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おきまさやまがた
5 years ago
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1 基礎から学ぶ固相抽出 (SPE) カラムの基礎とあなたの日々の作業に役立つ弊社独自のノウハウを伝授シグマアルドリッチジャパン合同会社ライフサイエンスアプライド事業部アナリティカルテスティング営業部佐々木豊 JASIS2017 新技術説明会 A 年 9 月 8 日 ( 金 ) 12:15~13:05

2 本日の内容固相抽出とは? 1 2 固相抽出の目的特長目的物質充填剤溶媒の三角関係コンディショニングの目的 3 4 コンディショニングの重要性チャネリングの予防充填剤間フリッツの気泡除去充填剤の活性化固相抽出カラムの使用方法様々なカラム形状サンプルマトリクスからの充填剤選択各充填剤の選択と使用方法分散型固相抽出について自然落下を快適に行うテクニック通液速度と回収率の関係様々な溶出方法ディスポーサブルライナーの活用

3 1. 固相抽出とは? 固相抽出の目的特長液液抽出有機溶媒を大量に使用操作が煩雑で時間がかかる固相抽出簡単迅速に前処理マトリクス目的物質膨大な量のマトリクスに含まれる微量な分析対象物を測定するため機器分析の前に前処理という工程が必要 3

4 1. 固相抽出とは? 固相抽出の目的特長マトリクス目的物質マトリクス ( 妨害物質 ) を除去し精製するマトリクスを保持させ除去する 4

5 1. 固相抽出とは? 固相抽出の目的特長マトリクス目的物質分析に適した濃度に濃縮する目的物質を保持させ溶出する 5

6 1. 固相抽出とは? 目的物質充填剤溶媒の三角関係化学構造分子量目的物質疎水性親水性イオン性配位性充填剤の種類充填剤量充填剤溶媒有機溶媒組成バッファー ph 6

7 1. 固相抽出とは? 目的物質充填剤溶媒の三角関係目的物質の極性高い ( 親水性 ) 低い ( 疎水性 ) 充填剤の適用範囲と使用する溶媒カーボン系充填剤 < 保持が強く溶出が困難 > 水メタノールアセトニトリルアセトントルエンヘキサン C18 C8 系充填剤水メタノールアセトニトリルポリマー系充填剤水メタノールアセトニトリル 7 イオン交換系充填剤水溶液 ( バッファー ) シリカゲル充填剤ヘキサンジクロロメタン

8 本日の内容固相抽出とは? 1 2 固相抽出の目的特長目的物質充填剤溶媒の三角関係コンディショニングの目的 3 4 コンディショニングの重要性チャネリングの予防充填剤間フリッツの気泡除去充填剤の活性化固相抽出カラムの使用方法様々なカラム形状サンプルマトリクスからの充填剤選択各充填剤の選択と使用方法分散型固相抽出について自然落下を快適に行うテクニック通液速度と回収率の関係様々な溶出方法ディスポーサブルライナーの活用

9 2. 固相抽出カラムの使用方法様々なカラム形状シリンジ型リバーシブル型 96well プレートディスク型最も汎用な形状カラムがサンプルや溶媒のリザーバーになり操作が簡単通液方向とは逆方向から溶出が可能複数のカートリッジの連結が容易 96サンプルを迅速処理自動化システムに対応大容量サンプルに対し迅速処理が可能ポリプロピレン製とガラス製を用意

10 2. 固相抽出カラムの使用方法サンプルマトリクスからの充填剤選択サンプルマトリクスサンプルは何に溶解しているか? 水溶液有機溶媒非 ~ 中極性化合物イオン性化合物中 ~ 高極性化合物吸着逆相アニオンカチオン順相吸着 10 C18 C8 Phenyl ST/DVB Poly Amide HLB ENVI TM -Carb Carboxen ST/DVB NH 2 PSA SAX SCX WCX MCAX CN NH 2 PSA Si DIOL Florisil Alumina ENVI-Carb Carboxen ST/DVB

11 2. 固相抽出カラムの使用方法 C18, C8, Phenyl, HLB など ( 逆相モード ) 1 サンプル調製 2 コンディショニング 3 サンプルロード水溶液バッファー溶液で調製 ( 有機溶媒を 10% 以下にする ) 酸性化合物は ph3~4 中性化合物は ph6~7 塩基性化合物は ph7~9 に調整粘性のあるサンプルは 1:1 か 1:2 の割合でバッファー溶液で希釈再現性や回収率に関わる重要な作業この後詳しくメタノールやアセトニトリルのような水混和性溶媒をカラムサイズの 1~2 倍量を通液サンプル溶液が水の場合は溶媒通液後に水を通液させる通液速度を 1 秒間に 1 2 滴の一定速度に保つ 4 洗浄 5 溶出 5~20% の溶媒やバッファー溶液通液速度は液滴がつながらない程度メタノールやアセトニトリルのような水混和性溶媒カラムサイズの1~2 倍量を 1 秒間に1,2 滴の速度で通液イオン性化合物の場合 ph 調整で回収率が改善

