組換えDNA講習会プレゼン資料

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1 2017 年度長崎大学組換え DNA 実験講習会 2. 組換え DNA 実験申請に際しての留意点 水上修作 長崎大学熱帯医学研究所

2 組換え DNA 実験申請に際しての留意点 遺伝子組換え実験を行う際のルールは国の法律です 審査を経て組換え DNA 実験計画が承認されるまで 遺伝子組換え実験はもちろん 遺伝子組換え生物試料の保管もできません 申請後も 実験計画の有効期間に注意が必要です 暦月で 5 年間有効例 :2016 年 6 月承認の場合 2021 年 5 月末まで 本学の組換え DNA 実験安全委員会は 各部局から選出された教員で構成されています 2

3 長崎大学組換え DNA 実験安全委員会委員名簿 定足数 10 人の委員 ( 委員長 安全主任者 副安全主任者を除く15 人の2/3 以上 ) の審査を持って意見を取り纏め 委員長 ( 審査 ) に進みます 現在 委員区分 所属等 職名 氏名 任期 内線 備考 第 1 号委員医歯薬学総合研究科准教授森亮一 H ~ H 病 7051 ryoichi@ 委員長 薬学部教授武田弘資 H ~ H 本 2417 takeda-k@ 熱帯医学研究所助教水上修作 H ~ H 病 7820 mizukami@ 熱帯医学研究所講師菊池三穂子 H ~ H 病 7845 mkikuchi@ 病院教授宮崎泰司 H ~ H 病 7109 y-miyaza@ 病院講師星野倫範 H ~ H 病 7675 thoshino@ 第 2 号委員歯学部准教授根本優子 H ~ H 病 7643 ynemoto@ 副委員長 環境科学部教授長江真樹 H ~ H 本 2755 nagae@ 第 3 号委員水産学部准教授山田明徳 H ~ H 本 2847 ayamada@ 第 4 号委員教育学部教授堀井健一 H ~ H 本 2304 horii@ 第 5 号委員医学部 原爆後障害医療研究所教授吉浦孝一郎 H ~ H 病 7118 kyoshi@ 第 6 号委員保健 医療推進センター准教授古林正和本 2213 masakazu-f328@ ( 官職指定 ) 第 7 号委員研究国際部部長山﨑雅彦本 2869 m-yamasaki@ ( 官職指定 ) 第 8 号委員歯学部准教授増山律子 H ~ H 病 7755 ritsuko@ 工学研究科准教授郷田秀一郎 H ~ H 本 2685 sgoda@ 先導生命科学研究支援センター教授大沢一貴 H ~ H 病 7132 kohsawa@ 合計 16 人 安全主任者先導生命科学研究支援センター准教授木住野達也 H ~ H 病 7191 kishino@ 副安全主任者環境科学部教授宮西隆幸 H ~ H 本 2768 miyanish@ アドレスは, 末尾の nagasaki-u.ac.jp を省略している 3

4 1. 教職員の皆さまへ 2. 教職員ポータル 4

5 3. 組換え DNA 実験計画申請 Web システム 新規 変更 終了 譲渡 分与 報告書 マニュアル等 すべてここにあります 4. 長大 ID & パスワードでログイン 5

6 クリックして下さい XXXXXX xxxxxxxx 6

7 5. 組換えDNA 実験講習会の受講記録 XXXXXX 実験責任者 実験従事者の受講状況を必ず確認してください 別ウインドウで開きます 6. 新規申請 7

8 XXXXXX ７. DNA実験安全管理規則 計画書 終了 譲渡 分与 報告書 マニュアル等 はここにあります 別ウインドウで開きます 8

9 別ウインドウで開きます 8. 組換え DNA 実験計画書 WEB 申請マニュアル 9. 組換え DNA 実験施設設置 変更申請 (Word ファイル ) 次のページ 9

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11 1 遺伝子組換え生物の他機関への譲渡及び搬出について他機関への譲渡及び搬出前に 遺伝子組換え生物等の譲渡の計画書 ( 様式 1) 及び 遺伝子組換え生物等の譲渡 提供 委託に際しての情報提供書 ( 様式 2) を 部局担当係を通して 研究国際部研究企画課まで提出願います なお 譲渡及び搬出は 安全委員会の確認後になります 2 遺伝子組換え生物の本学への譲受及び搬入について本学への譲受及び搬入前に 遺伝子組換え生物等の譲受の計画書 ( 様式 3) 及び 譲渡元発行の情報提供書 を 部局担当係を通して 研究国際部研究企画課まで提出願います なお 譲受及び搬入は 安全委員会の確認後になります 3 遺伝子組換え生物の本学への購入及び搬入について本学への購入及び搬入前に 遺伝子組換え生物等の購入の計画書 ( 様式 4) 及び購入先発行の情報提供書を 部局担当係を通して 研究国部研究企画課まで提出願います なお 購入及び搬入は 安全委員会の確認後になります ( 手続きに 7 日 ~10 日かかりますので必ず余裕を持って提出して下さい ) 10. 譲渡 分与 購入の計画書 情報提供書 11

12 組換えＤＮＡ実験終了 中止 報告書 Wordファイル 組換えＤＮＡ実験を終了 中止 した場合は 終了 中止 後 速やかに提出願います なお ＷＥＢ申請審査システムにより申請 承認された組換えＤＮＡ実験については ＷＥＢ 申請審査システムの 終了 中止申請 により報告願います 組換えＤＮＡ実験記録簿 11. 組換えＤＮＡ実験 記録簿 (Wordファイル 他の大学等の研究機関等における実験報告 (Wordファイル 次のページ バイオハザード表示 物理的封じ込めレベルがＰ２以上の実験室には表示が必要です ＬＡＣＳ受講者用組換えＤＮＡ実験講習ｅ ラーニング LACS 利用案内 Ｗｅｂ視聴者用組換えＤＮＡ実験理解度テスト問題 Pdf ファイル 組換えＤＮＡ実験講習受講修了届 受講一覧に登録が必要な場合のみ提出願います 組換えＤＮＡ実験講習会動画 文部科学省ホームページ 遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律 関連 研究開発等に係る遺伝子組換え生物等の第二種使用等に当たって執るべき拡散防止措置等を 定める省令の規定に基づき認定宿主ベクター系等を定める件の一部を改正する告示 について 平成26年7月1日施行 研究開発等に係る遺伝子組換え生物等の第二種使用等に当たって執るべき拡散防止措置等 を定める省令の規定に基づき認定宿主ベクター系等を定める件 平成１６年文部科学省告示 第７号 の改正の概要 平成２８年度長崎大学組換えＤＮＡ実験講習会 ５月２６日 木 配布資料 組換えＤＮＡ実験に関わる法律と組換えＤＮＡ実験を行う際の留意点 組換えＤＮＡ実験申請に際しての留意点 組換えＤＮＡ実験講習会ＤＶＤ貸出については所属部局の担当係または研究企画課まで御連絡下さい 12

