Microsoft PowerPoint - 新リステリア手順書 ppt

Size: px

Start display at page:

Download "Microsoft PowerPoint - 新リステリア手順書 ppt"

さなえしげい
5 years ago
Views:

1 資料 CONTENTS I. III. 参考文献 20

I. クリーンベンチ ( 図 16) 外界と遮断された空間をつくる装置でこの中で実験を行えば大気からの汚染を防ぐことができます実験を行う前に紫外線で装置内の雑菌を殺し実験中は細かい目のフィルタを通した清澄な空気を装置内に送り込むことによって装置内を陽圧に保ち装置外装置内に雑菌が入らないようにしますタイプとして作業域のエアーを直接排出するタイプと

作業域のエアーを直接排出しないバイオクリーンベンチか生物学的安全キャビネットを使用してください図 16.

2 I. クリーンベンチ ( 図 16) 外界と遮断された空間をつくる装置でこの中で実験を行えば大気からの汚染を防ぐことができます実験を行う前に紫外線で装置内の雑菌を殺し実験中は細かい目のフィルタを通した清澄な空気を装置内に送り込むことによって装置内を陽圧に保ち装置外装置内に雑菌が入らないようにしますタイプとして作業域のエアーを直接排出するタイプとエアーカーテンを作り作業域のエアーを直接排出しないタイプ ( 一般的にバイオクリーンベンチと呼ばれる ) があります試薬調製はコンタミネーションを防止する為に必ずクリーンベンチか安全キャビネット内で操作を行ってくださいなお PC やサンプルの取扱は絶対に排出型クリーンベンチでは行わず作業域のエアーを直接排出しないバイオクリーンベンチか生物学的安全キャビネットを使用してください図 16. クリーンベンチ生物学的安全キャビネット ( 図 17) クリーンベンチとは逆に装置外にウイルス等が漏出しないよう装置内を陰圧に保ちます装置内の空気はフィルターを通した後一部は排気され残りの空気は再びフィルターを通して循環されます更に実験者が手を入れて材料等を取り扱う面はエアーカーテンを作ることにより内側の汚れている又はそのおそれのある空気と実験者を遮断しますこれにより実験者の安全性を高めかつ実験材料と接した空気を濾過した後排出することができます L.monocytogenes はバイオセーフティレベル ( 生物学的危険度 )2 に分類されますのでクラス IIA 以上の安全キャビネット内で扱うことになっています図 17. 生物学的安全キャビネット 21

3 LAMP 反応は遺伝子を対象とし大量の DNA 産物を生成する遺伝子増幅検査です検体遺伝子の取り扱いを誤ると検査結果に大きく影響します検査実施の際には以下の注意点をよくご理解いただき検査を実施してください遺伝子増幅検査をおこなう上では主にバイオハザード ( 検体処理時 ) DNase RNase のコンタミネーション遺伝子のコンタミネーション ( 遺伝子抽出操作試薬調製反応液と抽出遺伝子の混合操作時 ) バイオハザードバイオセーフティに基づいた注意事項を遵守しますの 3 点に対する注意が重要になります原則施設にバイオセーフティ関連規則があればそれを遵守します生物学用安全キャビネット内もしくは検査処理専用の領域で操作を行いますドラフト内作業台の使用前後には次亜塩素酸ナトリウム水溶液での洗浄やUV 照射を施します使用する器具は領域専用とします領域外に持ち出す際にはバイオハザード対策を施した後としますマスク手袋および保護メガネを着用します作業前後には手洗いを実施します作業中の飲食喫煙は厳禁とします DNase RNase のコンタミネーション検査に使用するチューブ等は滅菌されたものを使用し使用後は廃棄します手袋マスクを着用します検査中の私語検査室内での飲食喫煙は控えます RNAを取り扱う場合には上記注意事項に加えて以下の点にも注意します検査に使用する水は DEPC 処理水などRNaseフリーの水を用います RNA 検査実施検査台や検査器具を他と区別します遺伝子のコンタミネーション遺伝子のコンタミネーションを防ぐために以下の処置を実施します遺伝子混入を防ぐ環境を整える作業領域 --- 作業領域分けをする使用機材試薬等 --- 各領域専用とし他領域への持ち込みは行わない作業者 --- 使い捨ての手袋きれいな白衣を使用極力遺伝子高濃度領域から低濃度領域への移動は避けます器具 --- 使用前後は次亜塩素酸ナトリウム水溶液 DNA RNA 除去剤や紫外線 (UV) を用いて遺伝子を除去します次亜塩素酸ナトリウム水溶液を使用の際には換気を十分にしてください操作中におけるクロスコンタミネーションを防ぐ疎水性フィルター付きチップを使用し使用後は廃棄しますチューブ蓋の開閉時などではチューブ内壁蓋裏面には触れないように注意しますサイズの合った使い捨ての手袋を使用します遺伝子の入ったチューブへの分注などは極力避けます増幅産物からの遺伝子コンタミネーションを防ぐ増幅反応後のチューブの蓋は開封しないでください増幅産物の電気泳動はおこなわないでくださいやむを得ず開封して増幅産物を取り扱う際にはコンタミネーションに十分配慮し行ってください増幅産物の廃棄には次亜塩素酸ナトリウム水溶液等を用いて遺伝子の除去処理を行うなど施設の基準に則り廃棄してください増幅産物が入っているチューブは決してオートクレーブをかけないでください次亜塩素酸ナトリウム水溶液を使用の際には換気を十分にしてください 22

