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しのぶいせき
5 years ago
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1 生物学レポートヒトとウシのヘモグロビン α 鎖と酵素タンパク質 trypsin について一次構造と高次構造を調べ比較する畜産学科 1 年学籍番号氏名藍愛子提出日 :2012 年 6 月 27 日 1

2 はじめにレポートの課題説明に記述されていたこのレポートの課題は以下のように要約される大学でそれぞれの科目を学習する大きな目的と意義はある学問体系の中で何がわかっていて何がわからないのかわからないことを解き明かすためにはどうしたらよいのかということ理解して習得することであるそのために専門科目では講義と実習がペアになっているしかしながら教養科目の一つであるこの生物学は講義が中心で実習は組み込まれていないそこで担当者は講義の中で我々の生物学に対する興味を呼び起こし何らかの形で学生が積極的能動的な学習態度を身に着けさせるためにこのようなレポートを課したということであるそういえば担当者は繰り返し active learner になれと叫んでいた講義を受けているのは受け身に感じるかもしれないが講義を聴きメモをを取り自分なりのノートを作ることにより active learner になれるということだった今回のレポートは積極的にデータベースを自分で調べることにより講義の中で学習したタンパク質翻訳ソーティング酵素活性中心異なる動物間での比較 ( 進化 ) といったトピックを学ぶことが目的である今やネット上には多数のデータベースが構築されていて多くのものは自由にそのデータを閲覧し利用することができるそうだ今回細胞が作り出すタンパク質のデータベースにアクセスしてみていろいろなことを学べそうだと思って真剣に取り組んだ次のページからは実際にどのようにしてデータを収集しどんなことを学んだかを述べてゆくデータベースへのアクセスは自宅から 6 月 12 日深夜に行い翌日の 13 日に図書館で分からなかったことを調べ 6 月 15 日にレポートとして完成させた 2

3 ヒトヘモグロビン α 鎖タンパク質指示に従って ExPASy の下記のサイトにアクセスし Search の欄に検索語 hemoglobin human を入力して検索結果のリストから求めるヒトの hemoglobin alpha subunit は P69905 なのでこの数字をクリックしたその結果次のページが表示されたこのページに記載された名前などの主な情報は以下のとおりである 142 個のアミノ酸からなるが先頭のメチオニンは切り離されて最終的な形になる赤血球に含まれるヘモグロビンの構成要素でヘモグロビンβ 鎖とともに四量体 (2α2 β) となる酸素運搬タンパク質であるたくさんの Natural variant が記載されているこれらはみな突然変異体である上記ページの下のほうに記載された配列データから入手したヒトの hemoglobin alpha subunit のアミノ酸配列 ( 一次構造 ) は次の通りである先頭の赤色の M は切り離されて最終的には 141 個のアミノ酸からなるα 鎖になる実際に酸素を結合するヘムは 59 番目と 88 番目のヒスチジン (H 水色で示している) によって上下からキレート結合によって支えられている MVLSPADKTN VKAAWGKVGA HAGEYGAEAL ERMFLSFPTT KTYFPHFDLS HGSAQVKGHG KKVADALTNA VAHVDDMPNA LSALSDLHAH KLRVDPVNFK LLSHCLLVTL AAHLPAEFTP AVHASLDKFL ASVSTVLTSK YR メチオニンを切り離し二次構造 (Secondary structure) の項にあるデータ (Details をクリック ) から得た配列データを見て αへリックスを下線を引いて示したヘモグロビンにはβストランドはない 3

4 VLSPADKTNV KAAWGKVGAH AGEYGAEALE RMFLSFPTTK TYFPHFDLSH GSAQVKGHGK KVADALTNAV AHVDDMPNAL SALSDLHAHK LRVDPVNFKL LSHCLLVTLA AHLPAEFTPA VHASLDKFLA SVSTVLTSKY R 3D strucurae databases から PDB 登録番号を 1a00 を得てこれを次のサイトの該当箇所に入力して次のような三次元の構造を得た分子を回転させてヘムがよく見えるように位置を整えた灰色とピンク色がα 鎖で黄色と薄緑色はβ 鎖図 1 ヘモグロビン (α2β2) の立体構造タンパク質はリボン構造でヘムは空間充填構造で示してある 4

