横浜市環境科学研究所所報第 33 号 2009 LC/MS を用いた農薬の多成分同時分析法二宮勝幸 ( 横浜市環境科学研究所 ) Study on simultaneous analysis of pesticides by LC/MS/MS Katsuyuki Ninomiya (Yokoham

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さみらおとべ
5 years ago
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1 横浜市環境科学研究所所報第 33 号 2009 LC/MS を用いた農薬の多成分同時分析法二宮勝幸 ( 横浜市環境科学研究所 ) Study on simultaneous analysis of pesticides by LC/MS/MS Katsuyuki Ninomiya (Yokohama Environmental Science Research Institute) キーワード : 魚死亡事故緊急時環境調査農薬多成分同時分析法 LC/MS 要旨市内河川や海域における魚の死亡事故件数は近年 10 件前後で推移しておりそのうち8 割程度が原因不明となっている事故原因は様々であるがこれまで農薬等の化学物質による事故については主としてガスクロマトグラフ質量分析装置 (GC/MS) を用いて化学物質検索を行ってきたがより多種類の農薬を対象に迅速に測定できるように液体クロマトグラフ質量分析装置 (LC/MS) を用いた多成分同時分析法について検討した 1. はじめに下水道普及率の向上や排水規制の強化などによって河川水質が改善され河川に魚が戻ってきているが 1) 魚の死亡事故件数は近年についてみると毎年 10 件ほど発生している 2 3) 事故原因としては貧酸素や赤潮など気象因子が影響しているものや水生生物に対する影響の大きい農薬などの化学物質によるものがあるが原因不明のものも多い 2 3) 原因不明の場合が多い理由に化学物質等が河川水で希釈されまた速やかに流れ去り検出レベル以下の濃度まで低下してしまうことなどが挙げられるまた化学物質の検索についてはこれまでGC/MSで測定可能な揮発性のある低極性の物質を対象に行ってきたため測定対象物質が限られる制約があった一方 LC/MSはGC/MSでは測定困難な難揮発性高極性熱不安定化合物を測定することが可能となり感度も向上してきた 4,5) すなわち測定対象物質の種類が多くなり化学物質が痕跡量でも検出できるそこで魚の死亡事故の原因解明や緊急時環境調査等に寄与するため LC/MSを用いて農薬の多成分同時分析法を検討したので報告する 2. 方法 2-1 試薬および農薬標準溶液メタノール : LC/MS 分析用アセトニトリル :LC/MS 分析用アセトン : 残留農薬分析用精製水 : ミリポア製 Milli_Q Gradient を用いた固層ディスク : エムポアディスク SDB-XD 酢酸アンモニウム : 試薬特級硝酸 : 試薬特級農薬標準溶液 : 林純薬製 LC/MS 用農薬標準溶液の Mix1~Mix7( 合計で 155 種類の農薬 ) を混合して1μg/ml に調製した 2-2 分析装置の条件表 1にLC/MSの装置条件を示した表 1 LC/MSの装置条件 [ LC 分析条件 ] 装置 : Alliance2695 カラム : Sunfire TM C18 5µm 4.6x150 mm 流速 : 0.2 ml/min 温度 : 40 移動相 : A 液 :H2O B 液 :CH3OH C 液 :100mM-CH3COONH4 注入量 : 5 µl 時間 ( 分 ) A% B% C% グラジエント : [ MS 分析条件 ] 装置 : Quattro Premier Capillary: 5kV SourceTemp: 120 Desolvation Temp: 350 Desolvation Gas: 600L/hr, Cone Gas: 50L/hr,

