新技術説明会　様式例

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たつやけいれい
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1 1 抗血管内皮細胞抗体を検出するための新たな ELISA 法藤田保健衛生大学総合医科学研究所抗体プロジェクト研究部門講師三浦惠二

2 様々な自己免疫疾患多臓器にわたる障害がみられる全身性自己免疫疾患組織障害が 1 つの臓器に限局している臓器特異的自己免疫疾患関節リウマチ全身性エリテマトーデス (SLE) 全身性強皮症 (SSc) 混合性結合組織病 (MCTD) シェーグレン症候群多発性筋炎 / 皮膚筋炎抗リン脂質抗体症候群結節性多発動脈炎顕微鏡的多発血管炎ウェゲナー肉芽腫症アレルギー性肉芽腫性血管炎バセドウ病橋本病原発性甲状腺機能低下症潰瘍性大腸炎クローン病自己免疫性肝炎原発性胆汁性肝硬変自己免疫性膵炎急速進行性糸球体腎炎突発性血小板減少性紫斑病自己免疫性好中球減少症重症筋無力症ギランバレー症候群グッドパスチャー症候群天疱瘡類天疱瘡後天性表皮水疱症尋常性白斑突発性無精子症習慣性流産古典的な膠原病に加えて自己抗体の関与が示唆される疾患は増えている 2

SS-A 抗体抗 SS-B 抗体抗 Scl-70 抗体抗 CENP-B 抗体抗 U1-RNP 抗体抗 Sm 抗体抗

3 3 自己免疫疾患における検査項目の例関節リウマチ (RA) 全身性エリテマトーデス (SLE) シェーグレン症候群 (SS) 強皮症 (SSc) 混合性結合組織病 (MCTD) 抗 CCP 抗体リウマチ因子抗核抗体抗 DNA 抗体抗 Sm 抗体抗 SS-A 抗体抗 SS-B 抗体抗 Scl-70 抗体抗 CENP-B 抗体抗 U1-RNP 抗体抗 Sm 抗体抗 DNA 抗体スプライソソームを構成する成分細胞内に局在する自己抗原が多い! 細胞内成分に対する抗体でなぜ異常が起こるのか?

4 自己免疫疾患分野における従来技術とその問題点自己免疫疾患の診断のための臨床検査では疾患特異的に検出される自己抗体を ELISA などで測定している病態や臨床症状を直接反映していない検査項目が多い現在の臨床検査で使われている自己抗原の多くが細胞内に局在する可溶性タンパク質である一方自己免疫疾患の患者血清中には血管内皮細胞表面に結合する自己抗体 (

4 4 自己免疫疾患分野における従来技術とその問題点自己免疫疾患の診断のための臨床検査では疾患特異的に検出される自己抗体を ELISA などで測定している病態や臨床症状を直接反映していない検査項目が多い現在の臨床検査で使われている自己抗原の多くが細胞内に局在する可溶性タンパク質である一方自己免疫疾患の患者血清中には血管内皮細胞表面に結合する自己抗体 ( 抗血管内皮細胞抗体 :AECA) が存在することが知られている AECA のための標準化された測定方法もなく AECA が結合している自己抗原が同定され臨床検査に使われているものはほとんどない 40 年以上も前から自己免疫疾患患者血清中に毛細血管の内皮細胞に結合する IgG が存在することが知られている Lindqvist, KJ, Osterland, CK, 1971.

5 5 抗血管内皮細胞 (AECA) が検出される主な疾患と陽性率 % ウェゲナー肉芽腫症川崎病 <72 高安動脈炎 95 巨細胞性動脈炎 <50 突発性網膜血管炎 35 ベーチェット病 <50 閉塞性血栓性血管炎チャーグストラウス症候群 50 全身性エリテマトーデス (SLE) <80 リン脂質抗体症候群 64 関節リウマチ ( 血管炎を伴う ) <65 関節リウマチ ( 血管炎を伴わない )<30 全身性強皮症 (SSc) 混合性結合組織病 (MCTD) 45 多発性筋炎 / 皮膚筋炎 44 % 心臓腎移植拒絶 <71 炎症性腸疾患 <55 抗プロラクチン血症 76 溶血性尿毒症症候群 93 血栓性血小板減少性紫斑病 100 ヘパリン起因性血小板減少症 100 多発性硬化症 IgA 腎症 32 1 型糖尿病自己免疫性上皮小体機能低下症 100 妊娠高血圧症候群 50 ロッキー山紅斑熱 50 ウイルス感染 <16 C 型肝炎ウイルス感染による混合性クリオグロブリン血症 41 Praprotnik, S, et.al.arthritis Rheum. 44, (2001) この総説以降にも AECA が検出される疾患が増えている