4 バイオセーフティに基づいた注意事項遺伝子増幅検査の結果への影響より検査担当者の安全を目的とした対策となります検査対象物は病原微生物の感染の可能性があるため検査実施の際にはそれを念頭において操作を行う必要がありますバイオハザードを考慮すべき操作は検査対象物そのものの搬入から抽出操作すなわち微生物の不活化処理の間となります設備等諸条件は各施設の該当規則に則して実施してくださいまた国立感染症研究所病原体等安全管理規定にバイオセーフティに関する規定があります対象の微生物に応じ必要な設備を整えたうえで検査を実施してください以下に主な注意事項を記します 1. 検査対象物の取り扱い生物学用安全キャビネット内もしくは検査処理専用の領域で操作を行いますドラフト内作業台の使用前後には次亜塩素酸ナトリウム水溶液で拭きます併せて可能であれば使用前後にはUV 照射を施します施設にバイオセーフティ関連規則があればそれを遵守します 2. 器具使用する器具は領域専用とします領域外に持ち出す際にはバイオハザード対策を施した後とします施設にバイオセーフティ関連規則があればそれに遵守します 3. 検査担当者マスク手袋および保護メガネを着用します作業前後には手洗いを実施します作業中の飲食喫煙は厳禁とします施設にバイオセーフティ関連規則があればそれに遵守します DNase RNase のコンタミネーションを防ぐために DNase RNase は汗唾液涙など生体の細胞や分泌液に含まれておりサンプル内に混入すると本来存在している遺伝子が分解され遺伝子増幅反応がなされず結果として擬陰性を引き起こすことになります DNase RNaseの混入を防ぐため以下の点に基づいた対策をとります検査に使用するチューブ等は使い捨てのものを使用します検査従事者は必ず手袋マスクを着用し検査従事者自身の唾液や汗からの混入を防ぎます検査中の私語検査室内での飲食喫煙は控えます RNAを取り扱う場合には上記注意事項に加えて以下の点にも注意します検査に使用する水は DEPC 処理水などDNase RNaseフリーの水を用います RNA 検査実施検査台や検査器具を他と区別します各器具のDNase RNaseフリー化 1チューブ市販の滅菌済み未使用チューブを使用します使用後は廃棄します 2チップ市販の滅菌済疎水性フィルター付きチップを使用します使用後は廃棄します 3 その他器具極力素手で触らず手袋を着用した上で使用操作します使用後は廃棄します検査担当者からのDNase RNaseコンタミネーション防止の徹底 1 マスク手袋の着用マスクは使い捨てのものを使用します領域外への移動は極力避けるようにします使い捨て手袋 ( ラテックス手袋など ) を着用します各領域内に限り使用とします他領域への持込は厳禁とします領域外へ移動せざるを得ない場合には領域 A B C D( 遺伝子低濃度領域から高濃度領域 ) の移動のみとし領域 D C B Aへの移動は厳禁とします 2 検査室での私語飲食喫煙の厳禁検査室内特に検査中の不必要な私語は避けます私語による唾液の飛散に伴うDNase RNaseコンタミネーションの防止が目的検査室内での飲食喫煙は厳禁とします飲食喫煙による唾液の飛散に伴うDNase RNaseコンタミネーションの防止が目的検査中は当然のことながら検査中でなくとも検査室での飲食喫煙は厳禁とします 23

