本日の内容 sirnaの基礎 sirnaのワークフロー RNAiの原理オフターゲット効果 sirna 実験の成功の秘訣 sirnaを低濃度で使う化学修飾 sirna を使う高効率なトランスフェクションを行う複数のsiRNAを個別に使う Single sirnas vs. sirna Pools Si

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1 はじめよう sirna 実験オフターゲットターゲット効果効果を抑えた正確な機能解析機能解析で RNAi 実験を成功成功させる 2014 年 11 月 14 日 ( 金 ) ライフテクノロジーズジャパン株式会社サーモフィッシャーサイエンティフィックグループ 2 The world leader in serving science

2 本日の内容 sirnaの基礎 sirnaのワークフロー RNAiの原理オフターゲット効果 sirna 実験の成功の秘訣 sirnaを低濃度で使う化学修飾 sirna を使う高効率なトランスフェクションを行う複数のsiRNAを個別に使う Single sirnas vs. sirna Pools Silencer Select sirna Silencer Select sirnaの特徴 Silencer Select sirna Library まとめ 3

3 RNAi 実験のワークフロー sirnaの設計設計 合成 sirnaの導入 ノックダウンの評価 解析 設計済みsiRNAを検索 合成 最適な導入方法を検討または Negative control アクセッション番号等をもとに設計 蛍光修飾 sirna 目的のsiRNA Positive control(gapdh 等 ) 導入後の培養時間 mrnaレベル:24~48 時間 タンパク質レベル :24~72 時間 mrnaの解析(qpcr 等 ) タンパク質解析 ( ウエスタンブロット等 ) 表現系解析 ( 顕微鏡解析等 ) mrna Knockdown sirna トランスフェクション試薬 18s neg1 surv Protein Knockdown 専用 Web サイトにて検索 細胞 Survivin GAPDH 4

4 RNAi のメカニズム RNA interference: RNA 干渉 2 本鎖 RNA 分子 (dsrna) を細胞や生体に導入し 導入した dsrna とホモロジーを持つ mrna を特異的に分解することで発現が抑制される現象 細胞内ではでは内在性内在性の mirnaと同様同様の経路経路で作用作用する sirna:mrnaと100% の相同性を持ち mrnaを分解することで dsrna 標的遺伝子をノックダウンする mirna : 一般に mrna 配列と一部ミスマッチがあり mrna の分 解ではなく翻訳を抑制することで遺伝子をノックダウンする sirna mirna 5

5 sirna と shrna の違い sirnas 合成オリゴ デザインの自由度が高くノックダウン効率が高い 標的以外のノックダウンを最小限にする化学修飾が可能 shrna(short hairpin RNA) ウイルスまたはプラスミドから作られる デザインの自由度が低い 長期間のノックダウン 発現量を制御できず標的以外のノックダウンが多い 6

6 sirna の一般的な構造 二本鎖の核酸 19 塩基の RNA + TT (DNA) = 21 塩基 2 塩基 (TT) だけ末端が突出 アンチセンス鎖は標的 mrna と完全に相補的 sirna C G A U A A U A G A U U A G A U C C C T T T T G C U A U U A U C U A A U C U A G G G アンチセンス鎖 センス鎖 RISC C G A U A A U A G A U U A G A U C C C T T アンチセンス鎖 U G C G U A G C U A U U A U C U A A U C U A G G G C U G A U U 標的 mrna 標的 mrna の分解 7

7 sirna オフターゲットオフターゲットオフターゲットオフターゲット効果効果効果効果とはとはとはとは標的遺伝子以外の遺伝子に対して非特異的に RNAi 効果を示してしまう現象オフターゲットオフターゲットオフターゲットオフターゲット効果効果効果効果目的目的目的目的の RNAi アンチセンスアンチセンスアンチセンスアンチセンス鎖目的遺伝子のノックダウン 8 sirna 導入導入導入導入によるによるによるによる非特異的非特異的非特異的非特異的な免疫応答免疫応答免疫応答免疫応答や細胞毒性細胞毒性細胞毒性細胞毒性センスセンスセンスセンス鎖によるによるによるによる非特異的非特異的非特異的非特異的な抑制抑制抑制抑制アンチセンスアンチセンスアンチセンスアンチセンス鎖と相補性相補性相補性相補性を有するするするする遺伝子遺伝子遺伝子遺伝子を非特異的非特異的非特異的非特異的に抑制抑制抑制抑制センスセンスセンスセンス鎖アンチセンスアンチセンスアンチセンスアンチセンス鎖目的遺伝子のノックダウン

