病原性真菌 Candida albicans のバイオフィルム形成機序の解析および形成阻害薬の探索 Biofilm Form ation Mech anism s of P at hogenic Fungus Candida albicans and Screening of Biofilm In

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こうじいんそん
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1 病原性真菌 Candida albicans のバイオフィルム形成機序の解析および形成阻害薬の探索 Biofilm Form ation Mech anism s of P at hogenic Fungus Candida albicans and Screening of Biofilm Inhibitors 平成 29 年度論文博士申請者倉門早苗 (Ku rak ad o, Sanae ) 指導教員杉田隆我が国では医療技術が進歩する一方易感染性宿主の増加に伴い日和見感染症である深在性真菌症の発症も増加の一途を辿っている剖検例における原因菌別の発生頻度ではカンジダ症およびアスペルギルス症の発生頻度が高く臨床上問題となっている ( Fi g. 1) カンジダ血症は Candida albicans を主要起因菌として発症しその致死率は 4 0 % 以上に及ぶ予後不良の感染症である発症のリスクファクターとしては中心静脈カテーテル等の体内留置物が挙げられる C. albicans はカテーテル等の基質上にバイオフィルムを形成し抗真菌薬に対して耐性化することで難治化しバイオフィルムの一部が播種することによってカンジダ血症を引き起こす従ってバイオフィルムを原因とするカテーテル関連血流感染症の制御は我が国において重要な課題の一つである C. albicans のバイオフィルムは酵母形および菌糸形で形成される高次構造体でありその周囲を多糖タンパク質核酸等を成分とする細胞外マトリックスが覆っている酵母形から菌糸形への二形性変換は C. al bicans の病原因子として考えられておりバイオ

2 フィルム形成においても重要な因子の一つである本研究では Ⅰ. C. albicans のバイオフィルム形成に関与する因子を明らかにするためにバイオフィルム状態で発現亢進している遺伝子を抽出し遺伝子破壊株を用いて当該遺伝子のバイオフィルム形成への影響を評価した次に二形性変換を抑制する化合物として Ⅱ. 17β-estradiol の作用機序について検討したまた Ⅲ. バイオフィルム感染症の克服を目指し C. al bicans のバイオフィルム形成を阻害する薬剤を探索した F i g. 1 C h a n g e s i n t h e r a t e o f m y c o s e s a m o n g t o t a l a u t o p s y c a s e s a n d c a u s a t i v e a g e n t s d u e t o m o n o p a t h o g e n i c i n f e c t i o n f r o m t o i n J a p a n. Ⅰ. バイオフィルム形成に関与する遺伝子の解析サブトラクション法によるトランスクリプトーム解析の結果バイオフィルム状態では亜鉛獲得システムを担う P RA 1 および ZRT1 の発現が亢進していた Pra1 は亜鉛結合モチーフを有し菌体から分泌された後宿主の亜鉛と結合するその後亜鉛トランスポーターである Zrt 1 の元へ亜鉛を運ぶ Zincophore システムとして機能する可能性が報告されているそこで両遺伝子の破壊株 (Δpra1, Δzrt1) を作製しバイオフィルム形成能を野生株と比較した結果 Δpra1, Δzrt1 は野生株と比較して強固なバイオフィルムを形成することができずバイオフィルム形成率は野生株の 5 0 % 程度まで減少した ( Fi g. 2) また Δpra1, Δzrt1 は菌糸誘導条件下において野生株と比較して短い菌糸を形成した Pra1 および Z rt1 は亜鉛

3 獲得システムに関与するタンパク質であるため細胞内の亜鉛恒常性がバイオフィルム形成に影響を与えていることが考えられた亜鉛添加条件でのバイオフィルム形成能を評価した結果亜鉛非添加条件と比較してバイオフィルム形成の増加が認められた F i g. 2 B i o f i l m f o r m a t i o n s o f pra1 and z r t 1 m u t a n t s t r a i n s. * P < Ⅱ. ステロイド薬による二形性変換阻害作用と新規二形性変換経路本研究室におけるこれまでの検討においてステロイド薬が二形性変換阻害作用を有する知見が得られているエストロゲンは estrone, estradiol, estriol を主要成分とするステロイドホルモンであるその中でも最もエストロゲン活性の高い 17β-estradiol の菌糸形成への影響を評価したその結果 17β-estradiol は N -acet yl glucosamine 培地および Spider 培地によって誘導された菌糸形成を阻害したまた 17β-estradiol 添加条件では菌糸特異遺伝子である現が低下した (Fi g. 3) H WP 1 の発 F i g. 3 H W P 1 e x p r e s s i o n l e v e l s o f C a n d i d a a l b i c a n s g r o w n w i t h 1 7 β - e s t r a d i o l. * P < 二形性変換は様々な刺激により誘導されそれぞれ異なるシグナル経路を介して菌糸形を誘導する (Fig. 4) エストロゲンはヒトではエストロゲンレセプターを介して生殖細胞の分化等を制御する C. albicans においてはエストロゲン結合タンパク質 (Ebp1) を

有することが知られており 17βestradiol による二形性変換阻害作用が Ebp1 を介しているかどうかを検証するため ebp1 破壊株 (Δeb p1) を作製し機能の解析を行った