5 遺伝子のコンタミネーションを防ぐために LAMP 反応は非常に鋭敏な反応であり DNA がごく微量でも混入すると誤った結果をもたらす原因となりますコンタミネーションを回避するために以下の注意点を踏まえて検査をおこなってください 1. 遺伝子混入を防ぐ環境を整える操作中における遺伝子の混入を極力防ぐための環境を整えます 1 作業領域 ( 図 18 19) 各作業における遺伝子のコンタミを防止するために作業ごとに操作する領域を区分けします遺伝子の濃度及び生物学的危険度 ( バイオハザードレベル ) により作業領域を区分けします領域 A 試薬調製遺伝子濃度無バイオハザードレベル低遺伝子バイオハザード共に汚染度が最も低い領域クリーンベンチ試薬調製専用の検査室試薬調製専用の作業台領域 A 試薬調製 8 連チューブ分注済マスターミックス領域 B 検体処理抽出操作抽出遺伝子領域 B 領域 C 領域 D 検体取り扱い及び抽出操作遺伝子濃度低バイオハザードレベル高遺伝子汚染度は低いがバイオハザード汚染度が最も高く遺伝子コンタミネーション防止より検体からの感染を防止するための領域生物学用安全キャビネット検体取り扱い専用の検査室検体取り扱い専用の作業台増幅試薬と抽出遺伝子混合操作遺伝子濃度中バイオハザードレベル低遺伝子汚染度は領域 B と大きく変わらないが生物学的汚染度が領域 B より低い領域遺伝子増幅 ( 増幅機器設置場所 ) 遺伝子濃度高バイオハザードレベル低遺伝子汚染度が最も高く他作業への遺伝子コンタミネーション防止のための領域遺伝子増幅機器を設置する検査室領域 C 反応液抽出遺伝子混合マスターミックス抽出遺伝子混合液 (8 連チューブ ) 領域 D LAMP 反応判定図 18.LAMP 法操作における領域分けのイメージ 2 使用器具試薬等原則各領域専用とし物品の領域外への移動はチューブラックなど必要最小限にします A) ピペット ( 図 20) 各領域専用のものとします試薬調製用 ( 領域 A) 検体取り扱い用 ( 領域 B) 抽出操作用 ( 領域 B) 抽出遺伝子操作用 ( 領域 C) 陽性コントロール操作用 ( 領域 C) ( 増幅産物操作用 ( 領域 D)) B) チューブラックピペット同様基本的に各領域専用とします検査作業効率上やむを得ず領域外へ移動せざるを得ない場合には領域 A B C Dの移動のみ ( すなわち遺伝子低濃度領域から高濃度領域への移動のみ ) とし領域 D C B Aへの移動は厳禁とします移動したラックを元の領域へ戻す場合は遺伝子フリー化処理後に戻します Χ 領域 Χ Χ 遺伝子低領域 A 領域 B 領域 C 領域 D 遺伝子高図 19. 物のながれのイメージ 24

