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ゆうりゅういちぞの
5 years ago
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1 アフィニティービーズのご紹介住友ベークライト株式会社 S- バイオ事業部 - 1 -

2 製品概要生体分子 ( タンパク質や核酸など ) のアプリケーションに幅広く対応できるアフィニティ精製用担体 ( 球状ビーズ ) ですビーズ表面に施した弊社独自の表面処理により非特異吸着が高度に抑制されています高 S/N 比を実現! ビーズ表面の活性エステル基がアミノ基 (-NH2) をもつリガンド ( タンパク質核酸等 ) を共有結合により強固に固定できますビーズを前処理する事無く直接ビーズにリガンドを固定できますビーズのコア材は樹脂ではなくシリカなので比重が大きく遠心分離後上清とビーズがはっきりと分かれ B/F 分離が容易に行えます < 主な用途 > ターゲット物質の効率的な精製高感度相互作用解析など - 2 -

3 担体 ( ビーズ ) の性状アミノ基と共有結合 R アミノ基を持つリカント活性エステル基低吸着セグメント長さ 20A 10mm アフィニティービーズの SEM 画像ポリマーによる表面処理ポリマーはコアに直接結合 ( 共有結合 ) 多孔質シリカビーズコア材多孔質シリカ ( 孔径 7nm) 平均粒径 5μ m 充填密度 0.675g/ml 官能基活性エステル官能基密度 0.05μ mol/mg 主鎖から官能基までの距離約 20A - 3 -

4 Q. リガンドの固定化量は? Q&A A. IgG( 抗体 ) Avidin の下記例をご参考下さいリカント分子量固定量固定化時のリガンド濃度 μ g/mg pmol/mg mg/ml IgG 146, Avidin 60, ,250 Q. 有機溶剤酸アルカリ性に対する耐性は? A. 下記を確認下さい殆どの有機溶剤に耐性があります酸性についてはフッ酸には溶けますがそれ以外の酸には比較的耐性がありますグリシン塩酸 (ph2.5) に室温 1 分間浸漬で問題ありませんでしたアルカリ性については ph9.5 で 37 4 時間までは物理的な劣化は確認されませんでしたがコア材がシリカですので基本的にアルカリ性には弱いとお考えください - 4 -

5 リガンドの固定化スキーム R 活性基 : アミノ基を持つ化合物と反応 + H 2 N R R : 小分子リガンド抗体アビジン低吸着表面 R + R DNA 置換反応ビーズ表面の活性基とアミノ基 (-NH2) を持つ化合物が置換反応し固定化されます - 5 -

6 アプリケーション例アビジン固定化ビーズの調製 P.7~12 ビオチン固定化ビーズの調製 P.13~18 サンドイッチ法による IL-4 の検出 P.19~20 SDS-PAGE による CRP の検出 P.21~24 DNA ハイブリダイゼーション反応 P.25~27-6 -

7 Absorbance at 450nm < 応用例 > アビジンの固定アビジン固定化量及び非特異吸着量の定量 S-BIO ビーズの官能基にアビジンを直接固定化し, ビオチン標識化 HRP を捕捉 S/N= S/N=7.6 Anti Human IgG の非特異吸着を評価 Bio tin Avidin HRP-Biotin HRP-Antibody HRP-Biotin HRP-Antibody Anti Human IgG Avidin Y S-BIO R beads A 社アヒシンビーズ S/N 比が高い - 7 -

8 Absorbance at 450nm < 応用例 > アビジンの固定検出感度曲線高感度! S-BIO ビーズの官能基にアビジンを直接固定化し, ビオチン標識化 HRP を捕捉 0.5 S-BIO R A 社 (1mg 使用 ) (1mg 使用 ) Bio tin Avidin [HRP-Biotin](M) 高感度検出可能 - 8 -

9 Absorbance at 450nm < 応用例 > アビジンの固定ヒト血清の非特異吸着量アビジン化したビーズに対するヒト血清中の IgG の非特異吸着 Anti Human IgG Y 人血清中の IgG Avidin 0 S-BIO S-BIO R beads R A 社 A 社アヒシンビーズヒト血清の非特異吸着が少ない - 9 -

