機能ゲノム学（第6回）

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えつみあきくぼ
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1 トランスクリプトーム解析の今昔なぜマイクロアレイ? なぜRNA-Seq? 東京大学大学院農学生命科学研究科アグリバイオインフォマティクス教育研究ユニット門田幸二 ( かどたこうじ ) kadota@iu.a.u-tokyo.ac.jp 1

2 Contents トランスクリプトーム解析の概要各手法の長所短所マイクロアレイ RNA-Seq RT-PCR や SAGE 実データの比較 (RNA-Seq vs. マイクロアレイ ) RNA-Seq データの正規化 ( の基礎 ) マイクロアレイと異なる点 ( 遺伝子の配列長による結果の偏り ) 基本的な考え (RPKM) ねらい各種トランスクリプトーム解析手法の長所短所を理解しその上でなぜ次世代シーケンサーによるトランスクリプトーム解析 (RNA-Seq) が有用かを理解する 2

3 トランスクリプトームとはある状態のあるサンプル ( 例 : 目 ) のあるゲノムの領域ヒト遺伝子全体 ( ゲノム ) どの染色体上のどの領域にどの遺伝子があるかは調べる個体 ( 例 : ヒト ) が同じなら不変 ( 目だろうが心臓だろうが ) 転写物全体 ( トランスクリプトーム ) 遺伝子 1 は沢山転写されている ( 発現している ) 遺伝子 4 はごくわずかしか転写されてない 3

4 トランスクリプトームとはある状態のあるサンプル ( 例 : 目 ) のあるゲノムの領域光刺激ヒト遺伝子全体 ( ゲノム ) どの染色体上のどの領域にどの遺伝子があるかは調べる個体 ( 例 : ヒト ) が同じなら不変 ( 目だろうが心臓だろうが ) 転写物全体 ( トランスクリプトーム ) 遺伝子 2 は光刺激に応答して発現亢進遺伝子 4 も光刺激に応答して発現亢進 4

5 トランスクリプトーム情報を得る手段光刺激前 (T1) の目のトランスクリプトームこれがいわゆる遺伝子発現行列光刺激後 (T2) の目のトランスクリプトームマイクロアレイ RNA-Seq SAGE 5

6 トランスクリプトーム取得 ( マイクロアレイ ) よく研究されている生き物は多数の遺伝子 ( の配列情報 ) がわかっている光刺激前 (T1) の目のトランスクリプトーム蛍光標識ハイブリダイゼーション ( 二本鎖形成 ) わかっている遺伝子 ( の配列の相補鎖 ) を搭載したチップメーカーによって搭載されている遺伝子の種類が異なる搭載されていない遺伝子 ( 未知遺伝子含む例 : 遺伝子 4) の発現情報は測定不可 6

7 マイクロアレイデータ遺伝子発現行列光刺激前 (T1) の目のトランスクリプトーム蛍光標識光刺激後 (T2) の目のトランスクリプトームハイブリダイゼーション ( 二本鎖形成 ) 専用の検出器で各遺伝子に対応する領域の蛍光シグナル強度を測定ハイブリダイゼーションとシグナル検出正規化 7

8 トランスクリプトーム取得 (RNA-Seq) 次世代シーケンサー (Illumina 社の場合 ) 光刺激前 (T1) の目のトランスクリプトーム配列決定ペアードエンド法断片配列の両末端が数百塩基以内の対の二種類の配列が得られる数百塩基程度に断片化シングルエンド法約塩基二種類のアダプター配列を両末端に付加シングルエンド法の場合アダプター 1 アダプター 2 数百塩基程度 8

9 RNA-Seq データ遺伝子発現行列 RNA-seq 光刺激前 (T1) の目のトランスクリプトームゲノム配列にマッピング - イメージ塩基程度からなる配列が沢山ある - 実際 - 数百万個の配列がありどの遺伝子に対応するか不明定量化 ( 例 : 生のリード数をカウント ) 正規化 ( 短い ) 配列を読んだものという意味で ( ショート ) リードなどと呼ばれる 9

10 RNA-Seq の長所新規 X の同定 X =exon, 遺伝子, T1 T2 X =exon X = 遺伝子 10

11 RNA-Seq の長所新規 X の同定 X = エクソン X = 遺伝子 T1 生リード数カウント正規化 T1 生リード数カウント正規化トランスクリプトーム ( 転写物の全体像 ) の理解への一番の近道よりよい遺伝子発現行列を得るための基礎情報充実に貢献 11

12 長所短所 :( 発現解析用 ) マイクロアレイ長所すでに診断用マイクロアレイが市販されているなど長年の実績お手軽各種データ解析ツールが豊富短所 ( プローブ搭載のために ) 解析対象の塩基配列情報を予め知っておく必要がある ( クローズドシステム ) プローブが搭載されていない遺伝子の発現レベルは測定不可能 ( 未知遺伝子も当然対象外 ) 主なユーザー主な解析対象が ( アノテーション情報が豊富な ) モデル生物で既知遺伝子のみでいいという研究者 12