13 別ウインドウで開きます 長崎大学組換え DNA 実験安全管理規則 ( 実験の記録 ) 第 32 条実験責任者は, 実験に係る安全の確保のため, 必要な事項を組換えDNA 実験記録簿 ( 別記様式第 3 号 ) に記録しなければならない 2 前項の記録は, 実験の終了及び中止後, その写しを学長に提出しなければならない 13

14 WEB 申請書作成の前に準備すること 1. 組換え DNA 実験計画書 WEB 申請マニュアルを読む ( 必要事項 作業の手順がわかる ) 2. 実験従事者の組換え DNA 実験講習会の受講記録 (3 年以内に 1 回受講 ) と健康診断記録 (1 年以内に受診 ) のチェック 3. 実験計画書の作成 (1) 実験の内容のどの部分が組換え DNA 実験なのか? (2) 動物を用いる実験を行うのか?( 同時に動物実験の申請も必要 ) (3) どこで実験するのか? 4. 核酸供与体 ( 生物種 ) 宿主 ベクターのクラス分類の確認 14

15 新規申請手順 統合認証システム XXXXXX アクセス記録表示 xxxxxxxx XXXXXXX 組換えDNA実験計画 申請Webシステム 15

16 1 記入者情報の入力このアドレスに連絡メールが届きます 実験責任者は必須 ログインユーザー以外に実験計画書のデータを参照させたい場合に 記入して下さい XXXXXX 2 実験責任者は 研究の全容を把握し 実験従事者の安全の確保に努めてください マウスポインタを近づけると 注釈が表示されます 実験責任者 : 組換え実験の経験 3 年以内の組換え DNA 実験講習会受講 [ または LACS での受講 ] 1 年以内の健康診断受診の記入が必要です 3 可能であれば 所属する部局の委員に申請前に委員に内容のチェックをお願いして下さい ここに記入した委員にも 実験計画を申請した旨 メールが届きます プルダウンにて職名を選択して下さい 16

17 4 実験の区分と封じ込めレベルを決定 組換え DNA 動物実験のみの時は P1A, P2A, P3A のみにチェック DNA 供与体と宿主の組み合わせ 物理的封じ込め レベルの判断 実験計画の内容に基づいて決定 1) P1 と P2 以上 では委員会の審査の流れが大きく異なります P1: 委員長の確認 判断で迅速審査が行われます P2, P3: 委員会の委員全員での審査になります FAQ1) 一時保存の方法組換え DNA 申請者用マニュアルをご覧ください 本来 P1 のものを P2, P3 として申請すると 時間 + 手間 = 迅速な審査の妨げ になります 2) 本来 P1の扱いだが P2の実験区域で作業するので P2 実験に準じた取り扱いをする 場合 P1として申請し 備考の欄に上記を記入して下さい 参照 ) 遺伝子組換え生物の第二種使用等について ( 特に p.12-17ページ ) 17

18 組換えＤＮＡ実験安全委員会ホームページ 文部科学省ホームページ 遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保 に関する法律 関連 18

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20 大臣確認申請フォーマット 1 章 遺伝子組換え生物の 第二種使用等について 2 章 大臣確認が不要な実験の流れ 3 章 大臣確認が必要な実験の流れ 認定宿主ベクター系等を定める 20

21 認定宿主ベクター系等を定める 21

22 日本ウイルス学会ホームページ 組換え体ワクシニアウイルスについての申請例 組換え体センダイウイルスについての申請例 組換え体ポリオウイルスについての申請例 組換え体ヒト免疫不全ウイルスについての申請例 22

23 ⑤ 課題名の入力 当然ですが 研究内容を 適切に示す課題名にして 下さい ⑥ 実施期間 暦月で５年以内で入力し てください 注５ 健康診断は実験開始 日の１年以内に必ず受診する こと 外部の医療機関で健康 診断を受けた場合は その他 参考となる事項に医療施設名 及び受診日を報告願います ⑦ 実験従事者 3年以内の組換えDNA実験 講習会の受講 [またはLACSでの受講] 1年以内の健康診断受診 が必要です FAQ2 実験責任者の実験の経験欄の記入の方法 本学あるいは他大学(機関名も記入 で過去に実施した組換えDNA実験の課題番号およ び課題名(最新のも１件)を記入 本学での実験の場合 整理番号を入力してリターンボタンをクリックすると 自動的 にリンク(承認番号と課題名が表示 します 本学での組換えDNA実験がない場合は 実験計画書またはそれに代わるもの 論文 等 を添付して下さい 本学での組換えＤＮＡ実験がない場合は 実験計画書またはそれに代わるもの 論文 等 を添付してください 表示する項目数の変更が 可能です 申請ボタン 申請内容に 記入漏れがないか自動的 にチェックしてくれます 23