図 2 図 1 の灰色の α 鎖の N 末端と C 末端およびヘムの位置を明示したウシのヘモグロビンα 鎖タンパク質前記のタンパク質データベースからすぐ下に登録されているウシのヘモグロビンα 鎖について調べた http://www.uniprot.

5 図 2 図 1 の灰色の α 鎖の N 末端と C 末端およびヘムの位置を明示したウシのヘモグロビンα 鎖タンパク質前記のタンパク質データベースからすぐ下に登録されているウシのヘモグロビンα 鎖について調べたアミノ酸の数は 142 個でヒトと同じであるそのほかの記述もヒトの場合とほとんど同じであるそこでさっそくアミノ酸配列を得てメチオニンを切り離した成熟型のタンパク質を記す VLSAADKGNV KAAWGKVGGH AAEYGAEALE RMFLSFPTTK TYFPHFDLSH GSAQVKGHGA KVAAALTKAV EHLDDLPGAL SELSDLHAHK LRVDPVNFKL LSHSLLVTLA SHLPSDFTPA VHASLDKFLA NVSTVLTSKY R 5

6 α へリックスの範囲が最初の方で若干違っているがヒスチジンの位置は同じであるヒトとウシヘモグロビン α 鎖タンパク質のアミノ酸配列と立体構造の比較そこでヒトとブタの成熟型ペプシンのアミノ酸配列を並べて異同を比較してみた ( 上の文字列を順番にコピーして並べていけばよい ) ウシで異なるアミノ酸を赤色にしてある Human MVLSPADKTN VKAAWGKVGA HAGEYGAEAL ERMFLSFPTT KTYFPHFDLS HGSAQVKGHG ウシ MVLSAADKGN VKAAWGKVGG HAAEYGAEAL ERMFLSFPTT KTYFPHFDLS HGSAQVKGHG Human KKVADALTNA VAHVDDMPNA LSALSDLHAH KLRVDPVNFK LLSHCLLVTL AAHLPAEFTP ウシ AKVAAALTKA VEHLDDLPGA LSELSDLHAH KLRVDPVNFK LLSHSLLVTL ASHLPSDFTP Human AVHASLDKFL ASVSTVLTSK YR ウシ AVHASLDKFL ANVSTVLTSK YR 17 のアミノ酸が異なっているので 11.9%(17/142x100) の違い逆に言うと 88.1% のアミノ酸は同じであるさらにアミノ酸が異なっていてもその性質は似ているものが多い ( 疎水性の側鎖を持つアミノ酸はやはり疎水性も持ったアミノ酸に親水性の側鎖のものは同じく親水性に変わっている ) そのために大きな立体的な構造は変わらないものと考えられるそこで三次元構造を PDB 登録番号 1fsx として上と同じ方法で表示したヒトと同じ位置関係になるように回転させた図は次のとおりである立体構造はほとんど変わらないことがわかるこのようにヒトとウシではこのタンパク質のアミノ酸配列はよく保存されていて立体構造も大きな違いがないことがわかったこのタンパク質はシグナル領域が無いので細胞内で利用される ( 実際は赤血球内 ) 6