2 件数原因不明原因解明 0 '80 '82 '84 '86 '88 '90 '92 '94 '96 '98 '00 '02 '04 年度図 1 魚の死亡事故件数の推移 3. 結果及び考察 3-1 魚の死亡事故件数の推移図 1に 1980 年度から 2005 年度までの魚の死亡事故件数の推移を示した 2) 年度毎の事故件数は 1980 年代前半は3 件から 18 件平均して約 10 件発生していたが 1990 年代に入ると 15 件を上回る年が続いたその後事故件数は低下し 2000 年代には再び 10 件程度で推移している事故原因が不明な場合と解明された場合に分けると 1980 年代はじめは9 割ほどの事故原因が解明されていたが徐々に低下し 2000 年度以降は原因不明が7 割を超えるようになったこの理由として以前は事故原因物質がシアンなどの工場等に由来する化学物質で因果関係がはっきりしていたのに対してそのようなケースが少なくなってきていることまた農薬などの化学物質が原因物質であったとしてもその種類は非常に多くかつ採取された試料水中の濃度がかなり低いため特定できなかったことなどが考えられるなお農薬については農業以外にも家庭菜園緑地公衆衛生など多方面で使用されていることも一因になっていると推察される 3-2 マルチプルリアクションモニタリング (MRM) 条件の最適化農薬標準溶液 (1μg/ml) を希釈して 10ng/ml に調製したものを用いた 155 種類の農薬について以下の手順により最適なMRM 条件を求めたただしイオン化法はエレクトロスプレーイオン化 (ESI) とし最初にPositive 測定により最適なMRM 条件を求め次に Positive 測定で感度が出ない物質についてはNegative 測定を行い最適なMRM 条件を求めたまたデュエル時間は各農薬とも 50ms で統一した 1データを連続的なスペクトルとして取り込む方法 (MSScan 法 ) を用いてピーク強度の大きいプレカーサーイオンの m/z を選択する 21つの m/z 値のみをモニターする方法 (SIR 法 ) を用いて 1のプレカーサーイオンの最大感度のコーン電圧 (V) を求める 3プレカーサイオンから開裂させたイオンを見るためのMS/MS 測定モード (Daughters 法 ) を用いて 2の条件下におけるピーク強度の大きいプロダクトイオンの m/z を選択する 4MRM 法により 3の条件で最大感度のコリジョンエネルギー (ev) を求める 5 最後に 1つのグループがなるべく5~15 物質となるように保持時間を区分したその結果最適なグループ数は13グループとなった表 2に対象物質最適 MRM 条件をまた図 2にグループ別に測定したTICクロマトグラフを示したこの条件での分析時間は同定も含めて約 1 時間である 3-3 前処理方法および回収率試験精製水 250ml に農薬標準溶液 10μl( 各 10ng) を添加した後硝酸 (1+10) でpHを 3.5 に調製した次にあらかじめアセトンアセトニトリルメタノールおよび精製水でコンディショニングしたガラス繊維ろ紙 (GF/C) とエムポアディスク (SDB-DX) に通水するそれを精製水 10ml で洗浄し吸引を 30 分間続けて脱水してからアセトニトリル8ml で溶出しその溶出液を窒素ガス吹き付けにより 0.2ml 程度まで濃縮するそれにアセトニトリルを加えて1ml までメスアップしたものをL C/MS 測定用試験溶液とし 3-2 で求めたMRM 条件でLC/MS 測定を行ったこの所要時間は約 4 時間であり LC/MS 測定とあわせて合計約 5 時間となる表 2に回収率を示したただし回収率については3 回の測定値の平均から求め回収率が 50% 以上の 124 物質についてまとめた 4. まとめ河川海域での魚の死亡事故や緊急時の環境調査などに活用するため 124 種類の農薬を対象にLC/MSを用いた多成分同時分析法をまとめた文献 1) 横浜市環境保全局 : 横浜の川と海の生物第 8 報 (1998) 2) 横浜市公害対策局 : 公害との戦い昭和 51 年度 ~ 昭和 57 年度 3) 横浜市環境保全局 : 横浜環境白書昭和 58 年度 ~ 平成 17 年度 4) 環境省総合環境政策局環境保健部環境安全課 :LC /MSを用いた化学物質分析法開発マニュアル 5) 浦山豊弘, 杉山広和, 劒持堅志, 藤原博一, 鷹野洋, 吉岡敏行 : 環境中超微量有害化学物質の分析, 検索技術の開発に関する研究岡山県環境保健センター年報 30 57~62(2006).

