は除外した当試薬の目的疾患である全身性エリテ Table 1 マトーデス SLE 混合結合組織病 MCTD シェーグレン症候群 SjS 強皮症 SSc および多発性筋炎皮膚筋炎 PM/DM を目的疾患関節リウマチ RA 原発性胆汁性肝硬変 PBC ANCA anti-n

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しょうこつねざき
5 years ago
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1 技術論文 CLEIA 法を原理とする抗核抗体測定試薬の評価古村菜穂子 1) 小松和典 1) 1) 帝京大学医学部附属病院中央検査部 ) 帝京大学医学部内科 3) 帝京大学医学部臨床検査医学要河野肇 2) 古川泰司 3) 東京都板橋区加賀旨抗核抗体の検出は膠原病のスクリーニング検査に用いられ間接蛍光抗体法が広く用いられてきたが特異性や迅速性に欠けていた今回化学発光酵素免疫測定法を原理とする全自動臨床検査システム STACIA 搭載試薬ステイシア MEBLuxTM テスト ANA の基礎的検討を行った基本性能は概ね良好であり従来法である間接蛍光抗体法と比較して感度特異度ともに良好な結果が得られた本法は従来法と比較して測定時間が大幅に短縮されるため膠原病のスクリーニング検査として有用であると考えられるキーワード抗核抗体化学発光酵素免疫測定法迅速検査 I はじめに II 抗核抗体の測定は古くから間接蛍光抗体法材料および方法 1 対象 indirect immunofluorescence 以下 IIF 法が用いら本研究は当院中央検査部で試薬基本性能評価をれ HEp-2 細胞が核材として用いられるようになっ行い以下に示す臨床検体に対して病歴情報調査をてからは感度が飛躍的に上昇した反面健常人で行った単一施設後ろ向き横断研究である本研究の陽性率が高い手技が煩雑である施設間差が無は帝京大学医学部倫理委員会による承認帝倫視できないなどの問題点もあげられている号を得て実施した 1 ) 5 ) こうした問題点を解決すべく各種 enzyme immuno 2012 年 6 月より 2013 年 4 月の期間に当検査部 assay EIA 法が開発され IIF 法と同等またはそれに抗核抗体の検査依頼があった検体を用いた組み以上の性能を有することが報告されている入れ基準に適合する検体を 199 例選別し以下に述 6 ), 7 ) 今回自動分析機での測定が可能で測定時間がべる IIF 法と CLEIA 法両方の測定を施行した特異大幅に短縮された化学発光酵素免疫測定法抗体の検出は必要に応じて医学生物学研究所に chemiluminescent enzyme immunoassay 以下 CLEIA CLEIA 法による測定を依頼した検体の組み入れ基法を原理とする抗核抗体スクリーニング試薬が上準は 1 観察期間内での同一症例初回検査 2 以市され臨床検体を用いた検討の機会を得たので報下に述べる病名が診断されている 3 溶血等検査結告する果に影響する検査前プロセスでの障害がないである目的疾患関連疾患および両者に分類されない対照例の検体を選び 3 群間で結果を比較した目的疾患関連疾患が複数重複して診断されている例平成 28 年 4 月 4 日受付平成 28 年 9 月 13 日受理医学検査 Vol.65 No

