研究成果報告書

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みそらあいきょう
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1 様式 C-19 科学研究費補助金研究成果報告書平成 21 年月日現在研究種目 : 若手研究 (B) 研究期間 :27~28 課題番号 : 研究課題名 ( 和文 ) 新規 NF-kB 選択的阻害剤による急性膵炎の重症化および多臓器不全の抑制研究課題名 ( 英文 ) Inhibition of severity of acute pancreatitis and MOF by a novel NF-kB inhibitior,. 研究代表者細田充主 (HOSODA MITSUCHIKA) 北海道大学北海道大学病院医員研究者番号 : 研究成果の概要 : セルレインによる急性膵炎モデルで新規 NF-kB 選択的阻害剤を用いて重症化多臓器不全の抑制効果について検討したセルレイン膵炎を誘導することはできたがによる膵炎の抑制は血清学的にも組織学的にも効果がなかったそのため多臓器不全モデルのセルレイン膵炎と LPS による致死率モデルを検討したがモデルの確立には至らなかったまた膵炎の程度多臓器障害の程度を血清組織学的に評価したがによる抑制効果は認められなかった交付額 ( 金額単位 : 円 ) 直接経費間接経費合計 27 年度 1,8, 1,8, 28 年度 1,, 4, 1,9, 年度年度年度総計 3,3, 4, 3,7, 研究分野 : 医試薬学科研費の分科細目 : 外科系臨床医学消化器外科学キーワード :NF-κB 急性膵炎多臓器不全 1. 研究開始当初の背景重症急性膵炎は良性疾患でありながら致命率は高く予後不良の疾患であることから 1991 年に難病に指定され 23 年には急性膵炎の診療ガイドラインが発行され実際的な診療指針を提供するに至っているしかし重症例では抗生物質蛋白分解酵素阻害剤持続動注療法持続血液濾過透析などの特殊療法を施行しても致死率は 1~2% と高率でいまだに有効な治療法が確立されていないのが現状である最近急性膵炎の重症化機序に免疫能障害の関与が示唆されており急性膵炎により産生された炎症性 mediator が発症後早期の全身性反応症候群 (SIRS) による臓器障害を惹起するこの炎症性 mediator の代表例が IL-1,IL-6,TNF-α などのサイトカインケモカイン一酸化窒素 (NO) でありその産生の調節に関与しているのが NF-κB と呼ばれる転写因子であるこの NF-κB は DNA に直接結合し様々な炎症性 mediator の産生を引き起こすため ( 図 1) NF-κB の抑制が急性炎症による SIRS の病態を沈静化させさらには引き続き起こる急性肺障害 (ARDS) 急性膵炎の死因として重要な多臓器不全症候群 (MODS) への進行抑制に寄与すると示唆されている ( 図 2)