6 AECA が検出される疾患で患者数の多い疾患関節リウマチ 700,000 人 ( 国民生活基礎調査で手足の関節が痛む国民が560 万人 ) 炎症性腸疾患 140,000 全身性エリテマトーデス(SLE) 56,000 IgA 腎症 30,000 シェーグレン症候群 20,000 ベーチェット病 16,000 多発性硬化症 13,000 川崎病 10,000-20,000( 年 ) 全身性強皮症(SSc) 10,000 混合性結合組織病(MCTD) 8,600 1 型糖尿病 8,000 検査薬市場 2011 年の国内の免疫血清検査薬市場 1,772 億円の内自己免疫疾患は 162 億円 (IgE 関連が 60% 以上 ) ( 富士経済 ) 2016 年世界の自己免疫疾患治療市場は 550 億米ドルその内診断は 16 億米ドルとの予測 (BBC リサーチ ) 6

7 7 AECA およびその標的抗原の解明が進まない理由研究試薬として使用されているモノクローン抗体では組織染色で使用できる抗体はウェスタンブロットには使用できないウェスタンブロットで使用できる抗体は組織染色で使用できないという現象は珍しくないその原因は抗原 ( エピトープ ) の立体構造の変化によるものと考えられる膜タンパクの研究では界面活性剤での可溶化のステップが必須でありそれに伴う生理活性の喪失は珍しいことではないその原因は膜タンパクの立体構造の変化が起こりやすいことにあると考えられている膜タンパクの可溶化には細胞の破砕法界面活性剤の選択など多くのノウハウが必要とされるところが自己抗原の探索には患者血清を用いたウェスタンブロット解析や免疫沈降法が主な方法であり自己抗原の不安定な立体構造に配慮した実験手法が採られてこなかった

の標的自己抗原が細胞表面の膜タンパクやその複合体であることを想定すると立体構造変化に配慮した実験手法を採用する必要がある AECA

8 8 AECA と標的自己抗原の結合は自己免疫疾患の本質か? 内皮細胞 AECA は血管炎のトリガーか? ADCC シグナル伝達平滑筋細胞 CDC 血管壁細胞表面上に存在する分子膜タンパク質複合体脂質糖脂質糖タンパク質複合体糖タンパク質 AECA の標的自己抗原が細胞表面の膜タンパクやその複合体であることを想定すると立体構造変化に配慮した実験手法を採用する必要がある AECA だけに焦点を当てた検出法の開発は細胞に直接影響を与える自己抗体即ち病態を反映する自己抗体の検出に繋がる AECA は血管内皮細胞特異的ではないことが判明したことから病変部の細胞を使用することで病態特異的自己抗体の検出が可能になる

ビオチン結合タンパクを介して固相化する細胞破砕法界面活性剤の選択その使用法が重要である Sulfo-NHS-LC-Biotin

9 新技術 CSP-ELISA の特徴 CSP は cell surface protein capture の意味細胞表面上に存在する自己抗原が膜タンパク複合体であると想定しできるだけ立体構造を保持した状態で固相化する抗原を直接固相化することは立体構造に影響を及ぼすためビオチン : ビオチン結合タンパクを介して固相化する細胞破砕法界面活性剤の選択その使用法が重要である Sulfo-NHS-LC-Biotin による血管内皮細胞表面のタンパクのビオチン化可溶化された膜タンパク界面活性剤複合体界面活性剤 n-dodecyl β-d maltopyranoside 9

10 10 新技術 CSP-ELISA の特徴あらかじめビオチン結合タンパクニュートラアビジンを ELISA ウェル上に固相化しておき可溶化したビオチン化膜タンパクを捕捉する患者血清を反応させ HRP 標識の抗ヒト抗体で自己抗体を検出する洗浄などの全ステップにおいて抗原の立体構造を保持するため常に界面活性剤を添加しておく必要がある CSP-ELISA 法 HRP 標識抗ヒト IgG 自己抗体 1 ウェルあたり約 10,000 個の細胞由来のタンパク 0.5-2ul の血清ニュートラアビジン