24 8 実験の目的 (1) 実験の内容のどの部分が組換え DNA 実験なのか? 詳細に記載して下さい (2) 動物を用いる実験を行うのか? 9 実験の概要 DNA 組換え体 ( 細菌 マウス等 ) の分与を受ける場合 また作成を外部に依頼する際 ( ノックアウトマウス作成 ) は 分与元 依頼先 ( 研究者名だけでなく所属 ) や参考文献を明記して下さい (3) どこで実験するのか? 各実験ごとに実施する実験室を明記 ( 実験施設のチェックのため 室名までお願いします ) 詳細に記載して下さい 例 ) 1. 遺伝子クローングや遺伝子発現のためのプラスミド DNA を構築し さらにそのプラスミドを大量調製するために大腸菌を形質転換する 2. 大腸菌を用いたリコンビナントタンパク質の調製 :BSL 3 の細菌の遺伝子をプラスミド (pet28a) に組み込んだものを 大学 学部 氏より分与してもらう ( 文献 ) これを大腸菌 [BL21(DE3)] に導入し リコンビナントタンパク質を調製する 3. 遺伝子改変動物 ( ノックアウトマウスなど ) を購入 導入 ( 入手先を記載 ) 繁殖して実験に用いる 動物実験の申請が必要です ( 申請書のアップロード ) 4. ウイルスベクターを用いた動物細胞および動物個体への遺伝子導入と感染実験 社のキット ( ) を用いてリコンビナントレンチウイルスベクターを作製し HEK293 細胞やマウス ( tg マウス KO マウス ) の脳に遺伝子導入する 5. バキュロウイルスを用いて作製したリコンビナントタンパク質の購入 : 社より リコンビナントタンパク質を購入するが タンパク溶液からバキュロウイルスを完全に除去できていない旨 情報提供があったため 当該実験を申請する 24

25 10 例 ) DNA 供与体 宿主の組み合わせ詳細に記載して下さい ヒト (Homo sapiens) マウス (Mus musculus) ラット (Rattus norvegicus) オワンクラゲ (Aequorea victoria) 非病原性大腸菌 (Escherichia coli) 宿主がウイルスの場合 保有細胞 動植物種を記載して下さい ) 注意事項 : DNA 供与体の生物種名菌種名 株名を正確に明記して下さい その他 や など 曖昧な表現は NG です 株によって BSL レベルが異なる菌は株名まで記入して下さい DNA 供与体 ベクター内の DNA や遺伝子 (CMV プロモーターなど ) 注 ) ノックアウトマウスに組み込まれたネオマイシン耐性遺伝子 loxp 配列や GFP, Cre リコンビナーゼ等について記載漏れが多々あります 忘れずに記載して下さい カルタヘナ法では培養細胞は宿主として扱われませんので ご注意ください 注 ) 文科省の説明資料 ( 平成 18 年 10 月 ) には ベクター内に含まれる薬剤耐性遺伝子などのマーカー遺伝子と 目的遺伝子に係るものを除く発現調節遺伝子である供与核酸が由来する核酸供与体の特性または供与核酸の特性に関しては記載を省略できる 旨記載されていますが DNA 供与体 宿主の組み合わせを省略して良いとは記載されていません 上記を拡大解釈し ノックアウトマウス ( 供与核酸 : 大腸菌 ネオマイシン耐性遺伝子 ) を非 LMO とすることは問題があります プラスミドに含まれる CMV プロモーターを組換えて レンチウイルスベクターに組み込む場合など 明らかに LMO になります (LMO: Living Modified Organism) 25

26 11 ベクターの特性 核酸供与体及び供与核酸の特性詳細に記載して下さい 核酸供与体及び供与核酸の特性について記載して下さい また 毒素産生性の有無 哺乳動物に対する毒性があれば 明記して下さい ベクターの特性例 ) ( 注 9) 毒素産生 ウイルスの使用においてはその特性の詳細を記入すること 廃棄についての記載も必要です 1. puc 系 (pbluescript 等 ) の大腸菌用のクローニングベクター ( 参考資料としてマップ添付もしくは販売元会社名 ) 2. pbr322 系 :ptrc (Invitrogen), pet (Novagen), pqe (Qiagen) 等の大腸菌の発現用プラスミドベクター 3. puc 系 (pcdna3 等 ) 哺乳類細胞発現用プラスミドベクター (Invitrogen) 4. アデノ随伴ウイルス作製用プラスミドベクター (pw1,p5clz,pim45,pladeno1 等 : 参考資料 10[ 自作ベクターはマップを添付 ]) 5. plenti 系レンチウイルス作製用プラスミドベクター (plenti6.3, plenti7.3 等 : Invitrogen) 核酸供与体及び供与核酸の特性例 ) 1. ヒト マウス ラット cdnaおよびゲノム断片 ( 同定済み遺伝子 ) 2. 大腸菌 ( 同定済み遺伝子 ): 薬剤耐性遺伝子 ( アンピシリン カナマイシン ネオマイシン テトラサイクリン耐性遺伝子等 ): 省略可 3. 有鞘類オワンクラゲ ( 同定済み遺伝子 ): 蛍光タンパク質遺伝子 (EGFP, YFP, AcGFP 等 ) 4. 造礁サンゴ ( 同定済み遺伝子 ): 蛍光タンパク質遺伝子 (ZsGreen, DsRed, mcherry 等 ) 核酸供与体 5. バクテリオファージ科 P1ファージ ( 同定済み遺伝子 ): Cre リコンビナーゼ loxp 配列 ( 組換え酵素認識配列 ) 6. 上記に加え P1ファージエンハンサー 各種発現用プロモーター ポリアデニン付加シグナルは 哺乳類細胞内で翻訳されないため病原性等をもたない : 省略可 7. 本実験に使用する組換えアデノ随伴ウイルスおよび組換えレンチウイルスは自己増殖に必要な遺伝子を欠失しているため二次的なウイルス粒子を産生 ( 増殖 ) し 伝播することはなく 大臣確認実験には該当しない ウイルス粒子から毒素は産生しない 組換えアデノ随伴ウイルスおよび組換えレンチウイルスのバイオセーフティーレベルは 各々レベル1およびレベル2である 26