2 図 1 NF-kB により誘導される炎症性 mediator 1 サイトカイン産生の上昇あるいは 2 NF-κB の活性上昇とによるサイトカイン産生抑制 NF-κB 活性抑制効果の評価を行う (2) 急性膵炎重症化モデルにおける致死図 2 急性膵炎による多臓器不全とNF-kBの関与 2. 研究の目的新規 NF-kB 選択的阻害剤のDehydroxym ethylepoxyquinomicin() を用いて急性膵炎の抑制 MODSへの進行の抑制を試み重症化の機序 MODSのメカニズムとNF-kBの関与を解明し新規の重症急性膵炎抑制法の基礎的開発法を検討することである 3. 研究の方法 (1) 急性膵炎の重症化因子に対するによる抑制効果の検討 (In vitro) 分離予定細胞 :1 腺房細胞 2 肺胞マ率の検討 1~12 週齢の C7BL/6J マウスを用いて急性膵炎による多臓器不全を発症させる急性膵炎はコレシストキニン analog のセルレインを ug/kg の投与量を1 時間おきに7 回腹腔内投与するその2 時間後に LPS を 1mg/kg の投与量で静脈内投与することで2 次感染を模倣し多臓器不全を発症させる膵炎発症前 (prophylactic group) あるいは発症後 (treatment group) にを 12mg/kg の投与量で腹腔内投与し致死率の改善効果について検討した 4. 研究成果 (1) 急性膵炎の重症化と多臓器不全の機序と NF-kB との関与を解明するため新規 NF-kB 選択的阻害剤を用いてセルレイン (Cn) 膵炎モデルで検討したまず C7BL6/J マウスを用いて Cn 急性膵炎を作製したコレシストキニン analog である Cn を 1 時間おきに 6 回腹腔内投与 (ip) することで急性膵炎が起きていることを確認したによる急性膵炎の抑制効果を検討するためまず Cn 投与 2 時間前にマウスにを 12mg/kg の用量で ip し ( 予防的投与群 :pro) 文献上言われている膵炎のピークである Cn 初回投与 12 時間後に血清組織学的検討を行ったが血清の lipase では群に比較しやや低かったものの有意の抑制を認めず amylase は有意の抑制をみなかった ( 図 3) そこで犠牲死の時間を変えて検討したがいずれも群と比較して差がなかったそこで投与時間を Cn 最終投与後 2 時間に変更し ( 治療的投与群 :tre) 血清組織学的検討を行ったしかし予防的投与群と同様に血清, 組織とも膵炎の程度は群と同程度で膵炎を抑制することは出来なかった ( 図 3) クロファージ 3 好中球上記細胞を分離しセルレインまたは LPSあるいは両者による刺激に対する反応と添加による下記因子の活性抑制を評価する評価項目 :1cytokine(IL-1 / IL-6 / TNFα / IL-1 /TGF-β) 2NF-κB(EMSA) 上記各細胞における各種刺激に対する Lipase Cn(tre) cont Cn(tre) Cn(pro) cont Cn(pro)

U/L 7 6 4 3 2 1 Amylase Cn(tre) cont Cn(tre) Cn(pro) cont Cn(pro) (3) さらに全身への影響として肝機能腎機能の指標として, GPT, LDH, BUN, を測定したがいずれも予防

群と同程度であった ( 図 4) A: (12h) pro GPT 2 2 1 12h 1h 3h 7h 9h 18h 24h mg/dl.2.18.16.14.12.1.8.6.4.2 図 Cn 膵炎後肝腎機能評価 ( 予防的投与群 ) B: (12h) pro 4 3 2 1 GPT 1 図 4 Cn 膵炎後組織学的評価 12 時間後予防的投与群 A: コントロール B: 投与群 mg/dl.

3 U/L Amylase Cn(tre) cont Cn(tre) Cn(pro) cont Cn(pro) (3) さらに全身への影響として肝機能腎機能の指標として, GPT, LDH, BUN, を測定したがいずれも予防治療的投与測定時間に関わらずと同程度であった ( 図 6) 2 1 図 3 Cn 膵炎後アミラーゼリパーゼ Cont: (2) また組織学的検討においても膵炎の程度 ( 空砲化壊死性変化浮腫 ) は予防治療的投与群に関わらず群と同程度であった ( 図 4) A: (12h) pro GPT h 1h 3h 7h 9h 18h 24h mg/dl 図 Cn 膵炎後肝腎機能評価 ( 予防的投与群 ) B: (12h) pro GPT 1 図 4 Cn 膵炎後組織学的評価 12 時間後予防的投与群 A: コントロール B: 投与群 mg/dl h 3h 7h 9h 12h 図 6 Cn 膵炎後肝腎機能評価 ( 治療的投与群 )

(4) Cn 膵炎モデルでのによる膵炎抑制効果は認められなかったことから Cn 膵炎後 LPS を腹腔内投与 (ip) し致死モデルを作製したまず LPS の投与量による致死量を決定するため LPS 単剤による致死率を検討した過剰投与にても致死が得られないため LPS の投与方法を ip より静脈内投与 (iv) へ変更したしかし

は Cn 投与終了時に 12mg/kg ip したしかし Cn+LPS モデルではコントロールでも全例生存してしまう結果となってしまった Cn LPS の溶解に用いている生理食塩水が Cn 投与 6 回で補液効果となってしまい生存が得られたのではと考えられた () 血清学的評価では amylase,lipase のピークは Cn 初回投与後