12 2. 固相抽出カラムの使用方法シリカゲル, フロリジル, アルミナなど ( 順相モード ) 1 サンプル調製 2 コンディショニング非極性溶媒 ( ヘキサンジクロロメタンなど ) で抽出希釈サンプル溶液中に水分が残存すると保持が弱くなるため硫酸 Na や硫酸 Mg で乾燥させるサンプルと同じ溶媒もしくは非極性溶媒をカラムサイズの 2~3 倍量を通液固相カラムに付着した水分も影響この後詳しく! 3 サンプルロード通液速度を 1 秒間に 1 2 滴の一定速度に保つ 4 洗浄 5 溶出サンプルと同じ溶媒もしくは非極性溶媒通液速度は液滴がつながらない程度アセトンメタノール IPA アセトニトリルのような溶媒カラムサイズの1~2 倍量を通液分画を取る時は徐々に溶媒の極性を高めていく

13 2. 固相抽出カラムの使用方法 SAX, NH2, SCX, WCX など ( イオン交換モード ) 1 サンプル調製サンプル溶液をバッファー溶液で 1:1 に希釈し目的物質がイオン化するよう ph を調整塩基性化合物は ph3~6 のバッファー溶液を 10~25mM 用いる酸性化合物は ph7~9 のバッファー溶液を 10~50mM 用いる 2コンディショニング 3サンプルロード 4 洗浄 5 溶出メタノールやアセトニトリルをカラムサイズの 1~2 倍量通液サンプル調製で用いたバッファー溶液と同一の ph と塩濃度を持つバッファー溶液で充填剤固定相をイオン化させる通液速度を 1 秒間に 1 滴以下の一定速度に保つサンプル調製で使用したような ph を持つバッファー溶液通液メタノールアセトニトリル水溶液通液速度は液滴がつながらない程度塩基性化合物は 2~5% 水酸化アンモニウム /50~100% メタノール溶液酸性化合物は 2~5% 酢酸 /50~100% メタノール溶液強イオン性化合物は 1M 以上の高塩濃度溶液またはより選択性の高い対イオンの投入

: 複雑な操作なし Cheap 安価 : 高額な機器は不要使用する消耗品はいずれも安価 Effective 効果的 :

14 2. 固相抽出カラムの使用方法分散型固相抽出について QuEChERS( キャッチャーズ ) とは? 抽出用の塩類や精製用の充填剤をサンプルと共に振盪し遠心分離する前処理方法 Quick 迅速 : 前処理に必要な時間は約 10 分 Easy 簡単 : 複雑な操作なし Cheap 安価 : 高額な機器は不要使用する消耗品はいずれも安価 Effective 効果的 : サンプル量が少量で使用可能 Rugged 堅牢 : 多検体ルーチン分析を行うのに十分な方法 Safe 安全 : 有害な化学物質や塩素系溶媒は不使用 1サンプルの溶媒の使用量は約 10~12mL と少量なため安全 14

15 2. 固相抽出カラムの使用方法分散型固相抽出について苺の残留農薬分析抽出工程サンプルを凍らせドライアイスと共にホモジナイズしたものを秤量しアセトニトリルを添加振盪する抽出用塩類の充填剤を加えて振盪し遠心分離をする 15

16 2. 固相抽出カラムの使用方法分散型固相抽出について苺の残留農薬分析精製工程遠心分離後上澄みを分取し精製用充填剤を加え振盪する遠心分離後上澄みを分取し試験溶液に調製する 16

17 2. 固相抽出カラムの使用方法分散型固相抽出について製品ラインアップ 17

18 本日の内容固相抽出とは? 1 2 固相抽出の目的特長目的物質充填剤溶媒の三角関係コンディショニングの目的 3 4 コンディショニングの重要性チャネリングの予防充填剤間フリッツの気泡除去充填剤の活性化固相抽出カラムの使用方法様々なカラム形状サンプルマトリクスからの充填剤選択各充填剤の選択と使用方法分散型固相抽出について自然落下を快適に行うテクニック通液速度と回収率の関係様々な溶出方法ディスポーサブルライナーの活用

