があるため一ヶ月以上の間隔をおいて単品投与することが基本であるそこで呼吸器疾患を引き起こすパラインフルエンザウイルスの感染防御抗原を発現する組み換えインフルエンザウイルスを作製することによりウイルス性呼吸器疾患に対する多価生ワクチンの開発を試みたインフルエンザウイルスのNAは感染防御にはそれ

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しょうじいさやま
5 years ago
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1 免疫難病感染症等の先進医療技術平成 13 年度採択研究代表者河岡義裕 ( 東京大学医科学研究所教授 ) インフルエンザウイルス感染過程の解明とその応用 1. 研究実施の概要インフルエンザウイルスの感染過程を細胞および個体レベルで明らかにし得られた結果をウイルス感染症克服に応用するためにインフルエンザウイルスの人工合成法を駆使して感染細胞におけるウイルス増殖ならびに感染動物における病原性発現機構の解明を行ったこれまでにインフルエンザウイルスの8 本のゲノムRNA 分節はそれぞれ選択的にウイルス粒子に取り込まれることそして各 RNA 分節のウイルス粒子への取り込みに必要な部分を明らかにしたこの結果を基にインフルエンザとパラインフルエンザウイルスの両方の防御抗原を発現するウイルスを作製しこの組み換えウイルスが多価ワクチンとして有効であることを実証したまたこれまでに知られているインフルエンザの流行のなかでもっとも多大な被害を及ぼしたスペイン風邪ウイルスの病原性発現にはウイルスのHA ( 赤血球凝集素 ) 遺伝子が重要であることを解明したさらにエボラウイルスの粒子形成に関わるウイルス蛋白質の役割についても明らかにした 2. 研究実施内容 I. インフルエンザウイルスゲノムのパッケージングシグナルの知見に基づく新規ワクチンの開発一度に複数の感染症に対する免疫を付加させる混合ならびに多価ワクチンの需要は高い現在利用されている混合多価ワクチンならびに同時投与が可能なワクチンはいくつかあるが MMR ( 三種混合ワクチン ; はしか風疹おたふく風邪 ) を除いては不活化ワクチンの組み合わせが主である多くのウイルス感染症において自然感染に倣って投与される生ワクチンが不活化ワクチンよりも効果的で図 1. インフルエンザウイルスのNAの翻あるが弱毒生ワクチンではウイルス同士訳領域をセンダイウイルスのHNの翻訳領の干渉作用によって免疫が誘導されないこと域に置き換えた組み換えウイルス

