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かねろうつなかわ
5 years ago
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1 イーズ NO.002(15 年 8 月発行 ) 日本薬局方微生物限度試験法微生物限度試験法の実際監修 : 国立衛生試験所三瀬勝利前号では微生物限度試験法について全体的な解説を行ったが本号では生菌数試験大腸菌サルモネラ緑膿菌黄色ブドウ球菌の試験項目ごとにそれぞれ実際の試験の流れを図解してみた試験を行う際に役立てて頂ければ幸いであるまた無菌試験法についても補冊として添付したので参照されたい試験方法に関するさらに詳細な情報と手技については厚生省薬務局研究開発振興課監修 : 日本薬局方技術情報 15, 薬業時報社に記載されているので利用されると良いなお今回紙面の都合上掲載できなかったの際のコロニーや試薬反応などのカラー写真掲載については別の機会に検討したい

2 1-1. 生菌数試験メンブランフィルター法試料溶液の準備 20 ( 細菌 ) ( 真菌 ) 試料溶液のろのろ過 [ メンブランフィルター ] 直径 : 約 50mm 孔径 :0.45μm 以下ろ過洗浄 ( 回以上 ) [ 洗浄液 ] ペプトン食塩緩衝液リン酸緩衝液または使用する液体培地フィルターを平板平板に置くポテトデキストロースカンテン培地 GP カンテン培地のどれか 1 種類 ( 抗生物質添加 ) 30~35 20~25 < 例 > 集落の計測信頼度の高い計測値が得られた場合に限り 5 日以前の計測値を採用してもよい

3 1-2. 生菌数試験カンテン平板混釈平板混釈法試料溶液の調製原液 2 10 倍希釈液 2 ( 細菌 ) ( 真菌 ) ( 細菌 ) ( 真菌 ) 試料溶液の分注 15~20 15~20 15~20 15~20 培地の分注分注混釈ポテトデキストロースカンテン培地 GP カンテン培地ポテトデキストロースカンテン培地 GP カンテン培地のどれか 1 種類 ( 抗生物質添加 ) のどれか 1 種類 ( 抗生物質添加 ) 培地の固化 30~35 20~25 30~35 20~25 [ 例 ] 原液 10 倍希釈液集落の計測ソイビーンカゼインダイジェストカンテン培地 265 コロニー 38 コロニーサブローブドウ糖カンテン培地 5 コロニー 3 コロニー信頼度の高い計測値が得られた場合に限り 5 日以前の計測値を採用してもよい

4 1-3. 生菌数試験カンテン平板塗抹平板塗抹法試料溶液の調製原液 10 倍希釈液 ( 細菌 ) ( 真菌 ) ( 細菌 ) ( 真菌 ) 0.05~ ~ ~ ~0.2 試料溶液の接種ポテトデキストロースカンテン培地 GP カンテン培地ポテトデキストロースカンテン培地 GP カンテン培地のどれか 1 種類 ( 抗生物質添加 ) のどれか 1 種類 ( 抗生物質添加 ) 試料溶液の塗抹 30~35 20~25 30~35 20~25 [ 例 ] 原液 10 倍希釈液集落の計測ソイビーンカゼインダイジェストカンテン培地 265 コロニー 38 コロニーサブローブドウ糖カンテン培地 5 コロニー 3 コロニー信頼度の高い計測値が得られた場合に限り 5 日以前の計測値を採用してもよい培地の性能試験及び発育阻止物質の確認試験については第十二改正日本薬局方第二追補をご参照ください

5 1-4. 生菌数試験生菌数試験液体培地段階希釈法 ( 最確数法 ) 希釈液の接種 ( 対照実験 ) 10 希釈液 1 試料溶液 ( 対照 1) 希釈液 2 ( 対照 2) 希釈液 3 ( 対照 3) (: ソイビーンカゼインダイジェスト培地 ) 試料溶液の希釈希釈液 1( 10) 希釈液 2( 100) 希釈液 3( 1,000) 希釈したした試料溶液試料溶液の接種試料接種後の希釈液 1 試料接種後の希釈液 2 試料接種後の希釈液 3 30~35 以上対照対照対照 3 1,000 1,000 1,000 試料 1g 又は当たりの細菌の最確数結果のが難しい場合またはあいまいな結果の場合はカンテン培地または液体培地に 0. を移植し 30~35 で 24~72 時間し増殖の有無をする当たりのたりの最確数 0 ( 本試験は細菌のみに用いる試験である )

6 2-1. 特定微生物試験大腸菌大腸菌 (Escherichia coli) 試料の準備調製した試料 10g または 10 試料溶液の接種 0 乳糖ブイヨン増菌 30~35 24~72 時間陽性陰性マッコンキーカンテン培地大腸菌陰性 30~35 18~24 時間赤レンガ色の集落発育なしグラム染色グラム陰性桿菌大腸菌陰性周囲に赤味がかった沈降線の帯を持つ赤レンガ色のグラム陰性菌の集落が検出されない EMB カンテン培地 30~35 18~24 時間金属光沢の集落青黒色の集落 IMViC 試験 IND MR VP Cit IND: インドール産生試験 MR: メチルレッド反応試験 VP: フォーゲスプロスカウエル試験 Cit: クエン酸塩利用試験大腸菌陽性大腸菌陰性金属光沢または透過光下で青黒色を帯びた集落が検出されない