27 記入例 例1). ヒト 遺伝子をHeLa細胞cDNAからPCRで増幅さpcDNA3発現ベクターにクローニングし ヒト培養細胞(293T細胞)に発現させる (医学部基礎棟5階 使用) カルタヘナ法では培養細胞は宿主として扱われません 核酸供与体(生物種) 宿主 実験分類 備考 ヒト 大腸菌 DH5a P1 OO遺伝子 CMV(Cytomegalovirus 大腸菌 DH5a P1 早期プロモーター SV40(Simian virus 40 大腸菌 DH5a P1 polya付加シグナル 認定宿主ベクター系 宿主 核酸供与体ともクラス1 認定宿主ベクター系 宿主はクラス１で 核酸供与体CMV SV40はクラス2であるが この供与核酸は同定済み かつ 哺乳動物 等に対する病原性 伝達性に関与しないこ とが推定される ベクターの特性 pcdna3(invitrogen社)は哺乳類細胞発現用プラスミドベクターで トランスフォームする大腸菌(DH5a)の組み合わせ は認定宿主ベクター系である(B1) 核酸供与体及び供与核酸の特性 ヒトOOcDNA(クラス１)は同定済み遺伝子 かつ 哺乳動物等に対する病原性 伝達性に関与しないことが推定される pcdna3はアンピシリン耐性遺伝子 目的遺伝子発現用CMVプロモーター ポリアデニン付加シグナル SV40エンハン サー プロモーター ネオマイシン耐性遺伝子を有する P1実験室で使用するが 使用したチップ 容器 培地等はオートクレーブをかけた後 廃棄する 27

28 例 2). HIV1 ゲノムを組み込んだプラスミドを 大学医学部 氏より分与してもらい ( 文献 ) これを鋳型に PCR をかけ エンベロープタンパク質 p120 を pcdna3 発現ベクターにクローニングし 293T 細胞にトランスフェクトする 尚 プラスミドが導入された細胞を容易に同定するため EF1a プロモーターから GFP 蛍光タンパク質遺伝子が発現するように pcdna3 を改変した ( 医学部基礎棟 5 階 使用 ) 核酸供与体 ( 生物種 ) 宿主実験分類備考 オワンクラゲ大腸菌 (DH5a) P1 GFP 遺伝子 ヒト 大腸菌 (DH5a) P1 EF1aプロモー ター CMV(Cytomegalovirus) 大腸菌 (DH5a) P1 早期プロモーター SV40(Simian virus 40) 大腸菌 (DH5a) P1 polya 付加シグ ナル HIV1(Human immunodeficiency virus type1) 大腸菌 (DH5a) P1 gp120 遺伝子 認定宿主ベクター系 宿主 核酸供与体ともクラス 1 認定宿主ベクター系 核酸供与体はそれぞれ クラス 2 クラス 3 であるが 供与核酸である CMV プロモーター SV40polyA 付加シグナル HIV1-gp120 は同定済み かつ 哺乳動物等に対する病原性 伝達性に関与しないことが推定される ( 文献 GILSP 参照 ) ベクターの特性 pcdna3(invitrogen 社 ) は哺乳類細胞発現用プラスミドベクターで トランスフォームする大腸菌 (DH5a) の組み合わせは認定宿主ベクター系である (B1) EF1a プロモーターから GFP 蛍光タンパク質遺伝子が発現するように pcdna3 を改変した ( 添付書類のプラスミド マップを参照 ) 核酸供与体及び供与核酸の特性 HIV1はクラス3であるが 供与核酸であるHIV1-gp120は同定済み かつ 哺乳動物等に対する病原性 伝達性に関与しないことが推定される 上記認定宿主ベクター系の大腸菌でエンベロープタンパク質 gp120をプラスミドにクローニングし 増やしても この組換え体は通常の自然環境において生育不可能であり 組換え生物の残存性ならびに他の生物への伝染性はない さらに この組換え体を293T 培養細胞にトランスフェクトしても感染性のウイルスは産生せず この組換え生物の残存性 他の生物への伝染性はない 実験室外での増殖はほとんど不可能である pcdna3はアンピシリン耐性遺伝子 目的遺伝子発現用 CMVプロモーター ポリアデニン付加シグナル SV40エンハンサー プロモーター ネオマイシン耐性遺伝子を有する P1 実験室で使用するが 使用したチップ 容器 培地等はオートクレーブをかけた後 廃棄する 28

29 例 3). 大腸菌を用いたリコンビナントタンパク質の調製 :BSL3 のウイルス HIV-1 型の gag-24 遺伝子をプラスミド (pet28a) に組み込んだものを 大学 氏より分与してもらう ( 文献 ) これを大腸菌 [BL21(DE3)] に導入し リコンビナントタンパク質を調製する ( 医学部基礎棟 5 階 使用 ) 核酸供与体 ( 生物種 ) 宿主実験分類備考 T7ファージ 大腸菌 (BL21) P1 T7 RNA Polymerase 遺伝子 l7 ファージ大腸菌 (BL21) P1 DE3 遺伝子 HIV1(Human immunodeficiency virus type1) 大腸菌 (BL21(DE3)) 認定宿主ベクター系 宿主 核酸供与体ともクラス 1 大腸菌 (BL21(DE3)) は遺伝子組換え体である P1 gag-24 遺伝子 認定宿主ベクター系 核酸供与体はクラス3であるが 供与核酸であるgag-24 遺伝子は核酸が同定済み かつ その組換え体のみでは哺乳動物等に対する病原性 伝達性に関与しないことが推定される ( 文献 GILSP 参照 ) ベクターの特性 pet28a (Novagen 社 ) は添付したプラスミドマップ及び説明書に示すように大腸菌発現用プラスミドベクターで トランスフォームする大腸菌 (BL21(DE3)) の組み合わせは認定宿主ベクター系である (B1) 核酸供与体及び供与核酸の特性 T7 ファージの RNA Polymerase 遺伝子 λ ファージの DE3 遺伝子は大腸菌 BL21 の認定宿主ベクター (B1) としての特性を変えるものではない pet28a はカナマイシン耐性遺伝子 目的遺伝子発現用 T7 プロモーター配列 ターミネーター配列 laci リプレッサー遺伝子 f1 origin His-tag(HHHHHH) T7-tag(MASMTGGQQMG) を有する HIV-1 はクラス 3 であるが 供与核酸である gag-24 遺伝子は核酸が同定済み かつ その組換え体のみでは哺乳動物等に対する病原性 伝達性に関与しないことが推定される 上記認定宿主ベクター系の大腸菌でウイルスタンパク質 gag-24 をプラスミドにクローニングし 増やしても この組換え体は通常の自然環境において生育不可能であり 組換え生物の残存性ならびに他の生物への伝染性はない 使用したチップ 容器 培地等はオートクレーブをかけた後 廃棄する 29