6 C) チューブ DNA RNA DNase RNaseフリーのものを使用します市販 UV 滅菌済チューブオートクレーブ処理済チューブ領域 Aに保管使用し必要に応じ領域外に移動する領域外へ移動せざるを得ない場合には領域 A B C Dの移動のみ ( すなわち遺伝子低濃度領域から高濃度領域への移動のみ ) とし領域 D C B Aへの移動は厳禁とします D) チップ使い捨てで使用します疎水性フィルター付チップを使用します領域 Aにて保管し各領域にて開封し使用します開封後は他領域持ち込みは厳禁とします領域外へ移動せざるを得ない場合には領域 A B C Dの移動のみ ( すなわち遺伝子低濃度領域から高濃度領域への移動のみ ) とし領域 D C B Aへの移動は厳禁とします使用済みチップは専用のチップ捨てを予め用意し使用後は密閉した後に移動処理を行ってください E) 筆記用具各領域専用のものとしますサインペン鉛筆消しゴムなど---- 領域専用のものを使用し他領域 ( 事務領域も含む ) からの持込は厳禁とします検査レジュメなど---- 持込書類を置く専用の場所を設けそこに置くようにしますまたは各領域専用バインダーなどを用意し閲覧するようにします F) 試薬 ( 表 2) 各領域専用とします使用領域ごとに分けて保存使用します 3 作業者 A) 着用衣類使い捨て手袋 ( ラテックス手袋など ) を着用各領域内に限り使用し他領域への持込は厳禁とします領域外へ移動せざるを得ない場合には領域 A B C Dの移動のみ ( すなわち遺伝子低濃度領域から高濃度領域への移動のみ ) とし領域 D C B Aへの移動は厳禁としますきれいな白衣を使用する各領域に白衣を調えることが望ましい領域外へ移動せざるを得ない場合には領域 A B C Dの移動 ( すなわち遺伝子低濃度領域から高濃度領域への移動のみ ) とし極力領域 D C B Aへの移動は行わないこととします B) 作業者の移動極力遺伝子高濃度領域から低濃度領域への移動は避けます 4 遺伝子除去操作使用前後には次亜塩素酸ナトリウム水溶液 DNA RNA 除去剤や紫外線 (UV) を用いて遺伝子を除去します A) 次亜塩素酸ナトリウム水溶液 DNA RNA 除去剤による遺伝子除去 0.275%(v/v)(2,750ppm) 次亜塩素酸ナトリウム水溶液で 5μg のプラスミド DNA と 5μg の yeast trna 混合物を 10 分間室温反応後のアガロースゲル電気泳動像ではバンドが確認されませんまた 0.55% (v/v)(5,500ppm) 次亜塩素酸ナトリウム水溶液で 30 秒以上処理した DNA は PCR 増幅がなされません次亜塩素酸ナトリウム水溶液は塩素ガスを発生するので使用の際には換気に十分注意を必要としますまた劣化も激しく高温環境下での保存では劣化が著しくなるため保存環境や調製後の経過日数にも注意が必要になりますまた金属に対する腐食性もあるため金属に対する使用に関しては早めにかつ十分に塩素成分をふき取るなどの対応が必要となります次亜塩素酸ナトリウム水溶液と同様に市販の DNA RNA 除去剤も有効です領域 A 領域 B 領域 C 試薬調製用 2 検体取扱用 3 抽出サンプル陰性コントロール操作用 1.200~1000μL 可変ピペット 2. 20~200 μl 可変ピペット 3. 2~20 μl 可変ピペット ( ピペットの種類本数はサンプル数用途により異なります ) 図 20. ピペット領域分けの例表 2. 試薬の保存および使用領域例例 ) 各種増幅試薬キット領域 B 抽出操作用陽性コントロール操作用 Extraction Solution 領域 A にて分注後領域 B にて保存使用 Extraction Solution(NC) 領域 C にて保存使用 1M Tris-HCl 領域 B にて保存使用 Reaction Mix. 領域 A にて保存使用 2 Reaction Mix. 領域 A にて保存使用 Bst DNA Polymerase 領域 A にて保存使用 Enzyme Mix. 領域 A にて保存使用 Positive Control 領域 C にて保存使用例 ) DNA RNA 増幅試薬キット各種プライマーキット 2 Reaction Mix. 領域 A にて保存使用 Bst DNA Polymerase 領域 A にて保存使用 Enzyme Mix. 領域 A にて保存使用 Distilled Water 領域 A にて保存使用 Primer Mix. DNA 領域 A にて保存使用 Positive Control 領域 C にて保存使用プライマー領域 A にて保存使用

