[PDF] 蛍光タンパク質FRETプローブを用いたアポトーシスのタイムラプス解析

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そうすみだ
5 years ago
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を応用することにより分子間相互作用やタンパク質の構造変化など様々な生体分子の挙動を定量的に可視化することができる特に Green Fluorescent Protein (GFP) に代表される蛍光タンパク質を用いた FRET センサーを用いることにより Ca+ 濃度やタンパク質のリン酸化プロテアーゼの活性化などを生細胞中でリアルタイムに検出することが可能である本報では

1 ApplicationNote Vol. BioStation ID Time-Lapse Analysis of Apototic Cells by FRET-based indicator 蛍光タンパク質 FRET プローブを用いたアポトーシスのタイムラプス解析サンプル提供 : 理化学研究所脳科学研究センター宮脇敦先生はじめに Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) を応用することにより分子間相互作用やタンパク質の構造変化など様々な生体分子の挙動を定量的に可視化することができる特に Green Fluorescent Protein (GFP) に代表される蛍光タンパク質を用いた FRET センサーを用いることにより Ca+ 濃度やタンパク質のリン酸化プロテアーゼの活性化などを生細胞中でリアルタイムに検出することが可能である本報ではリアルタイムイメージアナライザー BioStation ID とアポトーシス検出用 FRET プローブである SCAT3. を用い生体組織が形成成長する上で重要な役割を果たしているプログラミング細胞死 ( アポトーシス ) の蛍光 Time-Lapse Imaging と定量解析を行ったアポトーシスとはプログラミング細胞死 ( アポトーシス ) は生体組織が一定の秩序を保ちながら形成成長していく上で重要なイベントであることが知られている細胞がアポトーシスを誘発する過程において重要な役割を果たしているのが Caspase ファミリーの活性化である Precursor form として発現した Caspase は上流の酵素により切断されて活性型 Caspase となる Caspase-3 はこのシグナル伝達の下流に位置し上流の Caspase によって活性化された後に下流の様々なターゲットタンパク質を切断し最終的にアポトーシスが誘導される SCAT3. FRET プローブ活性型 Caspase-3 用 FRET プローブである SCAT3. は蛍光ドナー (ECFP) と蛍光アクセプター (Venus) とを Caspase-3 の基質となるプロテアーゼ認識配列を含むリンカーでつないだアポトーシスセンサーである通常 SCAT3. を ECFP の励起波長付近である 435nm で励起した場合 ECFP から Venus への FRET が起こり Venus の蛍光である 53nm の蛍光が検出されるしかし活性型 Caspase-3 によりリンカーペプチドが切断されると ECFP と Venus が切り離され FRET が解消されることにより ECFP の蛍光である 475nm 付近の蛍光が観察される (Fig.) この原理を利用してアポトーシス誘導に伴う Caspase-3 の活性化を 53nm と 475nm の蛍光強度の比より算出することが出来る Cleavage site 53nm 435nm 475nm Venus ECFP ECFP Cleaved by activated caspase Venus 435nm FRET Fig. Schematic representation of SCAT3.

2 実験内容使用した試薬機器細胞株 :HeLa 細胞 Lipofectamine (Invitrogen) anti-fas monoclonal antibody (Ch-, Medical Biological Laboratory, Japan) Hanks balanced salt solution buffer (Gibco) BioStationID (GE Healthcare Bio-Sciences) Cell culture and transfection SCAT3. DNA は Lipofectamine を用いて HeLa 細胞にトランスフェクションしたアポトーシス誘導は ng/ml anti-fas monoclonal antibody と ug/ml cyclohexamid を培地に添加して実施した Imaging トランスフェクション後 35mm ガラスボトムディッシュを用いて日間培養し培地を Hanks balanced salt solution buffer へ置換し Imaging を行った 37 でプレインキュベートされた BioStationID の CO チャンバーに 35mm デッシュをセットしタイムラプス測定を開始した開始後 49sec 後に ng/ml anti-fas monoclonal antibody / ug/ml cyclohexamid 添加によるアポトーシス誘導を行った FRET イメージングの測定条件は以下の通り対物レンズ :4 倍 (NA.8) min 毎 4hr 5 視野のタイムラプス測定 FL:Ex=435nm/Em=475nm FL:Ex=435nm/Em=53nm Ph: 位相差結果 35mm デッシュ中 5 つのポイントを 4 倍の対物レンズを用いて分毎のタイムラプス測定を行ったそのうちの視野に関して hr6min から hr4min までの蛍光及び位相差イメージを Fig. に示す矢印で示した細胞において hr3min 付近で Venus に由来する赤色の蛍光強度が減少し ECFP に由来する青色の蛍光強度が上昇しているのが確認されたまたその約 4 分後において細胞自身がアポトーシスを起こしている様子が蛍光及び位相差像より確認された Fluorescence hr6min hr8min hr3min hr3min Phase-contrast hr34min hr36min hr38min hr4min hr6min hr8min hr3min hr3min hr34min hr36min hr38min hr4min Fig. BioStation ID で取得したタイムラプスイメージ ( 上段 ) 蛍光像 :Venus( 赤 ) ECFP( 青 ) ( 下段 ) 位相差像

