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1 Focus your next-gen sequencing on DNA that matters SOLiD 効率的活用の決め手 SureSelect によるターゲットシーケンスの紹介

2 次世代シーケンシングの問題点を解決 次世代シーケンサの欠点読みたい場所だけを選んでシーケンスできない SureSelect で解決読みたい場所だけを選んでシーケンスする 大量の不要データ 例えば DNA-Seq で Coding 領域だけを読みたい場合 3GB のヒトゲノム Coding 領域約 1 % 99 % のシーケンスデータは不要 例えば RNA-Seq では 全 RNA シーケンスでたった 1% の遺伝子が 65% 近くの Read を占めてしまう シーケンス時間 コストを劇的に削減データ解析を格段に効率化

3 SureSelect 導入の利点 例えばヒト全エクソンなら SOLiD4 の 5 6 サンプルを1スライドにプールして run 可能 1ランで10~12 検体分析可能 データ量の圧倒的削減 例えば 200kb-3.4 Mb までのターゲット領域なら SOLiD4 1quadで 6-16サンプルを混合して分析可能 1 run 最大 128 検体分析可能 データ量の圧倒的削減とハイスループットさらにデータが必要部分のシーケンス情報だけになりMappingも効率化 必要な Read Depth によりプールできるサンプル数は異なります

4 用語と定義 Bait: ベイト ゲノムのターゲット領域に相補的な配列をもつ 120base の長さの シングルオリゴシーケンス 釣りの例えからの用語ゲノム DNA の池 (Pond) の中のターゲット 領域を釣ってくるためのエサ (Bait) Bait Group: ベイトグループ ひとつ もしくは複数のターゲット領域にデザインされた Bait のグループ Library: ライブラリ ひとつ もしくは複数の Bait Group から成る ひとつのキットとして製造されるオリゴのセット

5 SureSelect ターゲットエンリッチメントシステムデザインから実験までのプロセス 1. ( デザイン &) オーダー 2. キットの製造 3. 実験 カタログライブラリのオーダーまたは 57,680 種類の 120 mer の DNA オリゴを 1 枚のアレイ上に製造 アダプタ付き DNA 断片 ビオチン化 crna ベイトライブラリ earray によるカスタムライブラリキットのデザイン DNA オリゴを切り離す 溶液中でハイブリダイゼーション ストレプトアビジン磁性ビーズ earray Web Portal ビオチン化 crna に転写キットとして出荷 シーケンシング 目的の配列だけをキャプチャして濃縮 シーケンサへ

6 SureSelect ターゲットエンリッチメントシステム特長 高品質 120mer のロングオリゴを使用 SNP や In-Del の影響を受けにくく より大きな Deletion を検出可能 ビオチン化された crna ベイトによる高いキャプチャ効率 DNA-DNA より高い DNA-RNA のハイブリ効率 15 種類のモデル生物に対応したカスタムキット 100kb~50Mbまで幅広い領域のキャプチャシーケンスに対応できる高いフレキシビリティ gdna の抽出 アダプタ付き DNA ライブラリの作成からキャプチャまで 自動化を含めたトータルソリューションを提供 ( 新 SureSelect XT キット ) 容易なハイスループット化少ないgDNA 量で実験可能 スタート時の必要量は 3 μg アダプタ付き DNA は 500 ng New!

