上原記念生命科学財団研究報告集, 28 (2014)

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えいじろうひでやま
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1 上原記念生命科学財団研究報告集, 28 (2014) 182. 白血病幹細胞根絶を目指した新規免疫遺伝子治療の開発研究安川正貴 Key words: 白血病, 免疫遺伝子治療, T 細胞レセプター,WT1 * 愛媛大学大学院医学系研究科生体統御内科学分野緒言最近, 悪性腫瘍に対する様々な細胞免疫療法が開発されているが, これまでの臨床試験の結果は必ずしも満足できるものではなく, 更なる創意工夫が必要である. 抗腫瘍免疫応答はさまざまな免疫担当細胞によって担われているが, がん特異的細胞傷害性 T 細胞 (CTL) がその中心的役割を演じている. 予め ex vivo で大量のがん特異的 CTL を培養し, その体内移入による adoptive immunotherapy(ctl 養子免疫療法 ) に大きな期待が寄せられているが, がん特異的 CTL の大量培養は容易ではない.CTL はその細胞表面に発現されている T 細胞レセプター (TCR) によって標的細胞を特異的に認識する. 従って, がん特異的 CTL クローンから TCR 遺伝子を単離し, 遺伝子導入することによってがん特異的 CTL を大量に作製することが可能である. 他方, がん幹細胞の概念が確立されるにつれて, 治療成績向上にはがん幹細胞を標的とすることが重要であることが明らかとなった. このような背景のもと, 本研究では, 白血病幹細胞に高発現されている標的分子特異的 TCR 遺伝子導入人工 CTL の抗白血病効果を検証し, その臨床試験に結び付けることを計画した. 方法 1. 白血病特異的 CTL クローンの樹立と TCR 遺伝子発現ベクターの構築我々のグループで樹立されていた白血病幹細胞に強く発現されていることが知られている WT1 と Aurora-A kinase に特異的 CTL クローンから TCR 遺伝子を単離し, タカラバイオ株式会社と共同開発した内在性 TCR 発現抑制新規レトロウイルスベクターを構築した ( 図 1) 1,2). * 現所属 : 愛媛大学大学院医学系研究科血液免疫感染症内科学講座 1

2 図 1 内在性 TCR 発現を抑制するレトロウイルス発現ベクター. 内在性 TCR 遺伝子発現を抑制し発現させたい TCR のみを選択的に発現できる新規レトロウイルスベクターを用いることで発現効率が高まるとともに危険な自己反応性のミスペアリング TCR の発現を抑制できる２人工 CTL の抗白血病幹細胞効果の検証まず TCR 遺伝子導入による HLA 拘束性抗原特異性の獲得をテトラマー解析ならびに 51Cr 放出細胞傷害試験で確認した３新鮮分離ヒト白血病細胞移植 NOG マウスの作製と化学療法後の微少残存白血病幹細胞の定量的測定患者から直接分離したヒト急性白血病細胞を NOG マウスに移植してヒト化白血病マウスを作製した HLA 一致ヒト白血病細胞移植 NOG マウスに大量化学療法実施後コントロール T 細胞または人工 CTL を毎週１回経静脈的に投与した約２３ヶ月後にそれぞれのマウス骨髄に残存しているヒト白血病細胞をフローサイトメトリーで定量的に測定したさらにその骨髄細胞を別の放射線照射 NOG マウスに移植しヒト白血病細胞の生着が認められるか否かの検討を行い抗白血病幹細胞効果を検証したなお末梢血や骨髄採取に関しては提供者の同意を得た後に実施した検体採取については病名を告知した患者からのみ十分なインフォームドコンセントのもとに行った患者からの採血を伴う研究に関しては当大学臨床研究倫理委員会にて承認を得たまたウイルスベクター使用についても当大学遺伝子組換え実験安全委員会の承認を得た動物実験は当大学総合科学研究支援センターの施設において動物実験指針に適合して実施した 2