10 < 応用例 > アビジンの固定アビジンビーズ特性比較まとめ特性 S-BIO アヒシンヒース A 社アヒシンヒースコア材シリカ磁性粒子平均粒径 5mm 1.05mm 充填密度 0.40g/ml 沈降性 / 分離性卓上遠心機磁石で分離ビオチン捕捉能 A 社以上 2500 pmol free biotin 再分散性ピペッティングで可ピペッティングで可 S/N 比 A 社以上検出感度 A 社以上人血清 IgGの非特異吸着 A 社以下

11 < 応用例 > アビジンの固定アビジンビーズ作製プロトコル (i) ビーズ 37mg と 50mg /ml アビジン溶液 ( 弊社固定化溶液 )1ml を混合し, 37 で 4 時間攪拌 (ii) 遠心分離後, 上澄み液を除去 (iii) 1 PBS Buffer で数回洗浄 (iv) 弊社フロッキンク溶液 1ml を投入し活性基を不活性化室温下, 1 時間攪拌 (v) 遠心分離後, 上澄み液を除去 (vi)1 PBS Buffer で数回洗浄 (vii) 乾燥 ( 凍結乾燥可能 )

12 < 応用例 > アビジンの固定アビジンビーズ評価例 (i) アビジン化ビーズ 1mg と 5mg /ml ビオチン標識化 HRP 溶液 ( 溶媒は 1 PBS Buffer (ph7.4))1ml を混合し, 室温下, 30 分間攪拌 (ii) 遠心分離後, 上澄み液を除去 (iii) 0.05% の Triton 100 を含む 1 PBS Buffer で 5-10 回洗浄 (iv)3,3, 5,5 -Tetramethylbenzidine (TMBZ) を含む発色溶液 ( 弊社製ペルオキシダーゼ用発色キットより使用 )100ml を投入し, 室温下, 15 分間攪拌 (v) 停止液 ( 弊社製ペルオキシダーゼ用発色キットより使用 )100ml を加え反応を停止 (vi) 遠心分離後, 上澄み液の吸光度 (450nm) を測定

13 Absorbance at 450nm < 応用例 > ビオチンの固定ビオチン固定化量及び非特異吸着量の定量 S/N= S/N=2.5 ビーズにビオチンを固定化し, HRP 標識化アビジンを捕捉アヒシン濃度 (5ug/ml) Avidin Bio tin 0 Biotin 固定化 Biotinなし Biotin 固定化 Biotinなし S-BIOSbio R beads B 社ビーズ S/N 比が高い B 社ビーズはビオチンなしでも非特異的に固定化されるアヒシンがある

14 Absorbance at 450nm < 応用例 > ビオチンの固定検出感度曲線 S-BIO R (1mg 使用 ) B 社 (10μL 使用 ) S-BIO R 不活性化 B 社不活性化ビーズにビオチンを固定化し, HRP 標識化アビジンを捕捉 Avidin Bio tin [HRP-Streptavidin](M) 非特異吸着 Avidin 非特異吸着量が少ない

15 Absorbance at 450nm < 応用例 > ビオチンの固定ヒト血清の非特異吸着量ビオチン化したビーズに対するヒト血清の IgG の非特異吸着 Anti Human IgG Y 人血清中の IgG Bio tin 0 S-BIO R beads ビオチン B 社ビーズビオチンヒト血清の非特異吸着が少ない

16 < 応用例 > ビオチンの固定ビオチンビーズ特性比較まとめ特性 S-BIO B 社コア材シリカアガロースゲル平均粒径 5mm mm 充填密度 0.40g/ml 官能基密度 mmol/mg 15mmol/ml of gel 耐溶剤性 DMSO, 他は未評価 Alchole, DMSO, dioxane, formabid 沈降性卓上遠心機で可卓上遠心機で可再分散性ピペッティングで可ピペッティングで可 S/N 比 B 社以上検出感度 B 社同等人血清 IgGの非特異吸着 B 社以下