また観察された FRET 変化及び形態変化を定量的に評価するために IN Cell Investigator ソフトウェアを用いて解析を行ったまず Fig.3A に示すように SCAT3. を発現した HeLa 細胞を認識させた認識したオブジェクトに関して経時的にトラッキングを行い細胞毎の時間変化を定量した Fig.

3 また観察された FRET 変化及び形態変化を定量的に評価するために IN Cell Investigator ソフトウェアを用いて解析を行ったまず Fig.3A に示すように SCAT3. を発現した HeLa 細胞を認識させた認識したオブジェクトに関して経時的にトラッキングを行い細胞毎の時間変化を定量した Fig.3B には視野における 4hr の間の各細胞の経時的な動きを示す A B Pos Y-pixel Detection of Cell Area Ch, Pos X - pixel Pos X-pixel Fig.3 IN Cell Investigator による細胞認識 A.( 左 ) 位相差と蛍光イメージのオーバーレイ ( 右 ) 蛍光イメージからの細胞認識 B. 細胞毎のトラッキング解析 ( 二次元表面上の細胞の動き ) 次に各細胞における FRET 変化を Venus/ECFP の蛍光強度比の変化としてプロットした (Fig.4A) これにより細胞毎の Caspase-3 の活性化のタイミングの違いを明確に可視化することができた均一な条件でのアッセイにもかかわらず細胞と細胞 4 では Caspase-3 の活性化に 3hr 以上の時間差が生じていることが解る最後に細胞 3 において Caspase-3 の活性化に伴う細胞の形態変化 (Form Factor: 真円率 Cell Area: 面積 ) をプロットしそれぞれの時間的な相関を確認した (Fig.4B) この結果より細胞 3 においては Caspase-3 が活性化してから約 4min 後にアポトーシスによる顕著な形態変化が生じていることが解ったまた Venus/ECFP のレシオイメージと照らし合わせることにより定量解析により得られた経時的な値の変化と細胞のイメージ変化との相関を明確に確認することが出来た (Fig.5)

Venus/ECFP Intensity Ratio A.8.6.4..8.6 NO.4 No.3 No.5 No. No. B.36.3 73.7 47.4.4 96 5 5 75 5 5 75 Dose apply (48sec) Cell No.

4 Venus/ECFP Intensity Ratio A NO.4 No.3 No.5 No. No. B Dose apply (48sec) Cell No.3 Venus/ECFP Intensity Ratio Cell Area Time (sec) Time (Sec) Line Line Chart Cell Form Factor Dose apply (48sec) Time (Sec) Fig.4 FRET 効率及び細胞形態の経時変化 A. 細胞毎の FRET の経時変化 B. No3 細胞の FRET 変化と形態変化の相関.4 Fig.5 FRET 変化と細胞形態変化の時間差および FRET の蛍光レシオイメージ赤ライン :Cell Area 緑ライン:Cell Form Factor 青ライン:FRET レシオ

5 まとめ FRET プローブ SCAT3. と BioStation ID を組み合わせることによりアポトーシスの経時的な誘発を様々なパラメーターを用いてより定量的に評価することが可能であることが示唆された BioStation ID は生細胞の時間に依存した種々の変化を細胞毎に定量的に評価することが可能なシステムであるまた FRET に限らず蛍光タンパク質プローブは国内外の研究グループが精力的に開発している本実験の結果はそれら蛍光タンパク質プローブと BioStationID を組み合わせることにより細胞に起こる経時的な現象の変化をより定量的にかつ簡便に評価できる可能性が大きく広がることが示唆された参考文献 ) Takeharu Nagai and Atsushi Miyawaki, BBRC. 39, (4) 7-77 A high-throughput method for development of FRET-based indicators for proteolysis ) Kiwamu Takemoto et.al. JCB. 6, Number, (3) Spatio-temporal activation of caspase revealed by indicator that is insensitive to environmental effects

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37-4.indd ISSN 0916-3328 東京大学アイソトープ総合センター VOL. 37 NO. 4 2007. 3. 26 アイソトープ総合センターの将来展望 40 18 18 20 3 800 1/3 1300 14 18 20 3 19 2 生きた細胞内の分子過程を時間空間計測する蛍光プローブの開発 1. はじめに Fura-2 Fura-2 198 1, 2 3, 4 2. 生体脂質分子の機能とその分析