7 予め有効塩素濃度 5,500 ppm(0.55%) 程度の次亜塩素酸ナトリウム水溶液を用意します作業前後には作業台ピペットを次亜塩素酸ナトリウム水溶液を含ませたキムタオル等でふき取りますサンプル増幅産物溶液をこぼした場合には次亜塩素酸ナトリウム水溶液を含ませたキムタオル等で速やかにふき取ります作業終了後にはラック ( プラスチック製など非金属製のもの ) 等を次亜塩素酸ナトリウム水溶液に1 晩浸しよくすすいだ後乾燥し再利用します検査室作業台器具等は常に清潔に保ち定期的に次亜塩素酸ナトリウム水溶液にて洗浄します次亜塩素酸ナトリウム水溶液を使用の際には換気を十分にしてください B) 紫外線照射による遺伝子除去紫外線は光の一種で波長は 100~400nm でありさらに作用により UV-A ( 波長 315~400nm) UV-B ( 波長 nm) UV-C( 波長 nm) に分けられますこのうち殺菌作用がある UV は UV-C であり特に 240~280nm の波長は DNA によく吸収され DNA 鎖を破壊する作用を持ちますクリーンベンチ等のUVランプで遺伝子除去することができますプラスチックなどに腐食性が高く過度のUV 照射はプラスチック材質の脆壊を引き起こすので十分に注意します UVは影の部分には効果がないので照射の際には注意します作業終了後にはラック ( 金属製など非プラスチック製のもの ) にUVを1 晩照射し遺伝子除去操作後に再利用します使用後の検査室のUV 管点灯による照射も効果的です紫外線は有害で点灯中のUVランプを短時間見つめただけでもあとで目が痛くなり結膜炎に似た症状を起こしますので UVを直視することは避けてください 2. 操作中におけるクロスコンタミネーションを防ぐここでのクロスコンタミネーションは器具器具間などで遺伝子が移り混ざってしまう現象を言いますこれにより本来陰性であった検体が陽性化してしまうことになりますこれを防ぐために主に操作中に注意をします 0.55% 次亜塩素酸ナトリウムチップは疎水性フィルター付きを使用し使い捨てとしますチューブ蓋の開閉時などではチューブ内壁蓋裏面には触れないように注意しますサイズの合った手袋を使用します遺伝子の入ったチューブへの分注などは極力避け実施の際にはチップ先などがチューブに触れないように注意します 3. 増幅産物からの遺伝子コンタミネーションを防ぐ LAMP 法にて増幅された遺伝子増幅産物は非常に多く適切に取り扱わない場合には遺伝子のコンタミネーションを引き起こします増幅産物の取り扱いに関して以下の点にご注意ください増幅反応後のチューブの蓋は開封しないでください増幅産物の電気泳動はおこなわないでくださいやむを得ず開封して増幅産物を取り扱う際にはコンタミネーションに十分配慮し行ってください増幅産物の廃棄には次亜塩素酸ナトリウム水溶液等を用いて遺伝子の除去処理を行うなど施設の基準に則り廃棄してください増幅産物が入っているチューブは決してオートクレーブをかけないでください水蒸気を介しエアロゾル化したLAMP 産物によりコンタミネーションを引き起こします増幅産物の取り扱いは領域 Dのみとし他領域への持ち込みは決しておこなわないでください次亜塩素酸ナトリウム水溶液を使用の際には換気を十分にしてください 26