30 例 4). 大腸菌を用いたリコンビナントタンパク質の調製 :BSL3 の細菌遺伝子 をプラスミド (pet28a) に組み込んだものを 大学 氏より分与してもらう ( 文献 ) これを大腸菌 [BL21(DE3)] に導入し リコンビナントタンパク質を調製する ( 医学部基礎棟 5 階 使用 ) 核酸供与体 ( 生物種 ) 宿主実験分類備考 T7ファージ 大腸菌 (BL21) P1 T7 RNA Polymerase 遺伝子 l7 ファージ大腸菌 (BL21) P1 DE3 遺伝子 BSL3 細菌 大腸菌 (BL21(DE3)) 認定宿主ベクター系 宿主 核酸供与体ともクラス 1 大腸菌 (BL21(DE3)) は遺伝子組換え体である P3 OO 遺伝子 認定宿主ベクター系 核酸供与体はクラス3で 供与核酸は同 定済みだが 哺乳動物等に対する病原性 伝達性に関与しない と言えない ベクターの特性 pet28a (Novagen 社 ) は添付したプラスミドマップ及び説明書に示すように大腸菌発現用プラスミドベクターで トランスフォームする大腸菌 (BL21(DE3)) の組み合わせは認定宿主ベクター系である (B1) 核酸供与体及び供与核酸の特性 T4 ファージの RNA Polymerase 遺伝子 λ ファージの DE3 遺伝子は大腸菌 BL21 の認定宿主ベクター (B1) としての特性を変えるものではない pet28a はカナマイシン耐性遺伝子 目的遺伝子発現用 T7 プロモーター配列 ターミネーター配列 laci リプレッサー遺伝子 f1 origin His-tag(HHHHHH) T7-tag(MASMTGGQQMG) を有する BSL3 の細菌遺伝子 は同定済みだが 哺乳動物等に対する病原性 伝達性に関与しないと言えないので P3 実験室でのみ使用する 使用したチップ 容器 培地等はオートクレーブをかけた後 廃棄する ( 注 ) 毒性等 その遺伝子の特性がわかっているときはそれを記載する 30

31 例 5). ウイルスベクターを用いた動物細胞および動物個体への遺伝子導入と感染実験 : Invitrogen 社のキット (Block-iT Inducible H1 Lentiviral RNAi System) を用いて Ifnar1 の遺伝子のノックダウンするリコンビナントレンチウイルスベクターを作製し Jurkat 細胞に導入する ( 医学部基礎棟 5 階 使用 ) さらにこのベクターをマウス (WT 及び Irf1KO マウス ) の脳に遺伝子導入する ( 動物実験施 使用 ) 核酸供与体 ( 生物種 ) 宿主実験分類備考 非病原性大腸菌マウス P1A ネオマイシン耐性遺伝子 マウス 大腸菌 (DH5a) P1 マウスIfnar1 遺伝子のshRNA 作成 用合成 DNA マウス レンチウイルス ( 組換え 増殖欠失 ) レンチウイルス ( 組換え 増殖欠失 ) P2 マウス Ifnar1 遺伝子の shrna 作成用合成 DNA マウス P2A レンチウィルスゲノムはマウスに接種さ れマウスゲゲノム内に組み込まれる Irf1KO マウスは動物実験の申請済 ( 申請書の添付 ) 認定宿主ベクター系 宿主 核酸供与体ともクラス 1 宿主のレンチウイルスはクラス 2 この Lentiviral RNAi System の説明書を添付 マウス 大腸菌 (DH5a) P1 U6プロモーター Kitに含まれるpLenti6/H1-shRNAを構成的に shrnaを発現させるため マウスU6プロモーター に置換したので そのプラスミド マップを添付 ベクターの特性 Invitrogen 社のキット (Block-iT Inducible H1 Lentiviral RNAi System) の説明書 及びプラスミド マップを添付した 要約 すると リコンビナントウイルスの構造やゲノムパッケージング用のコンポーネントをコードする遺伝子は 4つのプラスミド (gag/pol, env, rev, plenti6/h1-shrna) にわけられており このシステムで作成されたレンチウイルスパーティクルは 複製能力がなく目的の遺伝子をキャリーしているだけで他のウイルス種をつくりださない また 3 LTRが欠失している自己不 活性化ベクターであり 宿主ゲノムに組み込まれる際に 5 LTRに存在するプロモーターが不活性化され 内部プロモーターで あるInducible H1によりshRNAの転写が起こる このinducible H1プロモーターを 構成的に発現させるマウスU6プロモー ターに置換した 核酸供与体の特性マウスIfnar1 遺伝子 ( クラス1) は同定済み遺伝子 かつ 哺乳動物等に対する病原性 伝達性に関与しないことが推定される ノックダウンに使用するshRNA 作成用合成 DNAも哺乳動物等に対する病原性 伝達性に関与しないことが推定される 改変 plenti6はアンピシリン耐性遺伝子 shrna 発現用マウスU6プロモーター ターミネーター SV40プロモーター ブラストシジンS 耐性遺伝子を有する 31 使用したチップ 容器 培地等はオートクレーブをかけた後 廃棄する

32 例 6). バキュロウイルスを用いて作製したリコンビナントタンパク質の購入 : Invitrogen 社よりヒト リコンビナントタンパク質を購入するが タンパク溶液からバキュロウイルスを完全に除去できていない旨 情報提供があったため 当該実験を申請する ( 医学部基礎棟 5 階 使用 ) 核酸供与体 ( 生物種 ) 宿主実験分類備考 ヒト Baculovirus P1 遺伝子 認定宿主ベクター系ではない 宿主 核酸供与体ともクラス 1 ベクターの特性 Bac-to-Bac システム (Invitrogen) を使用して作成したヒト リコンビナントタンパク質を購入 バキュロウイルス発現ベクター pfastbac1 は リコンビナントタンパク質発現用バキュロウイルス ベクターで バキュロウイルスのポリヘドリン プロモーター SV40 の polya 付加シグナルを持つ 130kDa のバキュロウイルス DNA を持つ大腸菌 (DH10BAC) をトランスフォームして リコンビナント バキュロウイルスを作成したもの このリコンビナント バキュロウイルスは哺乳動物等の細胞に感染はするが 増殖しない ( 添付の説明書 プラスミド マップを参照 ) ただし 認定宿主ベクター系ではない 核酸供与体及び供与核酸の特性ヒト OO 遺伝子 ( クラス 1) は同定済み遺伝子 かつ 哺乳動物等に対する病原性 伝達性に関与しないことが推定される バキュロウイルスはクラス 1 で 遺伝子は同定済み かつ 哺乳動物等に対する病原性 伝達性に関与しないことが推定される pfastbac1 はゲンタミシン耐性遺伝子 目的遺伝子発現用ポリヘドリン プロモーター SV40 ポリアデニン付加シグナル トランスポゾン Tn7 アンピシリン耐性遺伝子を有する 使用したチップ 容器 培地等はオートクレーブをかけた後 廃棄する 32