11 11 CSP-ELISA により測定した自己免疫疾患患者血清中の抗血管内皮細胞 IgG 抗体価 78% 81% 56%

12 12 ウェル上の抗原の変性処理による自己抗体反応性の変化 WB に使えない抗体コントロール PBS 処理 0.1% SDS 処理 RIPA 処理 0.1% SDS, 分の比較的マイルドな変性処理でも抗体の結合は低下するウェスタンブロッティングでは検出できない抗原抗体反応ということになる

13 13 腎内科領域において慢性腎臓病の患者は国内で約 1,330 万人病気が進行し人工透析が必要な患者は約 30 万人その医療費が年間一兆円現在の腎臓病の検査は尿検査 ( 尿タンパク量 ) と血液検査 ( クレアチニン量 ) 最終的な検査として腎生検しかし腎生検は患者にとって大きな苦痛を伴う検査でもある腎不全を防ぐために簡便で患者の苦痛が少なくかつ早期発見できる検査治療効果が判定できる検査腎生検の回数を減らすことができる検査予後予測ができる検査などの需要は非常に高い

ヒト臍帯静脈血管内皮細胞を用いた SLE およびループス腎炎患者血清の CSP-ELISA 94 (%) 2 * IgG 35 (%) 1 * IgA 1.6 1.2 96 *.8 28 * 10 6.6 5.8 20.4.4.2 0 ループス腎炎 SLE 他の腎疾患コントロール健常人疾患コントロールと健常人に対して : *P < 0.

14 ヒト臍帯静脈血管内皮細胞を用いた SLE およびループス腎炎患者血清の CSP-ELISA 94 (%) 2 * IgG 35 (%) 1 * IgA *.8 28 * ループス腎炎 SLE 他の腎疾患コントロール健常人疾患コントロールと健常人に対して : *P < SLE に対して : P < ループス腎炎 SLE 他の腎疾患コントロール健常人疾患コントロールと健常人に対して : *P <

15 15 ループス腎炎患者血清中に含まれる AECA の内皮細胞表面への結合 HGMEC-IgG (+) HGMEC-IgG (+) (-) HGMEC-IgG (-) HGMEC-IgA (+) (-) CSP-ELISA 高値の血清では細胞表面に結合する抗体が確認できた

16 ループス腎炎の活動性病変との相関 OD492 nm P < n.s. 活動性病変あり A (+) A なし (-) 活動性病変あり A (+) A なし (-) HGMEC-CSP-IgG HGMEC-CSP-IgA 管内増殖 + 半月体形成 CSP-IgG, IgA 共に高値になると活動性病変が多くなるワイヤーループ + ヒアリン血栓 16

17 ループス腎炎患者血清 IgG と HGMEC 膜画分を用いた免疫沈降 kda 250 150 100 75 Ladder 銀染色ウェスタンブロット健常人 +DTT -DTT LN2 LN7

17 17 ループス腎炎患者血清 IgG と HGMEC 膜画分を用いた免疫沈降 kda Ladder 銀染色ウェスタンブロット健常人 +DTT -DTT LN2 LN7 健常人 LN2 LN7 健常人 LN2 LN Ag-X 患者血清特異的にビオチン化されたバンドが回収された非還元で高分子量となるため複合体を形成していると判断できる

18 18 ヒト肺動脈血管内皮細胞を用いた混合性結合組織病 (MCTD) 患者血清の CSP-ELISA HPAEC-CSP-ELISA IgG IgA 97% 20% カットオフ値 (0.35) カットオフ値 (0.23) MCTD (n=200) HC (n=122) MCTD (n=200) HC (n=122) 健常人に対して *P < 健常人に対して *P <

19 19 ヒト皮膚微小血管内皮細胞を用いた全身性強皮症患者血清の CSP-ELISA * IgG 15% 23% カットオフ値 (0.28) * IgA カットオフ値 (0.39) 0 強皮症 SSc (n=156) 健常人 HC (n=114) 0 強皮症 SSc (n=156) 健常人 HC (n=114) 健常人に対して *P < 健常人に対して *P < 0.001