2 があるため一ヶ月以上の間隔をおいて単品投与することが基本であるそこで呼吸器疾患を引き起こすパラインフルエンザウイルスの感染防御抗原を発現する組み換えインフルエンザウイルスを作製することによりウイルス性呼吸器疾患に対する多価生ワクチンの開発を試みたインフルエンザウイルスのNAは感染防御にはそれほど重要ではないので NA 遺伝子の翻訳領域をパラインフルエンザ ( センダイウイルス ) の感染防御抗原であるHN 蛋白質遺伝子に置き換えた組み換えインフルエンザウイルスを作製した ( 図 1) このとき HN 遺伝子を持つ分節がウイルス粒子に取り込まれるようNA 分節のパッケージングシグナルをこの組み換えHN 分節に導入した作製した組み換えウイルスは通常のインフルエンザウイルスと同様に発育鶏卵においてよく増殖し感染細胞においてインフルエンザウイルスのHA とパラミクソウイルスのHNの両抗原を発現したまた発育鶏卵で10 代継代を重ねても増殖効率に変化は見られず HAとHNの両抗原の発現も安定していたしかもマウスでは組み換えウイルスの基にしたインフルエンザウイルスが致死的なのに対して組み換えウイルスは弱毒化していたさらに組み換えウイルスを経鼻接種したマウスでは両ウイルスに対して有意な抗体価の上昇が見られたこれらのマウスを致死量のインフルエンザあるいはパラインフルエンザウイルスで攻撃したところいずれのウイルスに対しても 100% 生残したこれらの結果はこの組み換えウイルスが2つの異なるウイルス感染症に対して有効な弱毒生ワクチンであることを示しているこれまで様々なDNAならびにRNAウイルスがワクチンベクターとして検討されそのうちのいくつかは臨床応用もされているしかしこれらのベクターでは宿主のベクターに対する免疫応答がその繰り返し投与を制限するという欠点があるインフルエンザウイルスをベクターとする場合ベクターそのものに対する免疫応答も求められておりこれまでのベクターでは欠点とされていたことが長所となるまたインフルエンザ生ワクチンでは変異による病原性復帰が懸念されるが本研究で作出されたような外来遺伝子を組み込んだ生ワクチンにおいては数箇所の変異によって野生株に復帰することは考えがたくより安定した弱毒化に成功したといえる現行のインフルエンザ生ワクチンは弱毒 A 型インフルエンザウイルス2 株 (H1N1,H3N2) と弱毒 B 型インフルエンザウイルスを混合した多価ワクチンである本研究の組み換えウイルスのようにこれら3 株のNAをヒトパラインフルエンザタイプ1と3のHNならびに Respiratory Syncytial virusのgまたはfに置き換えることで呼吸器感染症混合多価ワクチンとすることも可能であろう II. スペイン風邪ウイルスの病原性発現機構 1918 年に世界的な大流行を起こしたスペイン風邪は世界中で2,000 万人以上の死者を出した当時はウイルスを分離培養する技術が確立されていなかったためその流行を引き起こしたインフルエンザウイルスは現存しないそのためなぜこのインフルエンザウイルスが通常の流行とは異なりこれほどの大流行を引き起こしたのかその実態は謎であったしかし最近当時亡くなった患者の肺病理検体および永久凍土に埋葬された

遺体からインフルエンザウイルス遺伝子が抽出されその塩基配列の一部が決定されたそこでリバースジェネティクスを用いて HAとNA 遺伝子がスペイン風邪由来その他の遺伝子が現在ヒトで流行しているインフルエンザウイルス由来の人工ウイルスを作製しその病原性をマウスで調べたその結果現在ヒトで流行しているインフルエンザウイルスは 10 7 感染価を接種してもマウスは死亡しなかったが

3 遺体からインフルエンザウイルス遺伝子が抽出されその塩基配列の一部が決定されたそこでリバースジェネティクスを用いて HAとNA 遺伝子がスペイン風邪由来その他の遺伝子が現在ヒトで流行しているインフルエンザウイルス由来の人工ウイルスを作製しその病原性をマウスで調べたその結果現在ヒトで流行しているインフルエンザウイルスは 10 7 感染価を接種してもマウスは死亡しなかったが HAとNAがスペイン風邪由来のウイルスに感染したマウスは死亡したそのLD 50 図 2. HAのみスペイン風邪由来のインフルエンザウイルス (50% 致死量 ) は10 5 感染価であに感染したマウスの肺の病理所見好中球を含む炎症性ったさらに現在ヒトで流細胞の浸潤と強い出血病原が見られる行しているウイルスに感染したマウスの肺ではウイルス感染細胞がごく一部散見されるだけでほとんど病変は見られなかったが HAとNAがスペイン風邪由来のウイルスに感染したマウスでは肺胞全体に感染が広がっており脈間周囲組織への強い好中球浸潤が見られたこれに伴って肺胞組織の崩壊が見られ強い出血病変が観察されたスペイン風邪の流行時急性肺出血を起こす例が急性症状の特徴のひとつとして報告されているまた HAのみスペイン風邪由来のウイルスもHAとNAがスペイン風邪由来のウイルスと同様の病原性を示したことから ( 図 2) スペイン風邪ウイルスのHAがその病原性発現に重要な役割を示していることが明らかになった III. エボラウイルスの粒子形成エボラウイルスはヒトやその他の霊長類に出血熱を引き起こすその致死率は極めて高く時には90% 近くに達するこのウイルスに対する効果的な予防治療法は開発段階であり実用化されているものはないそこで本ウイルスの増殖過程を明らかにするためにウイルス粒子形成のメカニズムを解析したまずウイルスのヌクレオキャプシドがどのように形成されるかを個々のウイルス蛋白質をさまざまな組み合わせで発現して解析したところ NPだけでらせん状の構造物を形成しそれにVP24とVP35という2 種類の蛋白質を発現するとNPのらせん状構造物の集塊の周辺からヌクレオキャプシドが形成されてくることがわかった感染性粒子が産生されるためにはヌクレオキャプシドがウイルス粒子に取り込まれなければならないがそのためにはヌクレオキャプシドは形質膜下に運ばれなければならないこの輸送に関与するウイルス蛋白質を同定するために種々のウイルス蛋白質をさまざまな組み合わせで発現させたその結果マトリクス蛋白質であるVP40を発現するだけでヌクレオキャプシドは形質膜直下に輸送されることがわかった