3 結果 1.WT1 特異的 TCR 遺伝子導入 T 細胞の機能解析 WT1 特異的 HLA-A24 拘束性 CTL クローン由来 TCR 遺伝子導入 T 細胞は, 親株の CTL クローン同様,WT1 特異的 HLA-A24 拘束性細胞傷害性を獲得した. また, 白血病細胞を HLA-A24 拘束性に殺傷した ( 図 2) 1). 図 2. WT1 特異的 TCR 導入 CTL のヒト白血病細胞に対する細胞傷害活性. WT1 特異的 HLA-A24 拘束性 CTL クローン由来 TCR を末梢血 CD8 陽性 T 細胞に遺伝子導入した.WT1- TCR 遺伝子導入 T 細胞は, 親株 CTL と同様,HLA-A24 拘束性に白血病細胞を特異的に殺傷した. 2. ヒト白血病細胞移植 NOG マウスにおける抗白血病効果 HLA-A24 陽性白血病患者骨髄から分離した白血病細胞を NOG マウスに移植した.2~3ヶ月後, 骨髄にヒト白血病細胞が生着し増殖していることを確認した. このマウスに大量化学療法を施行したが全く効果が認められなかった. しかし, このヒト化白血病マウスに WT1 特異的 TCR 遺伝子導入 CTL を経静脈的に投与したところ, 骨髄の白血病細胞が著明に減少した ( 図 3). 3

4 図 3 WT1 特異的 CTL 輸注による化学療法抵抗性白血病に対する抗腫瘍効果患者骨髄から分離した化学療法抵抗性白血病細胞を NOG マウスに移植した生着後大量化学療法を行ったが全く効果を認めなかったその後 WT1 特異的 CTL を輸注したところ骨髄中の白血病細胞が著明に減少した他方このヒト化白血病マウスに大量 Ara-C を投与したところ骨髄白血病細胞が著明に減少したがわずかながら残存していたこの細胞を別の NOG マウスに移植したところ生着が確認されたことから大量化学療法のみでは白血病幹細胞の排除は困難であることが明らかとなったところが大量 Ara-C 投与後に WT1 特異的 TCR 遺伝子導入 CTL を経静脈的に投与したところ骨髄のヒト白血病細胞は完全に消失し別のマウスに移植しても生着は認められなかった図４ 4

5 図 4 WT1 特異的 CTL 輸注による化学療法抵抗性白血病幹細胞完全排除ヒト化白血病マウスに大量化学療法を施行したところ骨髄白血病細胞が著明に減少したがわずかながら残存していたこの残存細胞を別の NOG マウスに移植したところ生着が確認された他方大量 Ara-C 投与後に WT1 特異的 TCR 遺伝子導入 CTL を経静脈的に投与したところ骨髄のヒト白血病細胞は完全に消失し別のマウスに移植しても生着は認められなかった他方正常造血幹細胞へは全く細胞傷害性を示さないことも確認できた図５ 5

図 5 WT1 特異的 CTL の正常造血幹細胞への安全性 WT1 特異的 CTL またはコントロール T 細胞と正常造血幹細胞を in vitro で十分な時間接触させた後 NOG マウスに移植したどちらも十分な正常造血細胞の増殖と分化が認められたことから WT1 特異的 CTL は正常造血幹細胞には影響を与えないことが示されたこのことから大量化学療法後に WT1-TCR

6 図 5 WT1 特異的 CTL の正常造血幹細胞への安全性 WT1 特異的 CTL またはコントロール T 細胞と正常造血幹細胞を in vitro で十分な時間接触させた後 NOG マウスに移植したどちらも十分な正常造血細胞の増殖と分化が認められたことから WT1 特異的 CTL は正常造血幹細胞には影響を与えないことが示されたこのことから大量化学療法後に WT1-TCR 遺伝子導入 CTL を輸注することで化学療法抵抗性白血病を治癒に結び付けられる可能性が示されたさらに WT1 同様に白血病細胞に高発現している Aurora-A kinase 特異的 CTL クローンからも同様に TCR 遺伝子を単離しレトロウイルス発現ベクターを構築した WT1 特異的 TCR 遺伝子導入人工 CTL 同様に Aurora-A kinase 特異的 TCR 遺伝子導入人工 CTL 輸注によって抗白血病効果が得られることがヒト化白血病マウスモデルで証明できた図６ 2) 6

図 6 Aurora-A kinase 特異的 TCR 遺伝子導入 CTL の抗白血病効果 Aurora-A kinase 特異的 TCR 遺伝子改変 CTL またはコントロール T 細胞をヒト白血病細胞移植 NOG マウスに輸注した Aurora-A kinase 特異的 TCR 遺伝子改変 CTL 輸注群では白血病の増殖が完全に抑制された考察