7 図 3 ウシヘモグロビンの立体構造図 1 と同じ位置から見たようにしたヒト trypsin-1 分泌性のタンパク質としてこの酵素タンパク質を選んだらしい指示された通りに trypsin-1 human で検索して次のページを表示したここに記されたこの酵素の概要はアミノ酸 247 からなるがさらに処理されて最終的な形 ( 成熟型 ) になるモノマーで働くタンパク質分解酵素で塩基性アミノ酸であるアルギニンとリジンのカルボキシル末端側のペプチド結合を切断するという特異性を持つ下のほうに記載された配列データから入手したヒトの Trypsin-1 のアミノ酸配列 ( 一次構造 ) は次の通りである Molecular processing の項に書かれているように先頭の茶色の 15 アミノ酸はシグナル領域次の水色の 8 アミノ酸は切り離されるペプチド ( プロペプチド ) 領域でこれが切り離されてアミノ酸 223 個の活性のあるトリプシンになる活性部位のアミノ酸は 3 つで 63 番目のヒスチジン H と 107 番目のアスパラギン酸 D と 200 番目の 7

8 セリン S で赤で示してある MNPLLILTFV AAALAAPFDD DDKIVGGYNC EENSVPYQVS LNSGYHFCGG SLINEQWVVS AGHCYKSRIQ VRLGEHNIEV LEGNEQFINA AKIIRHPQYD RKTLNNDIML IKLSSRAVIN ARVSTISLPT APPATGTKCL ISGWGNTASS GADYPDELQC LDAPVLSQAK CEASYPGKIT SNMFCVGFLE GGKDSCQGDS GGPVVCNGQL QGVVSWGDGC AQKNKPGVYT KVYNYVKWIK 250 NTIAANS 上の一次配列から先頭のシグナル配列とプロペプチドを切り離して最終の形 ( 成熟型 ) にすると 224 アミノ酸からなる次の配列となる番号を付け直しさらに 5 本の SS 結合 (2 つのシステイン残基の SH 基が-S-S-と結合したもの ) を線で示したこれらの SS 結合とβシート構造が多いことによって立体構造は強固なものになっている IVGGYNCEEN SVPYQVSLNS GYHFCGGSLI NEQWVVSAGH CYKSRIQVRL GEHNIEVLEG NEQFINAAKI IRHPQYDRK TLNNDIMLIKL SSRAVINARV STISLPAPTP ATGTKCLISG WGNTASSGAD YPDELQCLDA PVLSQAKCEA SYPGKITSNM FCVGFLEGGK DSCQGDSGGP VVCNGQLQGV VSWGDGCAQK NKPGVYTKVY NYVKWIKNTI AANS PDB 登録番号 1FXY から次の三次元構造を得た 8

9 図 4 ヒトトリプシンの立体構造活性部位に阻害剤が結合した形で表されているウシ trypsin 前記のタンパク質データベースから trypsin bovine を検索語にして次のページを得たウシの場合はアミノ酸 246 個からなるタンパク質でアミノ酸配列 ( 一次構造 ) は以下のとおりであるヒトのものよりもアミノ酸が一つ少ない MKTFIFLALL GAAVAFPVDD DDKIVGGYTC GANTVPYQVS LNSGYHFCGG SLINSQWVVS AAHCYKSGIQ VRLGEDNINV VEGNEQFISA SKSIVHPSYN SNTLNNDIML IKLKSAASLN SRVASISLPT SCASAGTQCL ISGWGNTKSS GTSYPDVLKC LKAPILSDSS CKSAYPGQIT SNMFCAGYLE GGKDSCQGDS GGPVVCSGKL QGIVSWGSGC AQKNKPGVYT KVCNYVSWIK 250 QTIASN 9