4 次にヌクレオキャプシドが取り込まれるウイルスの殻がどのようにして出来るかについて調べたその結果 VP40 蛋白質とウイルスのスパイク蛋白質であるGPを発現することによりエボラウイルスそっくりの粒子が形成されることがわかったしかもヌクレオキャプシド合成に必要なウイルス蛋白質とVP40ならびにGPを同時に発現させるとヌクレオキャプシドを取り込んだウイルス様粒子が産生されることがわかったすなわちヌクレオキャプシドを持ちしかもエボラウイルスに特徴的なひも状の粒子を形成するのには以上 5 種類の蛋白質が必要かつ十分であることがわかった尚エボラウイルスそのものを使った研究は日本には稼働中のP4 施設がないためカナダ科学研究所のクループとの共同実験として行った 3. 研究実施体制ウイルス解析開発グループ 1 研究分担グループ長河岡義裕 ( 東京大学医科学研究所教授 ) 2 研究項目 : 1. インフルエンザウイルス粒子形成に重要なウイルス構成物質間および宿主遺伝子産物とのインターラクションの解明 2. インフルエンザウイルスのワクチンベクターへの応用 3. 強毒インフルエンザウイルスの病原性 4. エボラウイルスの増殖過程と病原性の解明 1 研究分担グループ長 Heinz Feldmann( カナダ科学研究所 ) 2 研究項目 : 強毒インフルエンザウイルスおよびエボラウイルスの増殖過程の解析 4. 主な研究成果の発表 ( 論文発表および特許出願 ) (1) 論文 ( 原著論文 ) 発表 Iwatsuki-Horimoto K, Horimoto T, Fujii Y, Kawaoka Y. Generation of influenza A virus NS2(NEP) mutants with an altered nuclear export signal sequence. J Virol 78: , Barman S, Adhikary L, Chakrabarti AK, Bernas C, Kawaoka Y, Nayak DP. Role of transmembrane domain and cytoplasmic tail amino acid sequences of influenza A virus neuraminidase in raft association and virus budding. J Virol 78: , Horimoto H, Fukuda N, Iwatsuki-Horimoto K, Guan Y, Lim W, Peiris M, Sugii S, Odagiri T, Tashiro M, Kawaoka Y. Antigenic Differences between H5N1 Human influenza viruses isolated in 1997 and J Vet Sci