33 例 7). Bac-to-Bac システム (Invitrogen) で作製した A 型インフルエンザウイルス (H1N1 WSN 株 )NP タンパク質をバキュロウイルスを用いて合成させる ( メーカーのマニュアルを添付 ) ( 医学部基礎棟 5 階 使用 ) 核酸供与体 ( 生物種 ) 宿主実験分類備考 Influenza virus type A (H1N1 WSN 株 ) Baculovirus P2 NP 遺伝子 保有細胞はSf9 昆虫 細胞 Baculovirus 大腸菌 (DH10B) P1 130 kb Baclulovirus DNA in a BAC Baculovirus 大腸菌 (DH10B) P1 ポリヘドリン プロモー ター SV40(Simian virus 40) 大腸菌 (DH10B) P1 polya 付加シグナル 認定宿主ベクター系ではない 宿主はクラス 1 核酸供与体はクラス 2 またはクラス 1 保有細胞を記載 認定宿主ベクター系 宿主 核酸供与体ともクラス 1 ベクターの特性 Bac-to-Bac システム (Invitrogen) の説明書 プラスミド マップを添付した バキュロウイルス発現ベクター pfastbac1 は リコンビナントタンパク質発現用バキュロウイルス ベクターで バキュロウイルスのポリヘドリン プロモーター polya 付加シグナルを持つ BAC(bacteriall artificial chromosome) に乗った 130kDa のバキュロウイルス DNA を持つ大腸菌 (DH10BAC) をトランスフォームして リコンビナント バキュロウイルスを作成する このリコンビナント バキュロウイルスは哺乳動物等の細胞に感染はするが 増殖しない ただし 認定宿主ベクター系ではない 核酸供与体及び供与核酸の特性 A 型インフルエンザウイルス (H1N1 WSN 株 ) はクラス 2 であるが 供与核酸である核タンパク質 NP 遺伝子は核酸が同定済み かつ その組換え体のみでは哺乳動物等に対する病原性 伝達性に関与しないことが推定される バキュロウイルスはクラス 1 で 遺伝子は同定済み かつ 哺乳動物等に対する病原性 伝達性に関与しないことが推定される pfastbac1 はゲンタミシン耐性遺伝子 目的遺伝子発現用ポリヘドリン プロモーター SV40 ポリアデニン付加シグナル トランスポゾン Tn7 アンピシリン耐性遺伝子を有する 使用したチップ 容器 培地等はオートクレーブをかけた後 廃棄する 33

34 核酸供与体 ( 生物種 ) 宿主 ベクターの確認 DNA 供与体 宿主の区分は 下記のサイトを参考にして 注意深く記載してください 研究開発等に係る遺伝子組換え生物等の第二種使用等に当たって執るべき拡散防止措置等を定める省令の規定に基づき認定宿主ベクター系等を定める件平成 16 年文部科学省告示第 7 号最終改正 : 平成 26 年 7 月 1 日 改正点についてはこちらを参照 研究開発等に係る遺伝子組換え生物等の第二種使用等に当たって執るべき拡散防止措置等を定める省令の規定に基づき認定宿主ベクター系等を定める件の一部を改正する告示 ( 平成 26 年 7 月 1 日 ) についての解説 ( 34

35 核酸供与体(生物種) 宿主 ベクターの確認 認定宿主ベクター系 35

36 核酸供与体 ( 生物種 ) 宿主 ベクターの確認 特定認定宿主ベクター系 36

37 核酸供与体(生物種) 宿主 ベクターの確認 クラス１ クラス２ 37

38 核酸供与体 ( 生物種 ) 宿主 ベクターの確認 38

39 Competent cell: BL21(DE3) は 遺伝子組換え体です (1) 宿主情報宿主名 : BL21( 由来 : E.coli B 株 ) 導入遺伝子 : T7 RNA Polymerase 遺伝子 ( 由来 : T7 ファージ ) DE3 遺伝子 ( 由来 : λ ファージ ) (2) 遺伝子型 F, ompt, hsdsb (rb, mb ), dcm, gal, λ(de3), plyss (Cmr) 39

40 11 使用する実験室 次頁に解説 室名 部屋番号をアップロードした図面で確認して下さい ( 注 10) 1 登録していない部屋を使用する場合には 組換え DNA 実験安全委員の現地確認が必要です 調査委員に計画書の写しを送付できるよう準備願います 登録していない新規の施設 設備を利用する にチェックを入れて下さい 必ずその他参考となる事項欄に 実験室調査依頼中 である旨コメントを入れて下さい 組換え DNA 実験安全委員会の HP より実験施設設置 変更申請書を入手し作成して下さい 2 現地確認後設置承認通知が送付されますので 承認通知書及び組換え DN A 実験施設設置 変更申請書 ( 部屋の詳細図 フロア図含む ) をその他参考事項となる事項に添付した上で従来の申請手続きをおこなってください ( 実験室調査依頼中 のコメントは削除すること ) 40

41 どこの実験室を使用するのか? 1. 使用を希望する実験室の BSL( バイオセーフティーレベル ) の確認実験計画の内容に基づいて決定したレベル以上の実験室を使用して下さい 組換え DNA 実験室として登録してある実験室名登録されてない実験室 部局の委員に事前相談 申請後委員の現地調査を受けて登録 (P1: 調査委員 1 名 P2 以上 : 調査委員 2 名 ) 2. 申請者の実験室外で実験を行う場合 実験室の責任者に使用の許可を得てください 組換え DNA 実験室の入り口に責任者名が表記されている 例 : 動物実験 エリア別 棟 : 動物実験施改修 A 棟 (A343) 封じ込めレベル : P1A ( 図面 :animal a P1A.pdf) 41