8 4. コンタミネーションが発生した場合万が一コンタミネーションが発生した場合遺伝子を除染する必要があります遺伝子の除染には 0.55% 次亜塩素酸ナトリウム水溶液 ( 又は DNA 除去剤 ) もしくは紫外線ランプを用います以下に対処法の一例をご紹介しますディスポーザブルのピペットチップ試薬調製用チューブ等は廃棄します作業台クリーンベンチ安全キャビネット内を次亜塩素酸ナトリウム水溶液や市販のDNA RNA 除去剤で拭きますピペットチューブスタンド等の器具は次亜塩素酸ナトリウム水溶液や市販のDNA RNA 除去剤で拭きますプラスチック製など次亜塩素酸ナトリウムによる腐食の影響がない材質性の器具に関しては次亜塩素酸ナトリウム水溶液に一晩浸します次亜塩素酸ナトリウム水溶液や市販のDNA RNA 除去剤で洗浄済み器具類をクリーンベンチ安全キャビネット内に置き UV 照射して一晩放置します後日陰性コントロールを測定し除染の確認をおこないますその他施設の安全規程に従い対処します次亜塩素酸ナトリウム水溶液を使用の際には換気を十分にしてください DNase RNase のコンタミネーションを防ぐために DNase RNase は汗唾液涙など生体の細胞や分泌液に含まれておりサンプル内に混入すると本来存在している遺伝子が分解され遺伝子増幅反応がなされず結果として擬陰性を引き起こすことになります DNase RNaseの混入を防ぐため以下の点に基づいた対策をとります検査に使用するチューブ等は使い捨てのものを使用します検査従事者は必ず手袋マスクを着用し検査従事者自身の唾液や汗からの混入を防ぎます検査中の私語検査室内での飲食喫煙は控えます RNAを取り扱い場合には上記注意事項に加えて以下の点にも注意します検査に使用する水は DEPC 処理水などRNaseフリーの水を用います RNA 検査実施検査台や検査器具を他と区別します 1. 各器具のDNase RNaseフリー化 1チューブ市販の滅菌済み未使用チューブを使用します使用後は廃棄します 2チップ市販の滅菌済疎水性フィルター付きチップを使用します使用後は廃棄します 3 その他器具極力素手で触らず手袋を着用した上で使用操作します使用後は廃棄します 2. 検査担当者からのDNase RNaseコンタミネーション防止の徹底 1 マスク手袋を着用するマスクは使い捨てのものを使用します領域外への移動は極力避けるようにします使い捨て手袋 ( ラテックス手袋など ) を着用します各領域内に限り使用とします他領域への持込は厳禁とします領域外へ移動せざるを得ない場合には領域 A B C D( 遺伝子低濃度領域から高濃度領域 ) の移動のみとし領域 D C B Aへの移動は厳禁とします 2 検査室での私語飲食喫煙の厳禁検査室内特に検査中の不必要な私語は避けます私語による唾液の飛散に伴うDNase RNaseコンタミネーションの防止が目的検査室内での飲食喫煙は厳禁とします飲食喫煙による唾液の飛散に伴うDNase RNaseコンタミネーションの防止が目的検査中は当然のことながら検査中でなくとも検査室での飲食喫煙は厳禁とします 27

9 III. 参考文献 1) Notomi T. et al.: Nucleic Acids Research 28, No.12, e63(2000) 2) Nagamine K. et al.: Clin. Chem. 47, No 9, (2001) 3) 森安義, 他 : 第 23 回日本分子生物学会年会プログラム講演要旨集 (2000) 4) Mori Y. et al.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 289, No.1, (2001) 5) 富田憲弘, 他 : 第 26 回日本分子生物学会年会プログラム講演要旨集 (2003) 6) Kohker S. et al. : Infect Immun. 58, No.6 : (1990) 7) Wuenscher MD. et al. : J Bacteriol. 175, No.11, (1993) 8) Yoshino M. et al. : American Society for Microbiology The 104th General Meeting (2004) 9) 吉野学, 他 : 第 25 回日本食品微生物学会学術総会講演要旨集 p22(2004) 10) 日本細菌学会バイオセイフティー委員会 : 日本細菌学雑誌, 54, No 3, (1999) 11) Aslanzadeh J.: Annals of Clinical Laboratory Science. 34, No 4, (2004) 12) Prince AM. Et al.:biotechniques. 12, No 3, (1992) 13) 保科定頼. : 臨床病理レビュー特集 112 号医療廃棄物の適正処理マニュアル- 感染性廃棄物を中心に (2000) 28