20 20 3 疾患における自己抗原と患者の持つ自己抗体の想定図全身性エリテマトーデス (SLE) 関節炎リンパ節腫脹顔面紅斑心膜炎胸膜炎白血球減少 dsdna phospholipid Sm プロファイリングが必要! 抗体 1 抗体 2 抗体 3 患者 A さん U1-RNP 混合性結合組織病 (MCTD) Scl-70 CENP-B 手足の皮膚硬化肺線維症食道蠕動低下拡張強皮症 (SSc) 抗体 2 抗体 3 抗体 4 患者 B さん

21 自己抗体検査法の将来と本技術の用途アメリカ PEPPERPRINT 社 PEPperCHIP Peptide Microarrays for Autoimmune Diseases Tests per Microarray: One array with 4,389 peptides in duplicate Peptide Lengths: 3-17 a.a. この様に短いエピトープでは AECA と標的自己抗原との反応を再現できないだろうと考えられるしかしながら複雑なエピトープを反映させたチップが提供される時代が訪れることは確実に予想される CSP-ELISA の条件を踏襲した膜タンパク抗原チップにより自己免疫疾患患者血清中の自己抗体のプロファイリングが可能になる励起光検出高値病態にリンクした抗原抗体反応の測定とプロファイリング低値膜タンパク抗原チップ 21

22 22 実用化に向けた課題ループス腎炎においては CSP-ELISA 値と腎炎との相関性がわかりつつあるが他の疾患においても抗体価と病態との相関性を見つけることそのためには各疾患の専門医など多くの臨床医グループとの共同研究が必要である自己抗体が結合している自己抗原を同定すること免疫沈降で患者特異的なバンドが検出できているものの質量分析での同定がうまくいっていない膜タンパクの同定は難しいとの情報もあり膜タンパクの同定を行っている研究者との共同研究も考えたい

23 23 企業への期待臨床検査特に血清を用いた検査についての技術ノウハウを持っている企業との共同研究を希望している現状の CSP-ELISA は古典的な ELISA プレートを使用した系であるため微量な血清で多項目の自己抗体を検出するにはチップあるいはビーズなどを使用した検出系への発展が必要だと考えている抗原と抗体との結合を検出可能な先端技術を持つ企業との共同研究を希望している膜タンパクとそれに結合することで細胞に影響を与える抗体の組み合わせの解明は抗体自体が薬になりうる可能性を持つと考えられる膜タンパクに対する抗体での創薬を考えている企業には本技術を用いた自己抗原同定および患者由来の抗体遺伝子取得が役立つと考えられる

24 24 本技術に関する知的財産権発明の名称細胞表面タンパクを抗原とする抗体を測定する方法出願番号特願出願人藤田保健衛生大学発明者三浦惠二吉田俊治黒澤良和お問い合わせ先 ( 財 ) 名古屋産業科学研究所中部 TLO コーディネーター羽田野泰彦 TEL: , FAX: hatano@nisri.jp 藤田保健衛生大学総合医科学研究所抗体プロジェクト三浦惠二 TEL: , FAX: kmiura@fujita-hu.ac.

10038 W36-1 ワークショップ 36 関節リウマチの病因病態 2 4 月 27 日 ( 金 ) 15:10-16:10 1 第 5 会場ホール棟 5 階ホール B5(2) P2-203 ポスタービューイング 2 多発性筋炎皮膚筋炎 2 4 月 27 日 ( 金 ) 12:4

10038 W36-1 ワークショップ 36 関節リウマチの病因病態 2 4 月 27 日 ( 金 ) 15:10-16:10 1 第 5 会場ホール棟 5 階ホール B5(2) P2-203 ポスタービューイング 2 多発性筋炎皮膚筋炎 2 4 月 27 日 ( 金 ) 12:4 10001 P1-089 ポスタービューイング 1 関節リウマチの治療 :DMARDs NSAIDs 4 月 26 日 ( 木 ) 13:20-14:40 - ポスター展示会場ホール E B2 階ホール E 10002 P2-041 ポスタービューイング 2 関節リウマチの治療評価と予測 2 4 月 27 日 ( 金 ) 12:40-14:00 - ポスター展示会場ホール E B2 階ホール

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