10 翻訳直後の分子ではアミノ酸の数が一つ少ないが分子のプロセッシングの項目を見てみるとシグナルペプチドは 17 プロペプチドは 6 個となっていてやはり成熟型タンパク質でもアミノ酸は一つ少ないヒトとウシ Glucokinase のアミノ酸配列の比較ヘモグロビンαの場合と同じようにヒトとウシのトリプシンのアミノ酸配列の比較を行ってみた今度は翻訳直後の配列を比較してみる Human MNPLLILTFV AAALAAPFDD DDKIVGGYNC EENSVPYQVS LNSGYHFCGG SLINEQWVVS Bovine MKTFIFLALL GAAVAFPVDD DDKIVGGYTC GANTVPYQVS LNSGYHFCGG SLINSQWVVS Human AGHCYKSRIQ VRLGEHNIEV LEGNEQFINA AKIIRHPQYD RKTLNNDIML IKLSSRAVIN Bovine AAHCYKSGIQ VRLGEDNINV VEGNEQFISA SKSIVHPSYN SNTLNNDIML IKLKSAASLN Human ARVSTISLPT APPATGTKCL ISGWGNTASS GADYPDELQC LDAPVLSQAK CEASYPGKIT Bovine SRVASISLPT SCASAGTQCL ISGWGNTKSS GTSYPDVLKC LKAPILSDSS CKSAYPGQIT Human SNMFCVGFLE GGKDSCQGDS GGPVVCNGQL QGVVSWGDGC AQKNKPGVYT KVYNYVKWIK Bovine SNMFCAGYLE GGKDSCQGDS GGPVVCSGKL QGIVSWGSGC AQKNKPGVYT KVCNYVSWIK 250 NTIAANS QTI-ASN 下線を引いたアミノ酸が異なっているが実際の酵素本体である 24 番目以降だけに注目してその配列の違いを数えると 23.3%(52/223x100) の違い逆に言うと 76.7% のアミノ酸は同じであるのでヘモグロビンαよりもアミノ酸の一次構造の違いは大きい ( 動物による変異が多い ) ことになるしかしながら活性部位の 3 つのアミノ酸とその周辺はほぼ同じアミノ酸配列であるそこでウシのトリプシンの PDB として 1AQ7 を選び立体構造を比較した 10

図 5 ウシのトリプシンの立体構造これも活性部位に阻害剤が結合しているアミノ酸配列の相同性はヘモグロビンよりも低かったが立体構造は良く似ていることが分かるこのような立体構造をとることにより上に述べた活性部位を形作る 3 つのアミノ酸 3 番目のヒスチジン H 107 番目のアスパラギン酸 D 200 番目のセリン S がお互いに近づき電子の流れが起こってセリンに供給され

11 図 5 ウシのトリプシンの立体構造これも活性部位に阻害剤が結合しているアミノ酸配列の相同性はヘモグロビンよりも低かったが立体構造は良く似ていることが分かるこのような立体構造をとることにより上に述べた活性部位を形作る 3 つのアミノ酸 3 番目のヒスチジン H 107 番目のアスパラギン酸 D 200 番目のセリン S がお互いに近づき電子の流れが起こってセリンに供給されこのセリンの余分な電子がペプチド結合を切断する役割をはたすセリンを含むこのようなはたらきをする酵素のグループをセリンプロテアーゼファミリーと呼びキモトリプシンやトロンビンもそのうちの一つであるこのタンパク質はシグナル領域があるので分泌性で細胞の外に出されるタンパク質である実際には膵臓でつくられ顆粒に貯えられ消化管内へ分泌されるその後先頭の部分が切り離され活性型の酵素になるさらにもう少し分類学的に離れた動物のこれらのタンパク質のアミノ酸配列の比較をすると面白いかもしれないと思った今回は時間がなかったので夏休みを利用してもう一度チャレンジしてみようと思っているネット上にある情報からこれまで生物学で習ったことのいろいろな側面が見えてくるようで興味深かった ( レポート終わり表紙を除き 10 枚 ) 11

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<4D F736F F D20838C837C815B836789DB91E890E096BE2E646F6378> レポートについて 1. 課題以下に記した手順に従ってヒトのヘモグロビンα 鎖タンパク質と酵素タンパク質 trypsin についてその一次構造をタンパク質データベースにアクセスして調べさらにその二次構造と三次構造を ProteinDataBank へアクセスして確認する以上の経過と結果をいつどこで調べたかを含めてその過程を記述しさらに検索結果である両タンパク質の一次構造分子の形 (