7 図 6 Aurora-A kinase 特異的 TCR 遺伝子導入 CTL の抗白血病効果 Aurora-A kinase 特異的 TCR 遺伝子改変 CTL またはコントロール T 細胞をヒト白血病細胞移植 NOG マウスに輸注した Aurora-A kinase 特異的 TCR 遺伝子改変 CTL 輸注群では白血病の増殖が完全に抑制された考察これまでの基礎研究ならびに造血幹細胞移植療法における臨床的研究などから白血病を治癒に導くためには化学療法による毒性効果のみでは不十分であり免疫監視機構が重要であることが明らかにされている他方がん幹細胞の概念が確立され白血病の治癒には白血病幹細胞を標的とした治療法の開発が必要であることが明らかにされつつある本研究ではヒト化マウスを用いた実験系を中心として遺伝子改変人工細胞傷害性Ｔ細胞 CTL を作製しその抗白血病幹細胞効果を検証したその結果大量化学療法後に WT1-TCR 遺伝子改変Ｔ細胞を輸注することで化学療法抵抗性白血病幹細胞を完全に排除できる可能性が強く示唆された 1-4) これらの研究成果を基に現在他施設共同で WT1 特異的Ｔ細胞レセプター遺伝子導入リンパ球輸注遺伝子治療臨床研究が進行中である他方 TCR 遺伝子改変 T 細胞に加え chimeric antigen receptor CAR 遺伝子改変 T 細胞の臨床試験も進んでおり驚異的な抗腫瘍効果が発表されている 5) さらには CTLA-4 や PD-1/PD-L1 などの免疫チェックポイント制御によるがん免疫療法も大きな進歩を示している今後化学療法にこれらの免疫療法を組み合わせることで治療抵抗性白血病の治療成績が著しく改善されることが大いに期待できる共同研究者本研究の共同研究者は愛媛大学医学部附属病院の藤原弘講師と理化学研究所免疫アレルギー科学総合研究センター石川文彦グループディレクターである終わりに本研究を支援していただきました上原記念生命科学財団に厚くお礼申し上げます文献 1 Miyazaki, Y., Fujiwara, H., Asai, H., Ochi, F., Ochi, T., Azuma, T., Ishida, T., Okamoto, S., Mineno, J., Kuzushima, K., Shiku, H. & Yasukawa M. : Development of a novel redirected T cell-based adoptive 7

8 8 immunotherapy targeting human telomerase reverse transcriptase for adult T-cell leukemia. Blood, 121 : , ) Asai, H., Fujiwara, H., An, J., Ochi, T., Miyazaki, Y., Nagai, K., Okamoto, S., Mineno, J., Kuzushima, K., Shiku, H., Inoue, H. & Yasukawa, M. : Co-introduced functional CCR2 potentiates in vivo anti-lung cancer functionality mediated by T cells double gene-modified to express WT1-specific T-cell receptor. PLoS One, 8 : e56820, ) Iwami, K., Natsume, A., Ohno, M., Ikeda, H., Mineno, J., Nukaya, I., Okamoto, S., Fujiwara, H., Yasukawa, M., Shiku, H. & Wakabayashi, T. : Adoptive transfer of genetically modified Wilms' tumor 1-specific T cells in a novel malignant skull base meningioma model. Neuro. Oncol., 15 : , ) Asai, H., Fujiwara, H., Kitazawa, S., Kobayashi, N., Ochi, T., Miyazaki, Y., Ochi, F., Akatsuka, Y., Okamoto, S., Mineno, J., Kuzushima, K., Ikeda, H., Shiku, H. & Yasukawa, M. : Adoptive transfer of genetically engineered WT1-specific cytotoxic T lymphocytes does not induce renal injury. J. Hematol. Oncol., 7 : 3, ) Ochi, F., Fujiwara, H., Tanimoto, K., Asai, H., Miyazaki, Y., Okamoto, S., Mineno, J., Kuzushima, K., Shiku, H., Barrett, J., Ishii, E. & Yasukawa, M. : Gene-modified human α/β-t cells expressing a chimeric CD16- CD3ζ receptor as adoptively transferable effector cells for anticancer monoclonal antibody therapy. Cancer Immunol. Res., 2 : , 2014.

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Untitled 上原記念生命科学財団研究報告集, 23(2009) 190. CD4 + ヘルパー T 細胞の選択的活性化西川博嘉 Key words:cd4 + ヘルパー T 細胞,CD4 + 制御性 T 細胞, 癌精巣抗原,co-stimulatory molecules, 抗体療法三重大学大学院医学系研究科寄付講座がんワクチン講座緒言 1991 年ヒト腫瘍抗原遺伝子の存在が報告されて以来, これらの腫瘍特異抗原を用いた悪性腫瘍に対する免疫療法が注目を集めている.