42 12 関連する実験の申請書 例 ) 動物実験申請書 ( または申請状況を記載する ) 遺伝子改変動物を入手して使用する場合 入手先を記載 : 学外からの譲渡等の場合は譲渡の計画書と先方からの情報提供書 以前の実験の継続のため新規に申請する場合 以前の申請書 PDF ファイルや画像ファイルを添付資料としてアップロードできます 特にウイルス作成用のベクターや 一般的でないベクターについては マップをアップロードして下さい FAQ3) 参照する実験計画書のリンク方法プルダウンすると 動物か遺伝子か聞いてきますので どちらかを選択後 左の整理番号を入力してリターンボタンをクリックすると自動的にリンクします 42

43 13 訂正箇所 修正等のために差し戻された場合 再提出の際 修正した点について まとめて記載して下さい 43

44 変更申請について xxxxxxxxx 14 変更 追加申請ここをクリックして下さい 44

45 15 変更事項 変更理由 訂正箇所を記入して下さい 変更申請について 組換え DNA 実験講習会受講歴 健康診断受診年月の更新もすること 変更申請で OK なのは 実験従事者の削除 追加 所属等変更 同じクラスの核酸供与体の追加など軽微な変更 ( ただし DNA 供与体の種の追加については 科が同じであれば P1 レベルのみ変更 追加申請 ) xxxxxxxxx 例 ) 実験従事者として以下の2 名を追加 薬学部学部生 薬学部学部生 部局担当者 組換え DNA 実験を行うため 委員長決裁 異なるクラスの核酸供与体の追加や実験室の追加 変更も可 ( 実験責任者 課題名 実験の目的等の重大な変更については変更ではなく新規の計画として申請すること ) 部局担当者 委員長判断で 委員長決裁もしくは委員全員の審査に委ねるかを決定 45

46 大臣確認実験申請書 ( 第二種使用等拡散防止措置確認申請書 ) 申請書の様式は 文部科学省の遺伝子組換え実験の HP からダウンロードできます n901_00.doc 記入法や注意点は 文部科学省の遺伝子組換え実験の HP 遺伝子組換え生物等の第二種使用等の手引き および日本ウイルス学会の HP を参照してください 記入例 ) anzen/carta_expla08.pdf 46

47 大臣確認が必要な実験とは 1 生物多様性への影響が明らかになっていない 2 生物多様性への影響が高い 3 組換え技術により生物多様性への影響を引き起こすと考えられる性質が付与される ものである場合 大臣確認が必要な 実験 は省令別表第一にあり 概要は以下の通りです 実験の種類 ( 省令第 2 条に規定 ) ごとに 宿主と核酸供与体の実験分類等 ( 省令第 3 条 告示に規定 ) の条件から 大臣確認の要否が分かります 1 微生物 1 実験 実験分類が定まっていないもの ( ただし いくつかの条件を満たす場合は 大臣確認は不要となります 詳細はお問合せ下さい ) 宿主または核酸供与体の実験分類のいずれかがクラス 4 宿主の実験分類がクラス 3 認定宿主ベクター系を用いてなく 核酸供与体の実験分類がクラス 3 であるもののうち 以下のいずれか 1 供与核酸が同定済核酸ではないもの 2 供与核酸が同定済核酸であり 哺乳動物等 2 に対する病原性又は伝達性に関連するもの かつ宿主の病原性を著しく高めることが科学的知見に照らし推定されるもの 宿主の実験分類がクラス 2 であり 供与核酸に薬剤耐性遺伝子 ( 当該微生物に感染した哺乳動物等 2 の治療を困難にするものに限る ) を含むもの ( ウイルス ウイロイドは本規定適用外 ) 自立的な増殖力及び感染力を保持したウイルス ウイロイドであり 使用等を通じて増殖するもの (Human retrovirus 以外の Retrovirus Baculovirus 植物ウイルス等の例外あり 告示別表第 3 も参照 ) 供与核酸が蛋白質毒素にかかる遺伝子を含むもの ( 哺乳動物等 2 に対する半数致死量が 100μg/kg 以下の場合 宿主が大腸菌である認定宿主ベクター系の場合は 100ng/kg 以下 ) 2 大量培養実験 1 の条件に該当するもの 認定宿主ベクター系を用いていない遺伝子組換え生物等であって 宿主又は核酸供与体の実験分類がクラス 2 であるもののうち 供与核酸が哺乳動物に対する病原性又は伝達性に関連し その特性により宿主の病原性 ( 哺乳動物等 2 に対する病原性 ) を著しく高めることが推定されるもの 特定認定宿主ベクター系を用いていない遺伝子組換え生物等であり 核酸供与体の実験分類がクラス 3 であるもの 省令にある条件 (P13 ホ参照 ) を満たさない生物等について LSC の拡散防止措置を執るもの (LSC とできない場合あり ) 3 動物 3 使用実験 1 の条件に該当するもの 宿主が動物 3 であり 供与核酸が哺乳動物等 2 に対する病原性がある微生物等 1 の感染を引き起こす受容体を付与するもの ( 例えば 昆虫やマウス等に対して ヒトに感染する病原体の受容体を付与するものが該当します ) 省令にある条件 (P15 ホ参照 ) を満たさない生物等について 特定飼育区画の拡散防止措置を執るもの ( 特定飼育区画に変更できない場合もあります ) 4 植物等使用実験 1 の条件に該当するもの 省令にある条件 (P17 ホ参照 ) を満たさない生物等について 特定網室の拡散防止措置を執るもの ( 特定網室に変更できない場合もあります ) 5 すべての細胞融合実験 ( 注 ) カルタヘナ法での細胞融合実験とは 異なる分類学上の科に属する生物の細胞を融合する技術の利用により得られた核酸又はその複製物を有する生物に係る遺伝子組換え実験 とされています ( 法第 2 条 省令第 2 条参照 ) 1 微生物等 : 菌界 ( きのこ類除く ) 原生生物界 原核生物界に属する生物 ウイルス ウイロイド( きのこ類の実験は 植物等使用実験に含みます ) 2 哺乳動物等 : 哺乳網 鳥網に属する生物 47 3 動物等 : 動物界に属する生物 ( 鳥 魚 昆虫などを含みます )