17 < 応用例 > ビオチンの固定ビオチンビーズ作製例 (i) ビーズ 10mg と 16mM アミノ化ビオチン溶液 ( 弊社固定化溶液あるいは DMSO) 100ul を混合 (ii) チューブローテーターにより 37 で 3 時間攪拌 (iii) 遠心分離後, 上澄み液を除去 (iv) 弊社フロッキンク溶液 (1ml) を投入し活性基を不活性化室温下, 1 時間攪拌 (v) 遠心分離後, 上澄み液を除去 (vi) 1 PBS Buffer で数回洗浄 (vii) 乾燥 ( 凍結乾燥可能 )

18 < 応用例 > ビオチンの固定ビオチンビーズ評価例 (i) ビオチン化ビーズ 1mg と 5mg /ml HRP 標識化アビジン溶液 ( 溶媒は 1 PBS Buffer (ph7.4))1ml を混合し, 室温下, 30 分間攪拌 (ii) 遠心分離後, 上澄み液を除去 (iii) 0.05% の Triton 100 を含む 1 PBS Buffer で 5-10 回洗浄 (iv) 3,3, 5,5 -Tetramethylbenzidine (TMBZ) を含む発色溶液 ( 弊社製ペルオキシダーゼ用発色キットより使用 )100ml を投入し, 室温下, 15 分間攪拌 (v) 停止液 ( 弊社製ペルオキシダーゼ用発色キットより使用 )100ml を加え反応を停止 (vi) 遠心分離後, 上澄み液の吸光度 (450nm) を測定

19 応用例 < サンドイッチ法による IL-4 の検出 > 検出感度曲線高い濃度依存性非特異吸着が少ない高い濃度依存性 & 非特異吸着が少ない

20 応用例 < サンドイッチ法による IL-4 の検出 > サンドイッチ法による IL-4 の検出の評価例 (i) 50μ g/ml に調製した IL-4 抗体溶液中にアフィニティービーズ 20mg を分散させ室温にて 4 時間転倒混和して抗体固定化 0.05%TritonX-100 含有 PBS で 3 回洗浄 (ii) pg/mL に調製した I L-4 溶液中に上記ビーズを 5mg 分散させ室温にて 2 時間転倒混和して抗原捕捉 0.05%TritonX-100 含有 PBS で 3 回洗浄 (iii) 500ng/mL に調製したビオチン標識 IL-4 抗体溶液 1mL に分散させ室温にて 1 時間転倒混和 0.05%TritonX-100 含有 PBS で 3 回洗浄 (iv) 100ng/mL に調製した HRP 標識 IL-4 ストレプトアビジン溶液に分散させ室温にて 30 分転倒混和して標識化 0.05%TritonX-100 含有 PBS で 3 回洗浄 (v) ペルオキシダーゼ用発色試薬を用いてビーズに捕捉された HRP 標識ストレプトアビジンの固定化量を 450nm の吸光度により測定 (vi) 他社活性型アフィニティビーズ (micromod 社の sicastar( 表面修飾基 :NHS)) についても上記と同様の実験を実施なお IL-4 抗体固定化後ビーズを 1%BSA 含有 PBS1mL に分散させ 2 時間転倒混和することによりブロッキングする工程を追加で実施した

応用例 < SDS-PAGE による CRP の検出 > SDS-PAGE による CRP の検出結果 (kda) 分子量マーカー 1 2 3 250 150 100 75 50 37 25 20 15 1CRP

21 応用例 < SDS-PAGE による CRP の検出 > SDS-PAGE による CRP の検出結果 (kda) 分子量マーカー CRP 抗体固定ビーズ 2 抗体なしビーズ 3CRP CRP 3μ g/ml の CRP 中に分散させた後 SDS-PAGE で電気泳動抗体固定化ビーズで補足したCRPを遊離して検出 CRPの非特異吸着が少ない

22 応用例 < SDS-PAGE による CRP の検出 > SDS-PAGE による CRP の検出の評価例 (i) 50μ g/ml の CRP 抗体溶液にアフィニティービーズ 20mg を分散させ室温にて 1 晩転倒混和して抗体を固定化 0.05%Tween20 含有 PBS で 3 回洗浄 (ii) 抗体を固定化せず不活性化用緩衝液を用いて不活性化したビーズを上記と同様に作製 (iii) 上記ビーズ各 6mg を 3μ g/ml に調製した CRP 溶液中に分散させ 4 にて 2 時間転倒混和して CRP を捕捉 0.05%Tween20 含有 PBS で 3 回洗浄 (iv) グリシン HCl バッファ (ph3) を用いてビーズに捕捉された CRP を溶出し SDS サンプルバッファで変性 (v) SDS-PAGE で電気泳動