A: コントロール B: 投与群 12 1 8 6 4 2 co ntrol 図 7:Cn+LPS 膵炎後のアミラーゼリパーゼおよびの予防的投与の検討 (6) また組織学的検討においても膵炎の程度 ( 空砲化壊死性変化浮腫 ) は群と同程度であった (7) 全身への影響として肝機能腎機能 (, GPT, LDH, BUN, )

4 (4) Cn 膵炎モデルでのによる膵炎抑制効果は認められなかったことから Cn 膵炎後 LPS を腹腔内投与 (ip) し致死モデルを作製したまず LPS の投与量による致死量を決定するため LPS 単剤による致死率を検討した過剰投与にても致死が得られないため LPS の投与方法を ip より静脈内投与 (iv) へ変更したしかし確実な致死率が得られないためマウスの種類を C7BL6 より BALB/c へ変更したその結果安定した致死率が得られ LPS 投与量も 3mg/kg と決定した重症急性膵炎モデル (Cn+LPS) による致死率を検討した Cn を 1 時間おきに 6 回 ip しその 2 時間後に LPS を iv する致死性急性膵炎モデルを検討したは Cn 投与終了時に 12mg/kg ip したしかし Cn+LPS モデルではコントロールでも全例生存してしまう結果となってしまった Cn LPS の溶解に用いている生理食塩水が Cn 投与 6 回で補液効果となってしまい生存が得られたのではと考えられた () 血清学的評価では amylase,lipase のピークは Cn 初回投与後 9 時間で Cn 膵炎より早めにピークが来ていたが特に逸脱量に相違はなかったまた治療群と群でほぼ同程度であった ( 図 7) A: Cn+LPS Control 12h pro B: Cn+LPS 12h pro Amylase U/L 1 contorl Lipase 図 8 Cn+LPS 膵炎後組織学的評価 12 時間後予防的投与群 A: コントロール B: 投与群 co ntrol 図 7:Cn+LPS 膵炎後のアミラーゼリパーゼおよびの予防的投与の検討 (6) また組織学的検討においても膵炎の程度 ( 空砲化壊死性変化浮腫 ) は群と同程度であった (7) 全身への影響として肝機能腎機能 (, GPT, LDH, BUN, ) を評価したがいずれも測定時間に関わらずと同程度であった ( 図 9) の投与時期を変更 ( 予防的投与治療的投与 ) しても変わらなかったまた組織学的評価において肝細胞の balooning などの浮腫炎症所見もと群で同程度であったすなわちによる Cn 膵炎における膵炎の重症化を抑制することはできなかった

5 GPT (3) 連携研究者なし mg/dl 図 6 Cn+LPS 膵炎後肝腎機能評価 ( 治療的投与群 ). 主な発表論文等 ( 研究代表者研究分担者及び連携研究者には下線 ) 雑誌論文 ( 計件 ) 学会発表 ( 計 2 件 ) 1 日本臓器保存生物医学会 (H ) 高橋徹膵ラ氏島における新規 NF-kB 阻害薬 dehydroxymethylepoxyquinomicin( ) の IBMIR 及び免疫抑制効果について ( 六本木アカデミーヒルズ ) 2 第 2 回代用臓器再生医学研究会 (H2.2.2) 高橋徹選択的 NFkB 阻害剤のドナー投与によるマウス肝内膵島移植成績の改善効果北海道大学学術交流会館 ( 小講堂 ) 6. 研究組織 (1) 研究代表者細田主充 (HOSODA MITSUCHIKA) 北海道大学北海道大学病院医員研究者番号 : (2) 研究分担者藤堂省 (TODO SATORU) 北海道大学医学研究科教授研究者番号 : 松下通明 (MATSUSHITA MICHIAKI) 北海道大学保健科学研究院教授研究者番号 :2242

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Powered by TCPDF ( Title 熱傷後敗血症性肺障害モデルにおけるHMGB1の動態の解明 Sub Title Detection of the role of High Mobility Group Box-1 on septic lung injury Powered by TCPDF (www.tcpdf.org) Title 熱傷後敗血症性肺障害モデルにおけるHMGB1の動態の解明 Sub Title Detection of the role of High Mobility Group Box-1 on septic lung injury mice after burn injury Author 安倍, 晋也 (Abe, Shinya)