7 SureSelect ターゲットエンリッチメントシステムデザイン済みのカタログ 自由なデザインのカスタム New! カタログ製品 Human All Exon 50Mb キット ターゲット領域 : 約 50Mb Human All Exon V2 に Sanger が GENCODE のコンテンツを追加 Human All Exon V2 キット ターゲット領域 : 約 44 Mb 既存のキットに 2009 年 9 月の CCDS と Refseq のコンテンツを Broad が追加 Human All Exon キットターゲット領域 : Mb ( ヒトゲノムの 1.22 %) 2008 年 9 月の CCDS を元に Broad がデザイン Human Kinome キット Kinase 領域を選択的にキャプチャしてマルチプレックスシーケンスターゲット領域 : 約 3.2Mb Human Chr X キットテストラン用ですが ヒト X 染色体にフォーカスしたキャプチャ用にも 利用できます (5 反応から ) カタログ + カスタム製品 Human All Exon プラスカスタムキット 左記の Human All Exon キットに 1 キット分約 3.4Mb* までのカスタム領域をプラス してキャプチャできるキット * プラスできる領域は さらに拡張予定 (5 反応から ) カスタム製品 カスタムキット (10 反応から ) キャプチャ領域最大約 3.4 Mb シーケンスリード長とタイリングデザインにより異なります カスタムインデックスキット (100 反応から ) イルミナマルチプレックス法 SOLiD バーコードシーケンスに対応しています キャプチャ領域の大きさで 4 種類に分かれます MP1: < 0.2 Mb MP2: 0.2 ~ 0.5 Mb 未満 MP3: 0.5 ~ 1.5 Mb 未満 MP4: 1.5 ~ 3 Mb 未満 MP0: 3 ~ 約 3.4 Mb 対応生物種ヒト マウス ラット イヌ ウシ ニワトリ 線虫 ショウジョウバエ 出芽酵母 分裂酵母 アラビドプシス イネ アカゲザル マーモセットメダカ その他の生物種は独自デザインのベイトでライブラリ作成可能 対応次世代シーケンサ : イルミナ Genome Analyzerペアエンド法 シングルエンド法 ( シングルエンドは一部対応していないキットがあります ) Applied Biosystems SOLiD フラグメントライブラリ ペアエンドライブラリ Roche FLX, GS Junior 1 月より対応開始! New! New!

8 Human All Exon キット一覧 Human All Exon V1 Human All Exon V2 Human All Exon 50Mb CCDS Sept CCDS Sept additional RefSeq content including CCDS Sept exons GENCODE and Sanger (includes CCDS and Broad defined v2 content as well) CCDS (Sept. 2009) 93.76% 99.01% 99.86% CNV (Mar. 2010) 23.98% 27.49% 30.62% Ensembl (6/16/2010) 65.58% 71.37% 75.24% mirna (mirbase 14) 90.00% 90.00% 92.78% GenBank (6/16/2010) 75.96% 89.07% 90.74% RefSeq Genes (6/16/2010) 86.69% 93.29% 96.47% RefSeq Transcripts (6/16/2010) 88.85% 95.07% 97.50% Total 37.6Mb 44Mb 50Mb Developped with Broad Broad Sanger New! Human All Exon キットシリーズは 3.4Mb までのコンテンツを追加してカスタマイズ可能 ( プラスキット ) Human All Exon キットシリーズは SOLiD4 でマルチプレックスラン可能 New! Page 8

9 Human All Exon 50Mb のデータ例 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 76.3% % on target +/- 100bp 85.1% Uniformity (3/4 mean with upper tail): 96.7% % bases with 1x coverage 87.9% % bases with 10x coverage 77.5% % bases with 20x coverage Most comprehensive Human All Exon content available 38Mb design = a subset of 50Mb Sequencing capacity: sample / lane GAIIx 1-3 samples / lane HiSeq 5-10 samples /full slide SOLiD4 Chemistry recommended: PE 2x76bp Illumina PE 50+25bp SOLiD Multiplexing: Illumina HiSeq2000 SOLiD4 Page 9

10 Comparison of SNP calls with HapMap Genotype Sensitivity vs. HapMap Genotype Concordance vs. HapMap 100% 99.1% 99.2% 98.4% 98.0% 100% 99.8% 99.4% 99.7% 99.3% 98.2% 98.5% 98.1% 98.3% 95% 95.7% 94.9% 95% 90% 90% 85% 85% 80% 80% 75% 75% 70% Human All Exon v2 GT is REF GT is variant HOM GT is variant HET Human All Exon 50Mb 70% Human All Exon v2 GT is REF GT is variant HET Human All Exon 50Mb GT is variant HOM OVERALL Page 10

11 カスタムデザインのためのフリーツール Agilent earray SureSelect カスタムライブラリのデザインカスタムマイクロアレイのデザイン 15 種のモデル生物のゲノム情報 デザイン済みの各種アプリケーション用プローブセット (GE, CGH/CNV, mirna, ChIP on Chip) 最大 3.4Mb の任意の領域をキャプチャするベイトライブラリをデザイン (10 反応分 ~) 8X60K~1X1M までプローブ数に応じたフォーマットでカスタムアレイをデザイン (1 スライド ~)

12 SureSelect ライブラリのカスタムデザイン モデル生物種について gdna の任意の位置をターゲット領 域としてキャプチャ可能 ( ただしリピート領域は設計対象外 となります ) 2010 年 11 月 earray でサポートしているゲノム ヒト マウス イヌ ラット ウシ ニワトリ 線虫 ショウジョウバエ 出芽酵母 分裂酵母 アラビドプシス イネ アカゲザル マーモセット メダカ 独自デザインの 120mer ベイトを Upload 可能 新登場!