2 は除外した当試薬の目的疾患である全身性エリテ Table 1 マトーデス SLE 混合結合組織病 MCTD シェーグレン症候群 SjS 強皮症 SSc および多発性筋炎皮膚筋炎 PM/DM を目的疾患関節リウマチ RA 原発性胆汁性肝硬変 PBC ANCA anti-neutrophil cytoplasmic antibody 関連血管炎およ STACIA MEBLuxTM test ANA Principle of measurement CLEIA The measurement time required 19 minutes Recognized antigens (relevant diseases) びベーチェット病を関連疾患とした 2 測定機器全自動臨床検査システム STACIA LSI メディエンス 3 測定試薬検討試薬としてステイシア MEBLuxTM テスト ANA 医学生物学研究所を対照試薬としてフル Table 2 Test sample オロ HEPANA テスト医学生物学研究所を使用した 4 測定原理 1 CLEIA 法核抗原を結合した磁性粒子と検体中の抗核抗体を反応させ集磁して洗浄後酵素標識抗体アルカリホスファターゼ標識抗ヒトイムノグロブリンポリクローナル抗体を反応させると核抗原結合磁性粒子抗核抗体アルカリホスファターゼ標識抗ヒトイムノグロブリンポリクローナル抗体の免疫複合物を生じるこれを再度集磁して洗浄後基質液 2- dsdna (SLE, MCTD) U1RNP (MCTD,SSc) U1, U2, U4/U6, U5 RNP (SLE, MCTD) hy1 hy5 RNP (SjS, SLE) RNA polymerase III transcription termination factor (SjS, SLE) DNA topoisomerase I (SSc) Centromere (CREST) histidyl-trna synthetase (PM/DM) Case (male/female) Age All Disease 199 (49/150) Purpose disease 106 (12/94) Systemic lupus erythematosis Mixed connective tissue disease Sjogren s syndrome Scleroderma Polymyositis/dermatomyositis 33 (3/30) 13 (2/11) 26 (2/24) 23 (3/20) 11 (2/9) Related disease 41 (10/31) Rheumatoid arthritis Primary biliary cirrhosis ANCA-associated vasculitis Behcet s disease 17 (3/14) 6 (0/6) 14 (6/8) 4 (1/3) Control 52 (27/25) クロロ-5-(4-メトキシスピロ{1,2-ジオキセタン-3,2' 5'-クロロ -トリシクロデカン}-4 イル)-1-フェニルホスフェート二ナトリウム CDP-Star を加えると CDP-Star は複合体中のアルカリホスファターゼにより加水分解され発光するこの発光カウントを測定することによりあらかじめ作成した標準曲線をもとに検体中の抗核抗体の有無を検出する結果は Index 値として算出される使用抗原については Table 1 に示す通りである 2 IIF 法核材としてヒト咽頭癌由来 HEp-2 細胞標識抗体として蛍光色素 fluorescein isothiocyanate; FITC 標識抗ヒトイムノグロブリンを用いるスライド上の核材と希釈した検体を反応させ PBS で洗浄後標識抗体を反応させ再度 PBS で洗浄封入後蛍光顕微鏡で鏡検し判定するカットオフ値は当院の基準値である 80 倍とした III 結果 Table 2 に組み入れ対象となった検体数性別年齢を群ごと疾患ごとに示すまた多変量解析により目的疾患の有無について性別年齢の優位性を確認したところ性別で p = 年齢で p = であり交絡現象は認められないことを確認した 1 再現性試薬安定性添付文書に記載されているカットオフ Index 値 10.0 を基準とし低濃度中濃度高濃度の検体について検討した時 Index 値の同時再現性は CV % n = 10 日差再現性は CV % n = 5 であった Table 3 また同一ボトルの試薬を用いてキャリブレーションをせずに測定し測定機器内での試薬安定性を検討したところ 30 日間は安定した結果が得られた 630 古村他 CLEIA 法を原理とする抗核抗体測定試薬の評価

3 CLEIA Index N =199 Ho: Homogeneous N = 25 r = Sp: Speckled N = 73 p Nu: Nucleolar N = 8 Ce: Centromere/Discrete speckled N = 31 Nm: Nuclear membrane N = 2 Negative N = Cut oﬀ value 0.0 < ,280 2,560 5,120 10,240 IIF Titer Figure 1 Correlation between CLEIA and IIF Table 3 とした 199 例についての ROC 分析を行うと ROC 曲 Reproducibility Within-run variation (N = 10) Between-Day variation (N = 5) Low Middle High Low Middle High Mean SD CV (%) 線下面積 area under the curve; AUC は IIF 法で %信頼区間 CLEIA 法で %信頼区間となった Figure 2 5 各疾患の陽性率と Index 値の分布各疾患の陽性率は SLE MCTD で 100.0% SjS で Index 96.2% SSc で 95.7% PM/DM で 36.4%であった 2 検出限界有意差が認められた Figure 3 標準液を段階希釈したものをおのおの 20 回測定した時 0 濃度の Count 値の平均値+2SD が平均値 2SD と重ならない Index 値はであった 3 IIF 法との比較 199 例について IIF 法の定量値と CLEIA 法の Index 値を比較したところ相関係数 r = p となった Figure 1 添付文書に従いカットオフ Index 値を 10.0 とした時の両法の判定一致率また目的疾患と関連疾患対照群の Index 値には 6 カットオフ値の検討 199 例を対象とした時の感度特異度曲線において感度特異度が最大になる Index 値は 16.0 であったまた偽陰性 False Negative; FN 偽陽性 False Positive; FP のコスト比を考慮したコスト曲線を作成すると 8) コスト比 0.25 と 0.50 において期待コストが最小になる Index 値はいずれもとなった Figure 4 は 88.4%であり不一致例 23 例の内訳は CLEIA 法陽性 IIF 法陰性が 10 例 CLEIA 法陰性 IIF 法陽性が 13 例であった Table 4 4 臨床的感度特異度 IV 考察基本性能において再現性と試薬安定性に問題は II-1.で述べた検体を対象とし添付文書に従ってなかった 2SD 法による検出限界は Index 値カットオフ値を Index 値 10.0 とした時の臨床的感度でありカットオフ値よりも十分高感度のため定は 91.5% 特異度は 74.2%であった Table 5 対象医学検査 Vol.65 No 性検査として問題ないと思われる IIF 法との比較に 631