13 長所短所 :RNA-Seq 長所 ( 未知遺伝子を含む ) トランスクリプトームの全体像を理解することが原理的に可能事前情報を必要としない ( オープンシステム ) ダイナミックレンジが広い短所データ解析が大変解析手法が確立されていない主なユーザー無制限 ( モデル生物非モデル生物を問わない ) ( お金持ち ) トランスクリプトーム数百塩基程度に断片化 sequencing 13

14 長所短所 :RT-PCR 長所?! このテクノロジーで得られた測定結果が最も信頼性が高いはず!( ゴールドスタンダード ) と多くの biologist が思っている短所用いたプライマー次第で結果が変わる Low-throughput(RT-PCR でのトランスクリプトーム解析は事実上不可能 ) 主なユーザー ( 論文を通すために ) マイクロアレイ ( や RNA-Seq) 解析を行った結果得られた候補遺伝子群のうちのいくつかの発現を確認しておこうと思った研究者 14

Velculescu et al., Science, 270:484-487, 1995 SAGE Serial Analysis of Gene Expression の略 mrna の 3 末端に近い数十塩基を SAGE タグとして配列決定様々な改良版 21bp 読めるLongSAGE (Saha et al., Nature Biotechnol.

15 Velculescu et al., Science, 270: , 1995 SAGE Serial Analysis of Gene Expression の略 mrna の 3 末端に近い数十塩基を SAGE タグとして配列決定様々な改良版 21bp 読めるLongSAGE (Saha et al., Nature Biotechnol., 2002) 26bp 読めるSuperSAGE (Matsumura et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003) 5 -end SAGE (Hashimoto et al., Nature Biotechnol., 2004) 約 37bp (ditagとして) 読めるDeepSAGE (Nielsen et al., Nucleic Acids Res., 2006) NGS 用 SuperSAGE (HT-SuperSAGE; Matsumura et al., PLoS One, 2010) 15

16 長所短所 :SAGE(RNA-Seq との対比 ) 長所 ( 転写物の一部に特化しているので原理的に ) ダイナミックレンジが広いリード長がほぼ一定のため RNA-Seq で問題となる解析結果の配列長依存性 (gene length-related bias) とは無縁 ( 後述 ) 短所 ( 転写物の一部に特化しているが故に原理的には ) トランスクリプトームの全体像の理解は不可能 ( 例 : 選択的スプライシング ) ( 制限酵素で切断しているので ) 制限酵素認識部位 (NlaIII など ) を持たない転写物の測定は困難主なユーザー上記の長所を重要視する研究者 16

17 実データの比較 (RNA-Seq vs. マイクロアレイ ) Human embryonic kidney (HEK) 293T cells( と B cells) マイクロアレイ :Illumina HumanRef8 V2.0 BeadChips RNA-Seq: Illumina 1G Genome Analyzer 27 bp 約 864 万リード Sultan et al., Science, 321: , 2008 TCGGTAAGTGACAATGTTCCAGTCCAT chr1 chr2 縮小表示約 464 万リードがゲノム配列上のどこか一ヵ所のみにマップされる (Reads with unique matches) 17

18 Sultan et al., Science, 321: , 2008 実データの比較 (RNA-Seq vs. マイクロアレイ ) Human embryonic kidney (HEK) 293T cells( と B cells) マイクロアレイ :Illumina HumanRef8 V2.0 BeadChips RNA-Seq: Illumina 1G Genome Analyzer 27 bp 約 864 万リード TCGGTAAGTGACAATGTTCCAGTCCAT 縮小表示ゲノムにマップされた約 464 万リード中 371 万リードが既知 exon 上にマップされる chr1 chr2 既知エクソン領域以外にマップされたものは新規 exonの可能性! 大抵のマイクロアレイとの比較はアレイ上に搭載されている既知遺伝子についてのみ! 18

19 実データの比較 (RNA-Seq vs. マイクロアレイ ) マイクロアレイ上に搭載されている 13,118 遺伝子について発現しているとされた遺伝子数の比較閾値緩め ( 1 read) の場合 Sultan et al., Science, 321: , 2008 の Fig. 2A 遺伝子 1 遺伝子 2 遺伝子 3 発現してるしてるしてる閾値厳しめ ( 5 read) の場合遺伝子 1 遺伝子 2 遺伝子 3 ( 発現してる ) ( してない ) ( してない ) RNA-seq でのみ発現している遺伝子数 >> マイクロアレイでのみ 19

20 実データの比較 (RNA-Seq vs. マイクロアレイ ) HEK cells versus B cells の log ratio 分布の比較 7,043 genes Sultan et al., Science, 321: , 2008 の Fig. 2C 全体として高発現側の遺伝子群の発現レベルは似ている 20

21 他の比較結果 (RNA-Seq vs. マイクロアレイ ) log ratio 分布の比較 ( 横軸 :RNA-Seq, 縦軸 : マイクロアレイ ) Mane et al., BMC Genomics, 2009 の Suppl. Fig. の下半分どの報告結果もだいたいこんな感じです Griffith et al., Nat Methods, 2010 の Suppl. Fig. 9b(A) 21