13 次世代シーケンサはハイスループット時代へマルチプレックス / バーコード対応プロトコル

14 なぜ個々のサンプルをキャプチャをしてからプールするのか? すべてのインデックス配列に有効なブロッキングが現時点で開発されていない インデックス配列を付ける前にサンプルを個別にキャプチャすることで 高いブロッキング効率 = 高い % on-targetを実現 キャプチャ前にプールしてしまうと キャプチャバイアスが生じる 高品質のサンプルのほうがキャプチャ効率が高い (i.e. リード数が増える ) サンプル間のリード分布のバラツキが生じる 多様なサンプルのプールにより ヘテロSNPやInDelのキャプチャ効率が下がる キャプチャ / シーケンス効率が低いサンプルの再分析が必要になる場合がある 先にキャプチャを行うと サンプル量を揃えるのが容易 = より均一なインデックス分布 先にキャプチャを行うと ヘテロSNPやInDelをより高い効率でキャプチャできる Page 14

15 1 レーンもしくは 1 区画あたり混合できるサンプル数の目安 シーケンサの機種 必要とされる Read Depth により異なります SOLiD は 1 ラン 2 スライドです SureSelect Target size (Mb) illumina GAIIx v4 SOLiD3 plus per 1 lane per 1 quad 4-5Gb of high Quality data per lane 1 Gb of mapped bases per quad MP1 <0.2 Mb MP Mb MP Mb MP Mb MP0 for illumina Mb 4-5 MP0 for SOLiD Mb 6 Human All Exon on GAIIx Mb 1 Human All Exon on HiSeq Mb 2-3 Human All Exon on SOLiD3 plus * full 2 slides 4 *

16 SureSelect XT Target Enrichment System プロトコール全体の流れ (SOLiD の場合 ) ゲノムDNA 3ugを 150bpのサイズにコバリスで断片化 1 日目アダプタ付き DNA 作成 AMPure ビーズを用いた精製 アダプタ付きDNA 500ngをSureSelectとハイブリ 24 時間 2 日目 AM ハイブリダイゼーション準備 2~3 日目ハイブリダイゼーション 24 時間 磁性ビーズで Target 領域を濃縮の後 PCR 増幅してバイオアナライザで確認 3 日目 PM 磁性ビーズでキャプチャ配列濃縮後定量シーケンシングへ

17 各種参考資料 ( 日本語版 ) から公開 - 実験に必要なものリスト - earray 日本語ベイト設計ガイド - SureSelect 日本語プロトコール

18 エクソンシーケンスメンデル遺伝病の原因遺伝子特定に威力を発揮 メンデル遺伝病は 少数の例外を除き Coding 領域の変異が原因となる エクソンはヒトゲノムの中でわずかに % (30-42Mb) - Protein Coding 領域の重要性が高い エクソンキャプチャシーケンスの利点 シーケンス量を大幅に削減できる 多検体の分析が可能になる All Exons on X chromosomes 7674 exons 3Mb エクソンキャプチャシーケンスの問題点 Coding 領域以外で起きている変異を検出できない Coding 領域の変異が着目される理由 解釈がより容易 フォローアップが容易 CCDS exons v1 CCDS + RefSeq 38Mb v2 (Broad) GENCODE 50Mb (Sanger) Includes ncrna Page 18

19 エクソンシーケンスがんその他の複雑な疾患へも急速に応用が広がる SureSelect Human Kinome キットのキャプチャターゲット 517 Protein Kinase genes 12 PI3K domain-containing genes 13 diglyceride kinases 6 PI3K regulatory components 9 inositol polyphosphate Kinases 9 PIP4/PIP5 Kinases 30 cancer genes 16 genes specifically known to be mutated in breast cancer KRAS mut: 32% PIK3CA mut: 13% BRAF mut: 10%

20 NGS をより効率的に活用するツールをトータルソリューションとして提供 DNA,mRNA ライブラリ作成 ターゲットキャプチャ サンプル QC シーケンスマッピングデータ解析 The SureSelect XT キット ライブラリ作成 & キャプチャ自動化システム BRAVO 各種 SureSelect キット バイオアナライザ高感度 DNA キット定量 PCR ライブラリ定量キット 次世代シーケンサ Illumina GA AB SOLiD Roche 454 GeneSpring NGS(2011 予定 ) AVADIS NGS

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