19 3. コンディショニングの目的コンディショニングの重要性固相抽出カラムの性能を最大限に発揮するには? コンディショニングをしっかりと行うことが大切カラムの洗浄チャネリングの予防充填剤間フリッツの気泡を抜く充填剤 ( 順相系 ) の活性化ブランク低減充填剤と溶媒をしっかり接触させる通液速度の安定化保持挙動の安定化 19

20 3. コンディショニングの目的チャネリングの予防使用した固相抽出カラム :C18 1g/6mL 左 : コンディショニング無し右 : アセトニトリル 5mL 水 5mL 2 回でコンディショニングサンプル : アズレンスルホン酸ナトリウム水溶液 40mg/mL を 2 滴 ( うがい薬 ) を添加チャネリングコンデイショニング無しコンデイショニング有り洗浄 : 水 5mL サンプルが均一なバンドを形成しないと適切なクロマトグラフィーが行えない 20

21 3. コンディショニングの目的充填剤間フリッツの気泡除去カーボン系の固相抽出カラムにヘキサンを流した通液速度 0.9mL/min 気泡が存在したので除去した通液速度 2.3mL/min 気泡の存在で通液速度が大幅に異なったこの実験ではカラム出口付近に気泡があったため除去できたが充填剤間やフリッツ中の気泡に対してどう対処するか? 気泡気泡の除去により通液速度は約 2.5 倍に上昇 21

22 3. コンディショニングの目的充填剤間フリッツの気泡除去気泡を除去して通液速度を安定化させる固相抽出カラムごとの通液速度のバラツキを無くす充填剤と溶媒サンプルの接触効率を向上させ負荷量を最大化するユニークな気泡の除去方法をご紹介しますバキュームマニホールドが使用できる環境をご用意ください 22

23 3. コンディショニングの目的充填剤間フリッツの気泡除去 1 必要な本数の固相抽出カラムをバキュームマニホールドの付属ラックにセットする 2 コンディショニング溶媒を固相抽出カラムに入れる 23

24 3. コンディショニングの目的充填剤間フリッツの気泡除去 3 付属ラックごと真空槽に入れる 4 減圧する 24

25 3. コンディショニングの目的充填剤間フリッツの気泡除去 5 減圧するおよそ 30 秒 ~1 分間細かい気泡が上昇下部からも気泡が抜ける充填剤とフリッツ中の気泡がほぼ完全に除去できる 25

自然落下による通液速度比較アセトニトリル 5mL 通液時間コンディショニング方法

26 3. コンディショニングの目的充填剤間フリッツの気泡除去各コンディショニング方法による比較使用した固相抽出カラム :C18 1g/6mL 5mL アセトニトリルを用い 3 つの方法でコンディショニングした後 5mL アセトニトリルを自然落下で通液させその時間を測定 A B C 26 自然落下による通液速度比較アセトニトリル 5mL 通液時間コンディショニング方法 Tube#1 Tube#2 A: マニホールド気泡除去 4m19s 4m17s B: 吸引法 3m51s 5m02s C: 加圧法 4m47s 5m06s 均一であるばらつきがある

27 3. コンディショニングの目的充填剤の活性化使用した固相抽出カラム : シリカゲル 1g/6mL( 同一ロットで保管条件が異なる 2 本を比較 ) ヘキサン 3mL ヘキサン 3mL 追加コンディショニング : n- ヘキサン 3mL サンプル : 200µL アズレン 2mg/mL ヘキサン溶液溶出 :n- ヘキサン 3mL 2 回順相系充填剤では活性度の違いが保持挙動に表れやすい 27

28 3. コンディショニングの目的充填剤の活性化一般的な順相系固相抽出のコンディショニングヘキサン水順相系充填剤はヘキサンを通液させても水分は残存し活性度は上がらない 28

29 3. コンディショニングの目的充填剤の活性化順相系固相抽出カラム ( シリカアルミナフロリジルなど ) の活性度を高く一定にするには? 従来法充填剤を 130 のオーブンで一晩乾燥させるカートリッジ充填されているカラムは加熱不可能充填剤のみを乾燥させて使用前にカートリッジへ充填する代替案アセトン通液後ヘキサンで平衡化する第 21 回農薬残留分析研究会 1998 年シリカゲルカラムの前処理効果 ( 財団法人残留農薬研究所杉本島村小林加藤 ) でも一定した活性度と固相抽出由来の妨害物質の低減化が可能との報告あり 29