3 表 2 対象物質測定条件および回収率 ( その1) 化合物名保持時間モニターイオンコーンコリジョン回収率イオン化法 ( 分 ) プレカサープロダクト電圧 (V) 電圧 (ev) (%) Oxamyl 7.3 ESI Positive Nitenpyram 7.5 ESI Positive Methomyl 7.8 ESI Positive Thiamethoxam 8.1 ESI Positive Imidacloprid 9.4 ESI Positive Clothianidin 9.8 ESI Positive Thiofanox_sulfone 10.2 ESI Positive Vamidothion 10.3 ESI Positive Acetamiprid 10.5 ESI Positive Carbofuran-3-hydroxy 10.6 ESI Positive Dioxacarb 10.6 ESI Positive Chloridazon 10.9 ESI Positive Oxycarboxine 11.7 ESI Positive Tribenuron_methyl 11.9 ESI Positive Thiacloprid 12.0 ESI Positive Tricyclazole 12.5 ESI Positive Butocarboxim 13.0 ESI Positive Aldicarb 13.2 ESI Positive Tepraloxydim_metabolite_DMP 13.6 ESI Positive Metolcarb 14.1 ESI Positive Probenazole 14.2 ESI Positive Azamethiphos 14.5 ESI Positive Propoxur 15.2 ESI Positive Bendiocarb 15.3 ESI Positive Carbofuran 15.3 ESI Positive Aminocarb 15.4 ESI Positive Tebuthiuron 15.6 ESI Positive Isouron 15.9 ESI Positive Thiofanox 16.0 ESI Positive Carbaryl 16.0 ESI Positive MPMC 16.3 ESI Positive Thiodicarb 16.4 ESI Positive Monolinuron 16.6 ESI Positive XMC 16.7 ESI Positive Pirimicarb 17.1 ESI Positive Methabenzthiazuron 17.3 ESI Positive Furametpyr 17.3 ESI Positive Isoprocarb 17.5 ESI Positive Isoxaflutole 17.8 ESI Positive Azafenidin 17.8 ESI Positive Diuron 17.9 ESI Positive Mepanipyrim_metabolite 17.9 ESI Positive ,3,5-Trimethacarb & 3,4,5-Trimethacarb 18.0 ESI Positive Triforin 18.3 ESI Positive Phenmedipham 18.3 ESI Positive Pyriftalid 18.6 ESI Positive Fluridon 18.6 ESI Positive Azoxystrobin 18.8 ESI Positive Azinphos methyl 18.8 ESI Positive Fenobucarb 19.0 ESI Positive Dimethomorph-E 19.1 ESI Positive Inabenfide 19.1 ESI Positive Linuron 19.2 ESI Positive Methiocarb / Mercaptodimetur 19.3 ESI Positive Acibenzolar-S-methyl 19.3 ESI Positive Fenamidone 19.4 ESI Positive Benzobicyclon 19.6 ESI Positive Boscalid 19.6 ESI Positive Dimethomorph-Z 19.7 ESI Positive Promecarb 19.7 ESI Positive Methoxyfenozide 19.8 ESI Positive Dymuron 20.0 ESI Positive