5 66: , Horimoto T, Takada A, Iwatsuki-Horimoto K, Kawaoka Y. A protective immune response in mice to viral components other than hemagglutinin in a live influenza A virus vaccine model. Vaccine 22: , Hatta M, Goto H, Kawaoka Y. Influenza B virus requires BM2 protein for replication. J Virol 78: , Shinya K, Fujii Y, Ito H, Ito T, Kawaoka Y. Characterization of a neuraminidase-deficient influenza A virus as a potential gene delivery vector and a live vaccine. J Virol 78: , Shinya K, Hamm S, Hatta M, Ito H, Ito T, Kawaoka Y. PB2 amino acid at position 627 affects replicative efficiency, but not cell tropism, of Hong Kong H5N1 influenza A viruses in mice. Virology 320: , Horimoto T, Iwatsuki-Horimoto K, Hatta M, Kawaoka Y. Influenza A viruses possessing type B hemagglutinin and neuraminidase: potential as vaccine components. Microbes and Infection 6: , 2004 Iwatsuki-Horimoto K, Kanazawa R, Sugii S, Kawaoka Y, Horimoto T. The index influenza A virus subtype H5N1 isolated from a human in 1997 differs in its receptor binding properties from a virulent avian influenza virus. J Gen Virol 85: , Takada A, Fujioka K, Tsuiji M, Morikawa A, Higashi N, Ebihara H, Kobasa D, Feldmann H, Irimura T, Kawaoka Y. A Human macrophage C-type lectin specific for galactose and N-acetylgalactosamine promotes filovirus entry. J Virol 78: , Maeda Y, Goto H, Horimoto T, Takada A, Kawaoka Y. Biological significance of the U residue at the -3 position of the mrna sequences of influenza A viral segments PB1 and NA. Virus Res 100: , Kondo T, McGregor M, Chu O, Chen D, Horimoto T, Kawaoka Y. Protective effect of epidermal powder immunization in a mouse model of equine herpesvirus-1 infection. Virology 318: , Garulli B, Kawaoka Y, Castrucci MR. Mucosal and systemic immune responses to a human immunodeficiency virus type 1 epitope induced upon vaginal infection with a recombinant influenza A virus. J Virol 78: , Watanabe S, Watanabe T, Noda T, Takada A, Feldmann H, Jasenosky LD, Kawaoka Y. Production of novel Ebola virus-like particles from cdnas: an alternative to Ebola virus generation by reverse genetics. J Virol 78: , 2004.

6 Kiso M, Mitamura K, Sakai-Tagawa Y, Shiraishi K, Kawakami C, Kimura K, Hayden FG, Sugaya N, Kawaoka Y. Resistant influenza A viruses in children treated with oseltamivir: descriptive study. Lancet 364: , Kobasa D, Takada A, Shinya K, Hatta M, Halfmann P, Theriault S, Suzuki H, Nishimura H, Mitamura K, Sugaya N, Usui T, Murata T, Maeda Y, Watanabe S, Suresh M, Suzuki T, Suzuki Y, Feldmann H, Kawaoka Y. Enhanced virulence of influenza A viruses with the haemagglutinin of the 1918 pandemic virus. Nature 431: , Fujii K, Fujii Y, Noda T, Muramoto Y, Watanabe T, Takada A, Goto H, Horimoto T, Kawaoka Y. The Importance of Both the coding and segmentspecific noncoding regions of the influenza A virus NS segment for its efficient incorporation into virions. J Virol 79: , (2) 特許出願 H16 年度特許出願件数 :0 件 (CREST 研究期間累積件数 :1 件 )

詳細を明らかにするとともにウイルスの病原性に関する研究もアジアで流行中のH5N1 鳥インフルエンザウイルスならびにその他のウイルスについても展開する予定であるインフルエンザウイルスゲノムのパッケージングシグナルの知見に基づくインフルエンザワクチンならびにワクチンベクターの開発 1. 次世代

詳細を明らかにするとともにウイルスの病原性に関する研究もアジアで流行中のH5N1 鳥インフルエンザウイルスならびにその他のウイルスについても展開する予定であるインフルエンザウイルスゲノムのパッケージングシグナルの知見に基づくインフルエンザワクチンならびにワクチンベクターの開発 1. 次世代免疫難病感染症等の先進医療技術平成 13 年度採択研究代表者河岡義裕 ( 東京大学医科学研究所教授 ) インフルエンザウイルスの感染過程の解明とその応用 1. 研究実施の概要インフルエンザウイルスを構成する個々の蛋白質の性状ならびに機能についてはかなり詳細な知識が集積しているこのような基礎研究の進展にもかかわらずそれが必ずしもウイルス病原性の根本的な理解や効果的な予防治療方法につながっていない