8 sirna 実験の成功の秘訣 標的遺伝子のノックダウンをのノックダウンを最大化最大化し オフターゲットオフターゲット効果効果を最小化最小化すべしそのための実験のポイント sirna を低濃度低濃度で使う 化学修飾 sirna を使う 高効率なトランスフェクションをなトランスフェクションを行う 二種以上の sirna で個別個別に実験実験を行う 9

9 ポイント 1 sirna を低濃度で使用する sirnaを低濃度低濃度で用いることでいることで オフターゲットオフターゲット効果効果を抑制 CLTC( クラスリン重鎖 ) に対する sirna 10

10 ポイント 2 化学修飾 sirna を使用する アンチセンス鎖 化学修飾 センス鎖 RISC センス鎖 RISC RISC アンチセンス鎖 標的以外の mirna をノックダウンオフターゲットの主要因となる 標的 mirna をノックダウン センス鎖を化学修飾化学修飾によりにより非活性化非活性化することですることで センスセンス鎖が RISCに取り込まれるのをまれるのを防ぐことがぐことが可能 11

11 ポイント 2 化学修飾 sirna を使用する 化学修飾によりにより オフターゲットはオフターゲットは大きくきく減少減少するする O O Base 80% reduction O O LNA 2-fold changes p<0.001 化学修飾なし 化学修飾あり (LNA) LNA 修飾した sirna(silencer Select) と LNA 修飾なしの sirna のオフターゲットの比較 sirna 導入後に増加もしくは減少した mrna の数をマイクロアレイ (Affymetrix U Plus genechip) で解析した 12

12 ポイント 3 高効率なトランスフェクションを行う 細胞に合わせた最適なトランスフェクション手法を選択する 接着系細胞株 幹細胞初代細胞 浮遊系細胞 エレクトロポレーション Neon Transfection System 試薬での導入が困難だった細胞に使用 浮遊系細胞に適している sirna 専用トランスフェクション試薬 Lipofectamine RNAiMAX sirna 導入の第一選択肢としておすすめ 簡便かつ低コスト プラスミド sirna 共通トランスフェクション試薬 Lipofectamine 3000 sirna とプラスミドのコトランスフェクションが可能 13

13 ポイント 3 高効率なトランスフェクションを行う 正確な導入効率導入効率の確認方法 Positive control sirna( 例 :GAPDH) を導入し mrna レベルでの抑制効果を確認する 高精度な TaqMan がおすすめ 蛍光標識した sirna を導入して 導入された細胞をカウントする 70% 以上のノックダウン = 80% 以上の導入効率 Alexa555 蛍光修飾 sirna の導入 BLOCK-iT Alexa Fluor RedFluorescent Control 14

14 ポイント 3 高効率なトランスフェクションを行う 生存率の確認方法トリパンブルー染色により生存率のチェック 未処理細胞 Negative control sirna 導入細胞 導入試薬のみ 生存率が最低最低でも 70% 以上であるかをチェック トリパンブルー 15

15 ポイント 4 複数の sirna で実験する mrna の異なるなる位置位置に設定設定された sirna を用いて個別個別にノックダウン実験を行い 複数の sirna で同じ結果が得られることを確認する sirna #1 sirna #2 ターゲット mrna RISC RISC AAAAAAAAAAAAA 論文では同一遺伝子に対する複数の sirna での確認を要求されることがある 二つ以上の sirna でオフターゲット効果のフェノタイプが一致する可能性は非常に低いため 複数の sirna で同一のフェノタイプが得られた場合はターゲットのノックダウンによる効果と考えられる 16

16 Single sirnas vs. sirna Pools sirna は 1 種類ずつ単独で導入 (Single 法 ) すべきか 複数の sirna をミックスした状態で導入 (Pool 法 ) すべきか 検証方法 mrna レベルでの抑制結果 アポトーシスアッセイ Pool 法は標的 mrna のノックダウンに効果的だが 大きな問題がある 17