48 第二種使用等に係る大臣確認の手続きの流れと審査スケジュールについて 実験実施機関における実験の企画 立案 実験実施機関から文部科学省研究振興局ライフサイエンス課への連絡 < 申請書のドラフトを送付 > 委員会開催日の 1 か月前位 文部科学省研究振興局ライフサイエンス課担当官による申請書の事前チェック 事前チェック終了後 担当官の連絡を受けてから 申請書 ( 職印付き ) を提出 委員会開催日の 10 日 -2 週間前位 文部科学省科学技術 学術審議会生命倫理 安全部会組換え DNA 技術等専門委員会による審議 ( 年 6 回程度開催 ) 審議終了後 文部科学大臣による確認 通常 委員会開催後 2-3 週間程度 確認 ( 公文受理 ) 後 実験実施機関における実験の開始 48

49 実験実施場所および保管施設に必要な表示について 遺伝子組換え実験時は 実験内容に応じた表示をし 扉は閉める ( 遺伝子組換え生物等の培養 飼育および栽培も含む 実験に使用する遺伝子 組換え生物等を実験室で保管する場合も 法令上は 実験中 となりますので 同様の措置を取ってください ) 実験を行わず 実験室の扉を開放する場合は 表示をしない 実験中を示す表示をしている場合は 実験室の扉を閉めておく 扉の開放 閉鎖にかかわらず 外部の者がみだりに立ち入らぬように 関係者以外立ち入り禁止 の表示を行う 実験の種類 拡散防止措置区分 拡散防止措置区分応じた表示 微生物使用実験 P1 ( 表示義務がありません ) P2 P2 レベル実験中 動物使用実験 1 P1A 遺伝子組換え動物等飼育中 P2A 遺伝子組換え動物等飼育中 (P2) 植物等使用実験 1 P1P 遺伝子組換え植物等栽培中 P2P 遺伝子組換え植物等栽培中 (P2) 1 動物使用実験は動物作成実験と動物接種実験を 植物等使用実験は植物等作成実験と 植物等接種実験を含みます 49

50 実験実施場所および保管施設に必要な表示について 実験室の扉 冷蔵 冷凍庫 組換え体保管中 (P2) XXXXXX XXXX 50

51 組換え体の授受について 遺伝子改変動物 ( ノックアウトマウス トランスジェニックマウスなど ) 遺伝子組換え生物 ( 細菌等 ) 購入する もらって導入する あげる 預ける 1. 譲渡 提供 委託の計画書を組換え DNA 実験安全委員会に提出情報提供書も付けてください 学内様式 : 遺伝子組換え生物等の譲渡の計画書 ( 様式 1)(Word ファイル ) 学内様式 : 遺伝子組換え生物等の譲渡 提供 委託に際しての情報提供書 ( 様式 2)(Word ファイル ) 学内様式 : 遺伝子組換え生物等の譲受の計画書 ( 様式 3) (Word ファイル ) 学内様式 : 遺伝子組換え生物等の購入の計画書 ( 様式 4)(Word ファイル ) 海外へ輸出する場合は 第 37 条 3 項の規定により 様式 14 の表示が必要です 2. 組換え DNA 実験安全委員会の承認をもらう 3. 実際に 遺伝子改変動物 遺伝子組換え生物のやり取りを行う ( 譲渡の際は 情報提供書を先方に必ず渡すこと ) ( 重要 ) HP の組換え DNA 実験関係様式内の下記遺伝子組換え生物の本学への譲受及び搬入について ( 様式 3) 遺伝子組換え生物の本学への購入及び搬入について ( 様式 4) のいずれにおいても 組換え DNA 実験承認申請書 をプリントアウトし 譲受 購入に対応する遺伝子組換え生物の核酸供与生物種と宿主の対応が判るように 供与体 ベクター 宿主の組合せ 欄の各項目に下線やマーカーペンでハイライトしたものを添付して下さい 51 不明な点があれば 申請前に部局の組換えDNA 実験安全委員会委員にご相談下さい

52 組換え DNA 実験 注意項目 組換え DNA 実験に携わっている研究者の方々は 下記項目のお忘れはございませんか 該当がありましたら 直ちに手続き等をお願い致します 実験期間は過ぎていませんか ( 実験期間が過ぎたら 実験及び組換え体の保有もできません ) 実験期間を延長したい場合 実験期間内に変更申請は出されていますか (5 年以内であれば延長できます ) 実験期間 (5 年間 ) を終了後も実験したい場合 実験期間内に新規申請は出されていますか ( 期間終了の 2 ヶ月前までに ) 計画書にない組換え体はありませんか 計画書にない実験従事者はいませんか 登録されていない実験室で 実験及び組換え体の保有をしていませんか ( 登録がされていない実験室は 新規設置申請が必要です ) 使用している実験室では 登録されている拡散防止措置の区分どおりの実験を行っていますか ( 拡散防止措置の区分に応じた登録がされています P1,P2,P1A など ) 実験が終了したら 終了報告書及び実験記録簿は提出しましたか 1 年に 1 回 健康診断は受けていますか 3 年に 1 回以上 組換え DNA 講習会 ( 又は DVD 講習 ) を受けていますか 52

53 長崎大学組換え DNA 実験 部局事務問合せ先 部局内線直通電話 医歯薬学総合研究科 医歯薬学術協力課学事係 ( 病 )2053 ( 直 ) 原爆後障害医療研究所先導生命科学研究支援センター医学部歯学部薬学部病院 病院総務課総務 ( 病 )2540 ( 直 ) 熱帯医学研究所 熱研支援課支援班 ( 病 )7803 ( 直 ) 工学部 工学研究科 文教地区事務部工学部総務班 ( 本 )3281 ( 直 ) 水産学部 文教地区事務部水産学部総務班 ( 本 )3414 ( 直 ) 環境科学部 文教地区事務部環境科学部総務班 ( 本 )2713 ( 直 ) 教育学部 文教地区事務部教育学部総務班 ( 本 )2263 ( 直 ) 長崎大学事務局 研究国際部研究企画課 ( 本 )3500 ( 直 )