23 応用例 < SDS-PAGE による CRP の検出 > CRP 抗体固定化ビーズの抗体固定化量 HRP 標識 Anti-Mouse IgG CRP 抗体固定化ビーズ抗体固定化量 Anti-CRP IgG Anti-CRP IgG ありなしありなし S-BIO C 社抗体固定化量が多い抗体固定化量不活性化ビーズ

24 CRP 抗体固定化ビーズの抗体固定化量評価例 (i) CRP 抗体固定化ビーズおよび不活性化ビーズ各 5mg を 1.3μ g/ml に調製した HRP 標識 Anti-Mouse IgG 溶液 1mL に分散させ室温にて 1 時間転倒混和 (ii) 0.05%Tween20 含有 PBS で 3 回洗浄後ペルオキシダーゼ用発色試薬を用いてビーズに捕捉された HRP 標識 Anti-Mouse IgG 量を 450nm の吸光度により測定 (iii) 他社活性型シリカビーズについても同様に評価したなお CRP 抗体固定化後ビーズを 1%BSA 含有 PBS1mL に分散させ 2 時間転倒混和することによりブロッキングする工程を追加で実施した

25 Abs DNA ハイブリダイゼーション反応 O C OR NH2 dt 30mer DNA を固定 dt 30mer ヒオチン標識 da30mer ハイフリタイセーション反応室温 30 分 dt 30mer HRP 標識アヒシン基質吸光度測定吸光度測定結果 bare beads dtなしヒース dt immobilized beads dt 固定化ヒースビーズ上でハイブリダイゼーション反応可能 SUMITOMO SUMITOMO BAKELITE BAKELITE CO.,LTD. CO.,LTD.

26 DNA 固定化プロトコル (i) ビーズ 10mg と 5μ M アミノ修飾 dt30mer 溶液 ( 弊社固定化溶液あるいは DMSO) 1mL を混合 37, 終夜攪拌 (ii) 遠心分離後, 上澄み液を除去 (iii) 超純水で 2 回洗浄 (iv) 弊社フロッキンク溶液 (1mL) を投入し活性基を不活性化室温下, 1 時間攪拌 (v) 遠心分離後, 上澄み液を除去 (vi) 超純水で数回洗浄

27 DNA ハイブリダイゼーション反応プロトコル (i) 1μ M Biotin-dA30mer(100uL) のハイブリ溶液と dt30mer 固定化ビーズ 10mg を混合する (ii) 30 分間室温で撹拌する (iii) 0.05%PBS 溶液 250μ L で 3 回洗浄する (iv) 5μ g/ml の HRP 標識アビジン溶液を 100μ L ずつ分注する (v) 30 分間室温で撹拌する (vi) 0.05%PBS 溶液 250μ L で 3 回洗浄する (vii) ペルオキシダーゼ用発色試薬を用いてビーズに捕捉された HRP 標識ストレプトアビジンの固定化量を 450nm の吸光度により測定

28 アフィニティビーズ製品一覧表キット内容アフィニティヒース本体タンパク固定化用緩衝液不活性化用緩衝液プロトコル 10mm 品番品名希望小売価格 ( 税別 ) BS-X9905 アフィニティビーズ 50mg ( お試し用 ) 9,000 円 BS-X9908 アフィニティビーズ 500mg 85,000 円

29 ご不明な点ご要望などございましたら何なりとお問い合わせ下さいお問い合わせ先住友ベークライト株式会社 S-バイオ事業部マーケティング営業部担当 : 五十嵐 s-bio@sumibe.co.jp TEL :

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PowerPoint プレゼンテーション ELISA 用プレート ( フロッキンクレスタイフ ) ( 旧称 :New ELISA plate) 住友ベークライト株式会社 S- バイオ事業部 - 1 - ELISA 用プレート ( フロッキンクレスタイフ ) の特長当社独自の表面処理技術によりブロッキング操作なしで低いバックグランドを提供します血清などに含まれる種々タンパク質の非特異吸着を抑制します予めブロッキング処理がされている為