30 3. コンディショニングの目的充填剤の活性化改良した順相系固相抽出のコンディショニングアセトンヘキサン水アセトンで水を除去することで活性度を高く一定にする 30

31 3. コンディショニングの目的充填剤の活性化アセトン洗浄によるカラム中の水分除去水分測定アセトンを流し溶出液を分画捕集した溶出液中の水分量を Karl Fisher 水分測定装置 ( 電量法 ) で測定 Mositure Content (ppm) in eluate 100,000 90,000 80,000 70,000 60,000 50,000 40,000 30,000 20,000 10,000 Ag ION 750mg/6mL Alumina N 2g/6mL DSC-NH2 1g/6mL DSC-SAX 1g/6mL DSC-SCX 1g/6mL PSA 1g/6mL LC-Florisil/LC-Si = 1g/1g/6mL Acetone Volume (ml) 31

32 3. コンディショニングの目的充填剤の活性化アセトンからヘキサンへの平衡化アセトン - ヘキサン平衡化アセトン洗浄後ヘキサンを流しその溶出液を分画捕集した溶出液中のアセトン含有量を HPLC-UV で測定 900,000 Peak area of acetone in eluate 800, , , , , , ,000 Ag ION 750mg/6mL Alumina N 2g/6mL DSC-NH2 1g/6mL DSC-SAX 1g/6mL DSC-SCX 1g/6mL PSA 1g/6mL 100, Hexane Voume (ml)

33 3. コンディショニングの目的充填剤の活性化使用した固相抽出カラム :Alumina N 1g/6mL PCB 異性体 20 成分を分画 Tube#1 と Tube#2 は同一ロットで保管状況が異なる Elution % 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% Oil #155 #188 #202 #209 #208 #206 #194 #189 #104 #30 #54 #10 #1 Biphenyl #3 #169 #126 #77 #37 #15 Tube#1 ヘキサンコンディショニングのみ Elution % 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% Supelclean LC-Alumina-N 1g/6mL without acetone washing #208 #206 #188 #30 #194 #155 #202 #209 #189 #104 Biphenyl #1 #3 #10 #15 #169 #37 #54 #126 #77 Tube#2 ヘキサンコンディショニングのみ 10% 10% 0% Hexane Acetone Elution Volume (ml) 0% Hexane Acetone Elution Volume (ml) 同一ロットだが保管状況により活性が変わったため保持挙動にも影響した 33

34 3. コンディショニングの目的充填剤の活性化使用した固相抽出カラム :Alumina N 1g/6mL PCB 異性体 20 成分を分画 Tube#3 はアセトン - ヘキサンコンディショニングを行った Elution % 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% Oil #155 #188 #202 #209 #208 #206 #194 #189 #104 #30 #54 #10 #1 Biphenyl #3 #169 #77 #37 Tube#1 ヘキサンコンディショニングのみ Elution % 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% Oil #209 #188 #202 #30 #155 #189 #208 #194 #104 #206 #1 # 10 #54 Biphenyl #169 # 15 #77 コンディショニング #37 #126 Tube#3 アセトン - ヘキサン 20% #126 #15 20% #3 10% 10% 0% Hexane Acetone Elution Volume (ml) 0% Hexane Acetone Elution Volume (ml) 水分除去により活性が上がるため保持は強くなる傾向にある 34

35 本日の内容固相抽出とは? 1 2 固相抽出の目的特長目的物質充填剤溶媒の三角関係コンディショニングの目的 3 4 コンディショニングの重要性チャネリングの予防充填剤間フリッツの気泡除去充填剤の活性化固相抽出カラムの使用方法様々なカラム形状サンプルマトリクスからの充填剤選択各充填剤の選択と使用方法分散型固相抽出について自然落下を快適に行うテクニック通液速度と回収率の関係様々な溶出方法ディスポーサブルライナーの活用

36 4. 自然落下を快適に行うテクニック通液速度と回収率の関係回収率 90% 以上 Journal of Chromatography, 622 (1993) 通液速度は 1~2mL/min( 約 1~2 滴 / 秒 ) 程度が最適である 36

37 4. 自然落下を快適に行うテクニック様々な溶出方法減圧吸引迅速に作業できるが液枯れの恐れあり液面監視が必要なため多検体処理は困難加圧方式この 3 つの中では最もデメリットが少ない加圧させる専用器具が必要多検体処理は困難自然落下最も簡便な方法で多検体処理も可能気泡の影響により通液速度が安定しないマニホールドを使用した気泡除去で解決溶出に時間がかかるディスポーサブルライナーの使用で解決 37