4 Table 4 Comparison between CLEIA and IIF (N = 199) Table 5 Sensitivity and specificity CLEIA (+) CLEIA ( ) IIF (80 Titer) CLEIA (10.0 Index) IIF (+) IIF ( ) Cut off value CLEIA: 10.0 (Index) IIF: 80 (Titer) Concordance rate: 88.4% No. CLEIA Index CLEIA (+), IIF ( ) IIF (Pattern) (Sp + Ho) Specific autoantibody (CLEIA) dsdna, RNP, SS-A Disease SLE <40 RNP, SS-A SLE <40 dsdna, RNP SLE (Sp) SS-A SLE (Sp) RNP MCTD <40 SS-A, SS-B SjS <40 Jo-1 PM/DM <40 Jo-1 PM/DM <40 Jo-1 PM/DM <40 No. CLEIA Index CLEIA ( ), IIF (+) IIF (Pattern) Specific autoantibody (CLEIA) Bronchus malacia Disease (Nu) SSc ,280 (Sp) PM/DM (Nm + Ho) 1,280 (Sp + Nu) PM/DM PM/DM (Ho) RA (Ho) vasculitis (Ho) RA (Ho) RA (Sp + Ho) (Sp) Sm ANCAassociated ANCAassociated vasculitis Malignant melanoma (Ho) DM (Sp + Ho) (Nm) Ouchterlony double immunodiffusion method ( ) Parotid gland cancer Alcoholic liver damage Sensitivity 86.8% 91.5% Specificity 65.6% 74.2% (Cut off value) Figure 2 Receiver operating characteristic curves of antinuclear antibody measured by CLEIA and IIF おいて,IIF 法の力価と CLEIA 法の Index 値には相関関係が認められたが, 本法は定性試薬として開発されており標準物質が 2 濃度のため,Index 値を定量検査として用いることはできないと考えられる定性検査としての CLEIA 法と IIF 法との判定一致率は 88.4% であり, 概ね良好な結果が得られた不一致例の詳細をみると CLEIA 法陽性,IIF 法陰性 10 例のうち 9 例は目的疾患であり, 特異自己抗体が検出された IIF 法で使用している HEp-2 細胞表面上には多くの抗原が存在しているのに対し,CLEIA 法では抗原を限定して使用することで IIF 法と比較して高感度に目的疾患に対応する自己抗体を検出することが可能になったと考えられるさらに IIF 法では Jo-1 抗体が検出されなかったのに対し CLEIA 法では検出が可能であり, 多発性筋炎 / 皮膚筋炎の診断への貢献が期待される一方 CLEIA 法陰性,IIF 法陽性 13 例のうち目的疾患は 4 例で, 疾患特異自己抗体が検出されたのは 1 例のみであったこの 1 例の抗 Sm 抗体について 2 重免疫拡散法を行ったところ陰性となり, 非特異反応が疑われたこれらの結果か 632 古村他 CLEIA 法を原理とする抗核抗体測定試薬の評価

5 p p Figure 3 Distribution according to the diseases of index value by CLEIA Figure 4 Examination of cut off value ら IIF 法と本法は異なった性質の検出系として評価する必要があることがわかる IIF 法は抗核抗体を包括的に捉える検査法として用いられ,2009 年のアメリカリウマチ学会において診断目的での使用が推奨されているが 9 ),CLEIA 法は ROC 分析において IIF 法より優れた結果が得られ, 診断能力には遜色がないと考えられる疾患別にみても SLE,MCTD, SjS,SSc で高い陽性率が得られ, その Index 値は関連疾患群, 対照群と比較して有意に高値傾向が認められたこのことより定量検査として用いることはできないものの Index 値が高値であれば目的疾患である可能性が高いと考えられる一方, 現行法で用医学検査 Vol.65 No