7 2-2. 特定微生物試験サルモネラサルモネラ (Salmonella) 試料の準備調製した試料 10g または 10 試料溶液の接種 0 乳糖ブイヨン増菌 30~35 24~72 時間陽性陰性サルモネラ陰性接種セレナイトシスチン液体培地またはラパポート液体培地テトラチオネート液体培地 30~35 12~24 時間ブリリアントグリーンカンテン培地 XLD カンテン培地亜硫酸ビスマスカンテン培地の内 2 種類以上に塗抹

8 30~35 24~48 時間発育なしサルモネラ特有の集落それ以外の集落培地ブリリアントグリーンカンテン培地 XLD カンテン培地亜硫酸ビスマスカンテン培地集落の特徴小型で無色透明又は不透明で白色 ~ 桃色 ( しばしば周囲に桃色 ~ 赤色の帯が形成される ) 赤色, 中心部に黒点が現れる場合とそうでない場合がある黒色又は緑色サルモネラ陰性グラム染色グラム陰性桿菌接種 TSI 斜面カンテン培地 35~37 18~24 時間赤色黄色陽性赤色黒色黄色詳細な確認試験生化学的試験血清学的試験サルモネラ陽性

9 2-3. 特定微生物試験緑膿菌緑膿菌 (Pseudomonas aeruginosa) 試料の準備調製した試料 10g または 10 試料溶液の接種 0 ソイビーンカゼインダイジェスト培地または抗菌性物質を含まない適当な液体培地 30~35 24~48 時間陽性陰性セトリミドカンテン培地または NAC カンテン培地緑膿菌陰性 30~35 24~48 時間緑がかった蛍光集落発育なしグラム染色緑膿菌陰性フルオレセイン検出用シュードモナスカンテン培地ピオシアニン検出用シュードモナスカンテン培地 30~35 24~72 時間黄色の蛍光集落それ以外青色の蛍光集落それ以外フルオレセイン陽性緑膿菌陰性ピオシアニン陽性緑膿菌陰性オキシダーゼ試験 N.N- ジメチル -P- フェニレンジアミン塩酸塩をしみこませたろ紙 5~10 秒以内に紫色に変化無変化緑膿菌陽性緑膿菌陰性キットの使用を含む適当な生化学的試験の併用も可能

10 2-4. 特定微生物試験黄色黄色ブドウブドウ球菌 (Staphylococcus aureus) 試料の準備調製した試料 10g または 10 試料溶液の接種 0 ソイビーンカゼインダイジェスト培地または抗菌性物質を含まない液体培地増菌 30~35 24~48 時間陽性陰性フォーゲルジョンソンカンテン培地ベァードパーカーカンテン培地またはマンニット食塩カンテン培地黄色ブドウ球菌陰性 30~35 24~48 時間培地フォーゲルジョンソンカンテン培地ベァードパーカーカンテン培地集落の特徴黄色の帯に囲まれた黒色透明な帯に囲まれた黒色光沢ありそれ以外の集落発育なしマンニット食塩カンテン培地黄色の帯に囲まれた黄色黄色ブドウ球菌陰性グラム染色コアグラーゼ試験ウサギまたはウマの血漿 ±1 3 時間凝固液状黄色ブドウ球菌陽性 37±1 適当な時間ごと 24 時間まで凝固液状黄色ブドウ球菌陽性黄色ブドウ球菌陰性

鶏大腸菌症 ( 組換え型 F11 線毛抗原ベロ細胞毒性抗原 )( 油性アジュバント加 ) 不活化ワクチン平成 20 年 6 月 6 日 ( 告示第 913 号 ) 新規追加平成 25 年 9 月 26 日 ( 告示第 2480 号 ) 一部改正 1 定義組換え型 F11 線毛抗原産生大腸菌及びベ

鶏大腸菌症 ( 組換え型 F11 線毛抗原ベロ細胞毒性抗原 )( 油性アジュバント加 ) 不活化ワクチン平成 20 年 6 月 6 日 ( 告示第 913 号 ) 新規追加平成 25 年 9 月 26 日 ( 告示第 2480 号 ) 一部改正 1 定義組換え型 F11 線毛抗原産生大腸菌及びベ鶏大腸菌症 ( 組換え型 F11 線毛抗原ベロ細胞毒性抗原 )( 油性アジュバント加 ) 不活化ワクチン平成 20 年 6 月 6 日 ( 告示第 913 号 ) 新規追加平成 25 年 9 月 26 日 ( 告示第 2480 号 ) 一部改正 1 定義組換え型 F11 線毛抗原産生大腸菌及びベロ細胞毒性抗原産生大腸菌の培養菌液を不活化しその遠心上清を濃縮後油性アジュバントを添加したワクチンである