22 他の比較結果 (RNA-Seq vs. マイクロアレイ ) 発現量レベルの比較 Liver サンプルの RNA-Seq データ vs. マイクロアレイデータ Mortazavi et al., Nat Methods, 2008 の Fig. 3c RPKM? 22

23 マイクロアレイデータの正規化各サンプルから測定されたシグナル強度の和は一定と仮定チップ上の遺伝子数が少ない場合は非現実的だが数千 ~ 数万種類の遺伝子が搭載されているので妥当 ( だろう ) グローバル正規化背景 : サンプル (or chip) ごとにシグナル強度の総和は異なる対策 : 総和が任意の値 ( 例では 100) になるような正規化係数を掛ける例 :sample1 の正規化係数 = 100 /

24 RNA-Seq データの正規化 ( の一部 ) 各サンプルから sequence された総リード数は一定と仮定 T1 RPM 正規化 Reads Per Million mapped reads(rpm) 正規化後の総リード数が 100 万 (one million) になるように補正例 :T1 の正規化係数 = / 67 24

25 Mortazavi et al., Nature Methods, 5: , 2008 配列長の補正配列長が長い遺伝子ほど沢山 sequence されるそれらの遺伝子上にマップされる生のリード数が増加傾向配列長が長い遺伝子ほど発現レベルが高い傾向になる発現レベルが同じで長さの異なる二つの mrnas 断片化して sequence マップされたリード数をカウント一つのサンプル内での異なる遺伝子間の発現レベルの高低を ( 配列長を考慮せずに ) 比較することはできない 25

26 配列長の補正前提条件 : 配列長が既知補正の基本戦略 : 配列長で割る Mortazavi et al., Nature Methods, 5: , / 配列長を掛ける場合塩基あたりの平均のリード数を計算しているのと等価 1000 / 配列長を掛ける場合その遺伝子の配列長が1000bpだったときのリード数と等価 Reads Per Kilobase (of exon) 26

サンプルごとにマップされた総リード ( 塩基配列 ) 数が異なる各遺伝子のマップされたリード数を総 read 数が100 万 (one million) だった場合に補正 raw

27 RPKM Mortazavi et al., Nature Methods, 5: , 2008 RPM 正規化 ( マイクロアレイなどと同じところ ) Reads per million mapped reads サンプルごとにマップされた総リード ( 塩基配列 ) 数が異なる各遺伝子のマップされたリード数を総 read 数が100 万 (one million) だった場合に補正 raw counts:all reads= RPM : 1,000,000 A1BGの場合は 744 : 5,087,097 = RPM : 1,000,000 1,000,000 1,000,000 RPM raw counts all reads 5,087,097 RPKM 正規化 (RNA-Seq 特有 ) Reads per kilobase of exon per million mapped reads 遺伝子の配列長が長いほど配列決定 (sequence) される確率が上昇各遺伝子の配列長を 1000 塩基 (one kilobase) の長さだった場合に補正 RPKM 1,000,000 1,000 raw counts all reads gene length 1,000,000,000 raw counts gene length all reads RPM 27

28 解析結果が配列長依存という問題二群間比較など発現変動遺伝子 (DEG) 検出が目的の場合 ( いわゆる発現比でランキングする方法以外の ) 統計的方法を用いると配列長の長いものほど DEG と判定される確率が上昇してしまう Oshlack and Wakefield, Biology Direct, 4:14, 2009 の Fig 1 理由 : 長い遺伝子ほどバラツキが小さくなる傾向 28

29 正規化後の RNA-Seq データマイクロアレイデータと同様の解析が可能クラスタリング似た発現パターンを持つ遺伝子やサンプルの同定発現変動遺伝子二群間比較組織特異的遺伝子など GSEA 解析 ( どの遺伝子セットが動いているか ) Gene Ontology 解析パスウェイ解析など解析の基本的なイメージはマイクロアレイと同じです 29

30 なぜ RNA-Seq? マイクロアレイに搭載されていない転写物も解析可能転写物全体の配列情報を取得可能 (RefSeqのようなmulti-fasta 形式のファイルをゲットできるイメージ ) 選択的スプライシングの全体像の理解発現変動 exon の同定モデル生物 : より詳細なレベルでの理解非モデル生物 :( まずは ) 全体像の把握 exon mrna1 mrna2 mrna3 pre-mrna RNA-Seq 発現解析用アレイタイリングアレイ exon アレイ SAGE 30

機能ゲノム学（第6回）

機能ゲノム学（第6回） RNA-Seqデータ解析における正規化法の選択 :RPKM 値でサンプル間比較は危険?! 東京大学大学院農学生命科学研究科アグリバイオインフォマティクス教育研究ユニット門田幸二 ( かどたこうじ ) http://www.iu.a.u-tokyo.ac.jp/~kadota/ kadota@iu.a.u-tokyo.ac.jp 1 よりよい正規化法とは? その正規化法によって得られたデータを用いて発現変動の度合いでランキングしたときに