10 LAMP 法による食中毒菌検査のための簡易チェックポイント ( 詳細は冊子内をご覧ください ) 検体の採取 ( 前 ) 増菌培養液をサンプリングする際は沈殿物や油分の持ち込みを避けてください DNA の抽出 EX F は融解後混和スピンダウンしてから使用してください EX F は空気に触れると徐々に劣化するためチューブへの分注は検体添加の直前に行ってください 95 加熱中に空気の膨張によりチューブのフタが開いてしまうことがありますのでご注意ください ( キャップロックなどを使用することを推奨します ) コンタミネーションの原因となるのでチューブのフタの内側には触れないでください DNA 抽出後のサンプル溶液は反応チューブに添加するまで氷上で保存し速やかに測定してくださいマスターミックスの調製 RM は融解後混和スピンダウンしてから使用してください Bst DNA ポリメラーゼは使用前にスピンダウンしてから使用してください ( 失活の恐れがあるため混合しないでください ) Bst DNA ポリメラーゼは採取量が微量であるためまず RM を試薬調製用チューブに採取し次に Bst DNA ポリメラーゼをチップの共洗いにより混ぜてくださいマスターミックスをボルテックスミキサーで混合する場合は 1 秒間 3 回を厳守してください ( 過度な混合は酵素失活の恐れがあります ) 調製したマスターミックスは氷上で保存し速やかに使用してくださいマスターミックスの分注とサンプル添加マスターミックスを分注する前に反応チューブに傷やヒビ割れが無いかを確認してくださいコンタミネーションを避けるためマスターミックスの分注後は一旦反応チューブのキャップを軽く閉じてください陰性コントロールとして使用する試薬 (EX F など ) は試薬開封の際に 100μL 程度マイクロチューブに分取し陰性コントロール専用として使用くださいサンプルの添加は 1 陰性コントロール 2 検体 3 陽性コントロールの順で行うことをお奨めします ( コンタミネーションを避けるため ) サンプル溶液を添加する際は沈渣を持ち込まないよう上清を採取してください陽性コントロールは大量の DNA を含むため取り扱いには十分注意してください (1 使用前にはスピンダウンを行ってください 2 反応チューブへの添加は最後に行ってください ) コンタミネーションを避けるためサンプル添加後はしっかりとキャップを閉めてから次のサンプルを添加してください反応液中に大きな気泡ができた場合はスピンダウンで取り除いてください ( 小さな気泡であれば問題ありません ) マスターミックスが温まると気泡が出やすくなるため氷上での操作をお勧めします LAMP 機器の操作検体の前処理を始める前にパラメーターを選びあらかじめ測定機器を加温状態にしてください反応チューブを測定機器にセットする際はブロックが測定温度になっていること ( 測定開始と表示されていること ) を確認後キャップの開け口を手前にセットしチューブのキャップが全てしっかりと閉まっていることを確認してください反応チューブを測定機器にセット後は速やかに測定開始してください (LAMP 法は等温で反応が進行するためセットした時点から反応は始まっています ) 反応開始後は測定機器のフタ ( ホットボンネット ) を開けないでください廃棄増幅された DNA を撒き散らす恐れがあるため反応後のチューブはキャップを開けずに焼却処理又は密閉できるビニール袋を二重に施し廃棄の基準に従って処理してくださいまた反応後のチューブは絶対にオートクレーブ処理しないでください Loopamp 食中毒菌検出試薬キットおよびリアルタイム濁度測定装置のお問い合わせ先 : 栄研化学株式会社遺伝子検査チーム Tel Fax AMK 2006 年 08 月作成

遺伝子検査の基礎知識

遺伝子検査の基礎知識遺伝子検査の準備と注意事項 PCR はわずか 1 分子の鋳型 DNA でも検出可能であるため反応液調製時に鋳型となりうる核酸等が混入しないように細心の注意が必要ですこの文書では正確な遺伝子検査を行うために必要な実験器具類やコンタミネーション防止のための注意事項について解説します - 目次 - 1 実験環境の整備 2 必要な実験器具と装置 1 実験環境の整備コンタミネーションの原因 PCR は非常に高感度な検出法であるため