38 4. 自然落下を快適に行うテクニックディスポーサブルライナーの活用マニホールドを使用した気泡除去後は固相カラム毎の通液速度が均一になっている気泡除去後は自然落下での溶出において充填剤部の液枯れの心配がなく作業が容易さらにディスポーザブルライナーの接続で通液速度をアップさせる製品型番 :57059 ディスポーザブルライナー 38

39 4. 自然落下を快適に行うテクニックディスポーザブルライナーの活用使用した固相抽出カラム :Supelclean Sulfoxide 3g/6mL ディスポーザブルライナーの長さと自然落下での通液速度ディスポーザブルライナー :8cm の接続で通液速度は約 2 倍になったこのライナーの長さに比例して通液速度が変化するため調整も可能 39

イオン交換 :SAX SCX WCX MCAX Supel TM -Select シリーズ

40 固相抽出カラム製品ラインアップ Discovery シリーズシリカゲル基材のラインアップ Lot 間のバラツキを最小にする為厳重な品質管理を行っており製品には充填剤物性の証明書付き逆相 :C18 C8 Phenyl CN 順相 :Si Diol NH 2 イオン交換 :SAX SCX WCX MCAX Supel TM -Select シリーズポリマー基材のラインアップシリカゲルではないため残存シラノールの影響や不純物金属の影響を受けないため高い回収率が得られます逆相 :HLB イオン交換 :SAX SCX WCX MCAX 40

41 固相抽出カラム製品ラインアップ使用目的別の固相抽出カラム HybridSPE -Phospholipid リン脂質除去用 Z-Sep 脂質除去用 SupelMIP 分子構造認識ポリマー Ag-ION 脂肪酸メチルエステル分画用 Supel -Tox マイコトキシン専用多機能カラム 41 Sulfoxide トランス油中の PCBs 用 EZ-POP NP 油中の PAHs 用

42 ありがとうございました固相抽出カラムディスポーサブルライナーはサンプルのご用意がございますブースにお越しいただくか後日お気軽にお申し付け下さい Web サイトからもご請求いただけます sigma.com/spe-jp お問い合わせはシグマアルドリッチジャパンテクニカルサポート TEL

43 シグマアルドリッチジャパン製品に関するお問い合わせは弊社テクニカルサポートヘ TEL: 在庫照会ご注文方法に関するお問い合わせは弊社カスタマーサービスへ TEL: ご質問ご相談は 5 ホール (5 A-7 02) THANK YOU FOR YOUR ATTENTION!

44 WE ARE MERCK 2015 年 11 月にメルクミリポアとシグマアルドリッチはひとつの会社メルクとして活動を開始しました現在世界 65 ヶ所の製造拠点を持ち業界で高い評価を受けている多くのブランドを含む 30 万を超える幅広い製品を提供しています主なお取扱いブランド :Millipore, Merck, Supelco, Sigma-Aldrich, Cerilliant など製品に関する疑問などございましたらお気軽にお問い合わせください MERCK 製品に関するお問い合わせ Tel: SIGMA-ALDRICH 製品に関するお問い合わせ Tel: 納期などご注文に関するお問い合わせ Tel: FAX: 納期などご注文に関するお問い合わせ Tel: FAX:

グリホサートおよびグルホシネートの分析の自動化の検討小西賢治栢木春奈佐々野僚一 ( 株式会社アイスティサイエンス ) はじめにグリホサートおよびグルホシネートは有機リン化合物の除草剤であり土壌中の分解が早いことから比較的安全な農薬としてまた毒劇物に指定されていないことから比較的入手が容

グリホサートおよびグルホシネートの分析の自動化の検討小西賢治栢木春奈佐々野僚一 ( 株式会社アイスティサイエンス ) はじめにグリホサートおよびグルホシネートは有機リン化合物の除草剤であり土壌中の分解が早いことから比較的安全な農薬としてまた毒劇物に指定されていないことから比較的入手が容グリホサートおよびグルホシネートの分析の自動化の検討小西賢治栢木春奈佐々野僚一 ( 株式会社アイスティサイエンス ) はじめにグリホサートおよびグルホシネートは有機リン化合物の除草剤であり土壌中の分解が早いことから比較的安全な農薬としてまた毒劇物に指定されていないことから比較的入手が容易な農薬として広く使用されている両化合物は極性が極めて高く一斉分析法に適していないことから厚生労働省より個別分析法が通知されている