17 Single sirnas vs. sirna Pools アポトーシス関連の遺伝子をスクリーニングした例 Positive phenotype: Negative control sirnaを導入した場合より - 2SD 以下の値を示したもの Phenotype 変化の確認 : 3 種類の異なる sirna のうち 2 種類の sirna によって同様な phenotype の変化が誘導された場合 sirna の導入によって誘導された phenotype とする Pool 法は False Positive や False Negative となる場合がある 18

18 Single sirnas vs. sirna Pools アポトーシスアッセイ 同一ターゲットの sirna であっても異なる phenotype の変化を誘導する場合がある mrna レベルでの抑制が得られても目的とする phenotype の変化を誘導できない場合がある Pool 法を用いると正しい phenotype 誘導が行われないケースが多い オフターゲット効果による影響 19

19 Single sirnas vs. sirna Pools False positive のリスクを最小限にするために 同一ターゲットの複数の sirna を単独で使用し 同じ phenotype となることを確認する必要がある Echeverri et al. Nature Methods Oct

20 Silencer Select sirna 製品コンセプト Phenotype from sirna 3 より確実なノックダウン より高いノックダウン効率 より高い特異性 低毒性 Phenotype from sirna 1 Phenotype from sirna 2 Silencer Select sirnas 複数の sirna を使用した実験により裏付けられた高い信頼性 デザインアルゴリズム バイオインフォマティックフィルター 化学修飾 (LNA) 21

21 Silencer Select sirna 低濃度で効率的なノックダウン sirna 濃度とノックダウン効率の関係 デザインアルゴリズムにより低濃度でノックダウン可能な配列をデザイン 他の sirna に対し 同濃度で最大 100 倍のノックダウン効率 わずか 3 nm の濃度で 80% 以上のノックダウン効率を実現 10 mrna targets, 3-4 sirnas per target 22

22 Silencer Select sirna デザインアルゴリズム改良によるノックダウン効率の向上 デザインアルゴリズム改良によるノックダウン効率の向上 40 の標的遺伝子に対して 155 の sirna を Silencer Select デザインアルゴリズムでデザインし 従来のデザイン (Silencer sirna) と比較した 5 nm の sirna を HeLa 細胞に導入し 48 時間後の mrna 量を TaqMan Gene Expresssion Assay により解析 23

23 Silencer Select sirna 特異性を高めるためのフィルタリング Mismatch Filter Silencer Select Toxicity Classifier Natural mirna Seed Region Filter Antiviral Response Motif Filter Selection of hyperfunctional sirna with improved potency and specificity. Wang, X, et al., NAR, Oct. 21, 2009 sirna Seed Region Ranking 24

24 Silencer Select sirna 最適な化学修飾パターンの探索 New Chemistry Pattern Modification Multiple rounds of selection, 40+ formats evaluated Hundreds of sirna tested B Microarray Phenotypic assays Toxicity Potency testing Strand bias Cell assay O O O O LNA Silencer Select sirna 25

25 Silencer Select Library 通常のチューブ製品以外に スクリーニングには sirna を 96 well または 384 well プレートにスポットしたプレートタイプが便利です 下の既製品以外に任意の sirna を選べるカスタムライブラリも可能です Kinases (710) Phosphotase (298) Nuclear Hormones (47) GPCR (380) Protease (494) Ion Channels (338) Druggable Genome (9,032) Extended Druggable Genome (10,415) Human Genome Collection (21,585) Silencer Select sirna Pre-made Library シリーズと対象遺伝子数 26

26 まとめ sirnaの設計設計 合成 sirnaの導入 ノックダウンの評価 解析 設計済み sirna を検索 合成または アクセッション番号等をもとに設計 同一遺伝子に対し複数設計 導入後の培養時間 Negative control mrnaレベル:24~48 時間 Positive control(gapdh 等 ) タンパク質レベル :24~72 時間 蛍光修飾 sirna mrnaの解析(qpcr 等 ) 目的のsiRNA タンパク質解析 ( ウエスタンブロット等 ) 表現系解析 ( 顕微鏡解析等 ) 最適な導入方法を検討 Single 法で複数の sirna を使用 優れたデザインアルゴリズムの化学修飾 sirna Silencer Select sirna 第一選択肢 : sirna 専用トランスフェクション試薬 Lipofectamine RNAiMAX 第二選択肢 : エレクトロポレーション Neon Transfection System 正確な mrna 定量 TaqMan Gene Expression Assay 27

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