR Tag Chlamydomonas Chlamydomonas Tag Tag Tag RNAi [ ] Chlamydomonas RNAi Chlamydomonas RNAi C. reinhardtii mt-(cc-124) P-(1030) spectinomycin 19-P(1030) aada DNA DNA zeocin ble zeocin TAP RNAi spectinomycin, zeocin TAP spectinomycin RNAi-37 1 DNA RNAi-37 Tag paromomycin aph paromomycin TAP Tag 96 TAP ampicillin 100 g/ml, zeocin 10 g/ml, spectinomycin 100 g/ml, 200 g/ml, 300 g/ml TAP 1/10 spectinomycin Tag 1 CTAB DNA RESDA-PCR DNA RESDA-PCA Tag Tag RESDA-PCR Gonzalez-Ballester et al.,2006 4

5 Tag aph [aph1460tail/5 -GGCAAGCCGATAAACACCAGC-3 ],[aph1380tail/5 -AGTGCACGCAAC GCATCGTCC-3 ] hsp70a [hsp70a/tail/r1/5 -GTAAAGTGGAGGTCACCGT-3 ] 4 [Deg Alu /5 -CCAGTGAGCAGAGTGACGIIIIINNSWCA SWCAGCTT-3 ],[Deg Pst /5 -CCAGTGAGCAGAGTGACGIIIIINNSCTGCAGW-3 ],[Deg Sac / 5 -CCAGTGAGCAGAGTGACGIIIIINNSCCGCGGW-3 ],[Deg Taq /5 -CCAGTGAGCAGAGTGACGIIIIINNSWGTCGAA-3 ] [Q0/ 5 -CCAGTGAGCAGAGTGACG-3 ] I=, N A,G,T,C,S G,C,W A,T PCR 1 M M 1 M M Taq DNA Polymerase Bio Labs 0.2 ThenmoPol Buffer mM dntp mixture 2 DNA M M 1 M M Ex Taq Takara Ex Taq Buffer 5 2.5mM dntp mixture 4 PCR DNA2 50 [(96,5min) 1 (95,1min ; 60,1min ; 72,3min) 5 (95,1min ; 25,3min ; ramping to 72,over 3min ; 72,3min) 1 (95,1min ; 60,1min ; 72,3min ; 95,1min ; 60,1min ; 72,3min ; 95,1min ; 40,1min ; 72,3min) 20 (72,10min) 1 (4, )] [(96,5min) 1 (95,1min ; 60,1min ; 72,3min) 42 (72,10min) 1 (4, )] [(96,5min) 1 (95,30s ; 60,30s ; 72,3min) 42 (72,10min) 1 (4, )] Ex Taq 5 bp BioLabs Taq DNA Polymerase aph Tag aph Tag PCR PCR [pkf1480f/5 -GCTGGCGTTTTAC CGGCTG-3 ] aph pbluescript KS(-) 5

6 bp 7 [pkf1700r/5 -CAGCACGAAACGGGGAGC-3 ], [pkf2120r/5 -CTTCCAGGGGGAAACGC-3 ],[pkf2490r/5 -TCAGCAGAGCGCAGATACC-3 ],[pkf2780r/5 -GATCACGCATCTTCCCGAC-3 ],[pkf3030r/5 -CCGACATTATCGCGAGC-3 ],[pkf3330r/5 -ATCGAATGCAACCGGCGC-3 ],[pkf3590r/5 -CTCGTCCAACATCAATACA ACC-3 ] PCR 1 M M 1 M M Ex Taq Takara Ex Taq Buffer mM dntp mixture 2 DNA1 25 [(96,5min) 1 (95,30s ; 60,30s ; 72,3min) 42 (72,10min) 1 (4, )] RESDA-PCR Tag Tag aph [pkf3500f/5 -TGCCATTCTCACCGGATTCAG-3 ], [pkf3520f/5 -CAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTC-3 ],[pkf3560f/5 -ACTTGATAACCTTA TTTTTGACGAGGGGA-3 ] 3 Tag 4 PCR Tag [pkf1610f/5 -AAATGGAGGCGCTCGTTGATCTG-3 ], [pkf1650f/5 -GGTGGATGGAAGATACTGCTCTC-3 ],[pkf1670f/5 -CTCTCAAGTGCTGAA GCGGTAG-3 ],[pkf2730f/5 -CCATCATCCAGCCAGAAAGTG-3 ],[pkf2750f/5 -AAGTGAG GGAGCCACGCAC-3 ],[pkf2770f/5 -GTCTGCGTTGTCGGGAAGATG-3 ] PCR PCR 0.8 Tag PCR clean up kit Promega 1.5 m Membrane binding Buffer heat block Membrane binding Buffer 10mg 10 16,000g (14,000rpm) DNA 700 Membrane Wash Solution 16,000g (14,000rpm) 500 Membrane Wash Solution 16,000g (14,000 rpm) ,000g (14,000 rpm) DNA 10 6