6 いられているような経過観察指標としての有用性にテップに迅速に進むことができる膠原病を疑う場ついては現時点では不明であり今後の評価を待合の除外診断としても有用であると考えられ診断つ必要があると考えるカットオフ値の検討では添ツールの一つとして期待される付文書に記載されているカットオフ値より高めの設定となったメーカーがカットオフ値を設定した際の母集団は健常者を約 40%含むのに対し今回の検討では臨床検体を用いて行われたためこの結果は当院の臨床現場を反映したものであると思われる医療機関により対象患者が異なることからカットオフ値の設定は各施設での臨床側との合意が必要であると考えられる V 結語抗核抗体は膠原病のスクリーニングに有用な検査である IIF 法は染色パターンから特異自己抗体の推定ができるものの混在型も多くその臨床的意義には問題点も多い 2) 今回検討した CLEIA 法による測定は SLE MCTD SjS SSc における陽性率が 95% 以上と高く感度特異度ともに IIF 法より優れた結果が得られた本法は IIF 法で問題視されていた手技的な問題や施設間差の解消を期待できるパターン報告ができないため病態の絞り込みに関する有用性は低いが測定時間が 19 分と短く陽性であ謝辞本検討に御協力いただきました株式会社医学生物学研究所に対し深謝申し上げます文献 1) Tan EM et al.: Range of antinuclear antibodies in healthy individuals, Arthritis Rheum, 1997; 40: ) 宮脇昌二自己抗体測定の現状と問題点抗核抗体臨床病理 2001; 49: ) Kumagai S et al.: Immunofluorscense-still the gold standard in ANA testing?, Scand J Clin Lab Invest, 2001; 61: ) 熊谷俊一他抗核抗体日本臨牀 2010; 68 Suppl 6: ) 熊谷俊一他自己抗体検査のサーベイとそれに基づく標準化の検討臨床病理 2009; 57: ) 林伸英熊谷俊一抗核抗体検査の EIA の自動化法検査と技術 2001; 29: ) 渡邉奈緒美他蛍光酵素免疫測定法による抗核抗体スクリーニングの基礎および臨床性能評価臨床病理 2014; 62: ) 日本臨床検査自動化学会科学技術委員会臨床検査の診断的有用性評価マニュアル 4 カットオフ値の設定法日本臨床検査自動化学会誌 2004; 29 Suppl 1: ) Meroni PL, Schur PH: ANA screening: An old test with new recommendations, Ann Rheum Dis, 2010; 69: 本論文に関連し開示すべき COI 状態にある企業等はありませんれば専門家への紹介特異自己抗体検索等次のス 634 古村他 CLEIA 法を原理とする抗核抗体測定試薬の評価

7 Technical Article Evaluation of antinuclear antibody test by chemiluminescent enzyme immunoassay (CLEIA) Naoko KOMURA 1) Kazunori KOMATSU 1) Hajime KONO 2) Taiji FURUKAWA 3) 1) Division of Laboratory Medicine, Teikyo University Hospital (2-11-1, Kaga, Itabashi-ku, Tokyo , Japan) 2) Department of Medicine, Teikyo University School of Medicine 3) Department of Laboratory Medicine, Teikyo University School of Medicine Summary Detection of the antinuclear antibody (ANA) is widely used for the screening of collagen diseases. Although indirect immunofluorescence (IIF) assay is considered as a standard test, it has disadvantages in terms of its specificity and rapidity. We performed basic and clinical evaluation of a new ANA assay by chemiluminescent enzyme immunoassay (CLEIA). The basic performance of the assay was within acceptable level. Its clinical sensitivity was 91.5% and its specificity was 74.2%, which are higher than those of the IIF assay. The measurement time of CLEIA was 19 minutes, which was shorter than that of the conventional method. On the basis of these results, it is considered that this method is useful for the screening of connective tissue diseases. Key words: ANA, CLEIA, Rapid test (Received: April 4, 2016; Accepted: September 13, 2016) 医学検査 Vol.65 No

検体採取患者の検査前準備検体採取のタイミング 5. 免疫学的検査 >> 5G. 自己免疫関連検査 >> 5G010. 記号添加物 ( キャップ色等 ) 採取材料採取量測定材料 F 凝固促進剤 + 血清分離剤 ( 青細 ) 血液 3 ml 血清 H 凝固促進剤 + 血清分離剤 ( ピンク

検体採取患者の検査前準備検体採取のタイミング 5. 免疫学的検査 >> 5G. 自己免疫関連検査 >> 5G010. 記号添加物 ( キャップ色等 ) 採取材料採取量測定材料 F 凝固促進剤 + 血清分離剤 ( 青細 ) 血液 3 ml 血清 H 凝固促進剤 + 血清分離剤 ( ピンク 5. 免疫学的検査 >> 5G. 自己免疫関連検査 >> 5G010. anti nuclear antibody 連絡先 : 3764 基本情報分析物 5G010 JLAC10 診療報酬識別材料 023 血清測定法 162 蛍光抗体法 (FAT) 結果識別第 2 章特掲診療料 D014 5 抗核抗体 ( 蛍光抗体法 ) 半定量 105 点第 3 部検査第 1 節検体検査料第 1