4 表 2 対象物質測定条件および回収率 ( その2) 化合物名保持時間モニターイオンコーンコリジョン回収率イオン化法 ( 分 ) プレカサープロダクト電圧 (V) 電圧 (ev) (%) Cumyluron 20.2 ESI Positive Chloroxuron 20.2 ESI Positive Butafenacil 20.3 ESI Positive Chromafenozide 20.3 ESI Positive Tralkoxydim ESI Positive Mepanipyrim 20.5 ESI Positive Triticonazole 20.6 ESI Positive Triflumizole_metabolite 20.6 ESI Positive Iprovalicarb 20.6 ESI Positive Oryzalin 20.7 ESI Negative Epoxiconazole 20.7 ESI Positive Simeconazole 20.7 ESI Positive Tepraloxydim_metabolite_OH-DMP 20.7 ESI Positive Cyazofamid 20.7 ESI Positive Indanofan 20.8 ESI Positive Flufenacet 20.8 ESI Positive Diflubenzuron 21.0 ESI Positive Diflubenzuron 21.0 ESI Positive Naproanilide 21.0 ESI Positive Fenoxycarb 21.1 ESI Positive Tebufenozide 21.1 ESI Positive Tetrachlorvinphos 21.3 ESI Positive Fentrazamid 21.6 ESI Positive Anilofos 21.6 ESI Positive Carpropamid 21.7 ESI Positive Cyprodinil 21.9 ESI Positive Pyraclostrobin 22.0 ESI Positive Cyflufenamid 22.0 ESI Positive Phoxim 22.0 ESI Positive Triflumuron 22.1 ESI Positive Prochloraz 22.1 ESI Positive Pyrazolate 22.2 ESI Positive Pyrazolynate 22.3 ESI Positive Pencycuron 22.4 ESI Positive Clofentezine 22.4 ESI Positive Indoxacarb MP 22.4 ESI Positive Hexaflumuron 22.5 ESI Negative Novalron 22.5 ESI Positive Terbucarb 22.6 ESI Positive Triflumizole 22.8 ESI Positive Benzofenap 22.9 ESI Positive Fenoxaprop-ethyl 23.0 ESI Positive Oxaziclomefone 23.1 ESI Positive Pentoxazone 23.1 ESI Positive Quizalofop-ethyl 23.1 ESI Positive Lactofen 23.2 ESI Positive Furathiocarb 23.2 ESI Positive Clomeprop 23.3 ESI Positive Lufenuron 23.3 ESI Positive Propaquizafop 23.3 ESI Positive Imibenconazole 23.5 ESI Positive Aramite 23.5 ESI Positive Fenpyroximate_E 23.5 ESI Positive Teflubenzuron 23.6 ESI Positive Cloquintocet mexyl 23.6 ESI Positive Hexythiazox 23.8 ESI Positive Flufenoxuron 23.9 ESI Positive Cycloprothrin 24.2 ESI Positive Chlorfluazuron 24.4 ESI Positive Fenpyroximate_Z 24.4 ESI Positive Acequinocyl 24.7 ESI Positive Abamectin 25.2 ESI Positive

5 図 2 TIC クロマトグラフ

積極的に行われており, これらの分析法の簡素化は調査を行う上で重要であると考えるここで,PFCsのJIS 試験法 5),LASの告示法 6), 農薬の多成分同時分析法 7) について着目すると, いずれも固相抽出で前処理を行いLC/MS/MSで測定する分析法であり, 分析操作が酷似しているまた,

積極的に行われており, これらの分析法の簡素化は調査を行う上で重要であると考えるここで,PFCsのJIS 試験法 5),LASの告示法 6), 農薬の多成分同時分析法 7) について着目すると, いずれも固相抽出で前処理を行いLC/MS/MSで測定する分析法であり, 分析操作が酷似しているまた, 有機フッ素化合物 (PFCs) と直鎖アルキルベンゼンスルホン酸及びその塩 (LAS) の同時分析法の開発及び農薬分析への適用性の評価農薬の回収率データの一部に誤りがありましたので修正しました ( 平成 27 年 2 月 20 日 ) 中堀靖範要旨有機フッ素化合物 (PFCs) と直鎖アルキルベンゼンスルホン酸及びその塩 (LAS) の同時分析法の開発を検討した結果, 和光純薬製 PFCⅡを用いることで

横浜市環境科学研究所所報第 33 号 2009 LC/MS を用いた農薬の多成分同時分析法 二宮勝幸 ( 横浜市環境科学研究所 ) Study on simultaneous analysis of pesticides by LC/MS/MS Katsuyuki Ninomiya (Yokoham

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