7 DNA Tag [hsp70a/tail/r1/5 -GTAAAGTGGAGGTCACCGT-3 ] Tag Tag Tag Chlamydomonas center BLAST Tag Tag Tag 12kbp [ ] Chlamydomonas Tag 31,000 spectinomycin 114 Tag Tag Tag Tag RESDA-PCR 12 (26-8D, 92-12C, 96-8H, 96-9H, B, 173-1C, G, 191-9F, 293-5E, 295-3F, H, 310-1G) 11 (23-8D, 92-12C, 96-8H, 96-9H, B, 173-1C, G, 191-9F, 293-5E, 295-3F, 310-1G ) Alu,Pst,Sac,Taq PCR 3 Tag Tag 96-9H, 92-12C, 173-1C, 310-1G, 295-3F, 293-5E, H H, 173-1C 2 aph 96-9H [pkf2730f/5 -CCATCATCCAGCCAGAAAGTG-3 ],[pkf2750f/5 -AAGTGAGGGAGCCACG CAC-3 ],[pkf2770f/5 -GTCTGCGTTGTCGGGAAGATG-3 ] 92-12C,310-1G,295-3F,293-5E [pkf1610f/5 -AAATGGAGGCGCTCGTTGATCTG-3 ],[pkf1650f/5 -GGTGGATGGAAGATA CTGCTCTC-3 ],[pkf1670f/5 -CTCTCAAGTGCTGAAGCGGTAG-3 ] H, 173-1C aph ( 4) 7

8 Tag Tag RESDA-PCR 12 (26-8D, 92-12C, 96-8H, 96-9H, B, 173-1C, G, 191-9F, 293-5E, 295-3F, H, 310-1G ) 8 (26-8D, 92-12C, 96-8H, 96-9H, 293-5E, 295-3F, H, 310-1G ) Alu,Pst,Sac,Taq 5 Tag Tag PCR DNA Chlamydomonas BLAST Tag 1 [ ] RESDA-PCR RESDA-PCR Tag 600 bp 1 kbp Chlamydomonas Tag Tag 200 bp hsp70a Tag Q0 Q0 hsp70a/tail/r1 DNA Tag PCR Tag BLAST Tag 12kbp / M14, A APG5,KOG1474, CP12, MSRA3, RPN6 96-8H, G Tag scaffold Tag APG5 M14, A scaffold Tag APG5 / 8

9 RNAi spectinomycin RNAi spectinomycin [ ] [ ] (1)Gonzalez-Ballester D,de Montaiqu A,Galvan A,Fernandez E.Restriction enzyme site-directed amplification PCR: a tool to identify regions flanking a marker DNA. Anal Biochem Jun 15;353(2):302. Gregory J. Hannon, RNAi, (2004) (3) /, RNA 2000 (4) / / /, RNAi 2004 [ ] Tag 9

10 Tag Tag PCR Tag Tag aada psi Not Kpu Xba pbluescript KS(-) aph sp1, sp2, sp3 Tag amp 10 g/ml zeo 10 g/ml spc 100 g/ml spc 300 g/ml 10

11 RNAi spectinomycin Tag RNAi RNAi Tag spc300 g/ml TAP spectinomycin 96-9H 92-12C A P S T A P S T 1kbp 600bp 200bp Tag 200bp DNA Ladder Alu,Pst,Sac,Taq PCR 96-8H, 92-12C DNA H H 11

12 Tag 200 bp DNA Ladder 96-8H, 96-9H, 186-2H 96-8H 186-2H H H 293-5E A S T A S T bp 200bp Tag 200bp DNA Ladder Alu, Sac,Taq PCR 96-9H, 293-5E Pst 2 12

13 13

14 1 Tag PCR DNA Tag Tag Tag 14

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