4 Ye a s t - to- h y p h a e t r a n s i t i o n p a t h w a y i n C a n d i d a a l b i c a n s.

5) 17β-estradiol に二形性変換阻害作用が認められたためバイオフィルム形成に対する作用も併せて評価したところ 17β-estradiol はバイオフィルム形成も阻害したまた

5 L o s s o f I n h i b i t o r y e f f e c t o f 1 7 β - e s t r a d i o l on h y p h a l f o r m

4 有することが知られており 17βestradiol による二形性変換阻害作用が Ebp1 を介しているかどうかを検証するため ebp1 破壊株 (Δeb p1) を作製し機能の解析を行ったその結果 Δebp1 に対する 17β-estradiol の菌糸形成阻害作用は野生株および EBP1 再 F i g. 4 Ye a s t - to- h y p h a e t r a n s i t i o n p a t h w a y i n C a n d i d a a l b i c a n s. 導入株に対する場合と比較して減弱が認められた ( Fi g. 5) 17β-estradiol に二形性変換阻害作用が認められたためバイオフィルム形成に対する作用も併せて評価したところ 17β-estradiol はバイオフィルム形成も阻害したまた二形性変換に対する作用と同様に Δebp1 に対する 17βestradiol のバイオフィルム形成阻害作用にも減弱が認められた F i g. 5 L o s s o f I n h i b i t o r y e f f e c t o f 1 7 β - e s t r a d i o l on h y p h a l f o r m a t i o n a g a i n s t ebp1 m u t a n t s t r a i n s. Ⅲ. ミノサイクリンによるバイオフィルム形成阻害作用とその機序の解析抗細菌薬について C. albicans のバイオフィルム形成阻害作用を探索したところミノサイクリンにバイオフィルム形成阻害作用が認められたまたミノサイクリンは二形性変換阻害作用も示した (Fi g. 6) ミノサイクリン添加条件における二形性変換関連遺伝子

の発現変動を測定した結果菌糸特異遺伝子である H WP1, ECE1, ALS3 に発現の低下が認められた二形性変換を正に制御する転写因子 EFG1, CPH1, TEC1 およびバイオフィルム制御遺伝子 BCR1 の発現もミノサイクリン存在下で減少したまたミノサイクリン添加条件では細胞の接着性の指標である疎水性も低下した

では達成できない薬剤含有カテーテルの積極的な使用がバイオフィルム感染症の克服につながる可能性がある F i g.

5 の発現変動を測定した結果菌糸特異遺伝子である H WP1, ECE1, ALS3 に発現の低下が認められた二形性変換を正に制御する転写因子 EFG1, CPH1, TEC1 およびバイオフィルム制御遺伝子 BCR1 の発現もミノサイクリン存在下で減少したまたミノサイクリン添加条件では細胞の接着性の指標である疎水性も低下したバイオフィルムを覆う細胞外マトリックスの構成成分である β1, 3-glucan の上清中の濃度を測定したところミノサイクリン添加条件では非添加条件と比較して低下しておりマトリックスの産生量にも影響していると考えられた本研究でバイオフィルム形成阻害作用が認められた 5 μg/ml は通常のミノサイクリンの点滴静注 ( 血中濃度約 4 μg/ml) では達成できない薬剤含有カテーテルの積極的な使用がバイオフィルム感染症の克服につながる可能性がある F i g. 6 E f f e c t s o f m i n o c y c l i n e a n d t e t r a c y c l i n e o n h y p h a l f o r m a t i o n i n C a n d i d a a l b i c a n s. と考えられた以上本研究では PRA1 および ZRT 1 がバイオフィルム形成に関与する遺伝子であることを見出したまた両遺伝子は亜鉛の恒常性を介してバイオフィルム形成を制御していると考えられた ( Fi g. 7) 更に 17β-estradiol に二形性変換抑制作用があることを見出しその作用は Ebp1 を介したものであることを明らかにしたこれに

より Ebp1 を介する新規二形性変換経路の存在が示唆された ( Fi g. 7) また抗細菌薬であるミノサイクリンに C. albica ns のバイオフィルム形成阻害作用を見出したその作用は菌糸形成の抑制接着能の低下マトリックス産生の減少を介したものであると推測された ( Fi g. 7) 本研究の結果から C.

難治なバイオフィルム感染症の制御法開発を目指したい参考文献 1) 17β-E s t r a d i o l i n h i bi ts estroge n b i n d i n g protei n -me d i a t e d h ypha f o r ma t i o n i n Candi da albicans. Kuraka do S., K u r o ga n e R.

6 より Ebp1 を介する新規二形性変換経路の存在が示唆された ( Fi g. 7) また抗細菌薬であるミノサイクリンに C. albica ns のバイオフィルム形成阻害作用を見出したその作用は菌糸形成の抑制接着能の低下マトリックス産生の減少を介したものであると推測された ( Fi g. 7) 本研究の結果から C. albicans のバイオフィルム形成に関与するいくつかの因子の存在を明らかにした今後 F i g. 7 D i a g r a m o f s p e c u l a t e d p a t h w a y r e l a t e d t o b i o f i l m f o r m a t i o n o f C a n d i d a a l b i c a n s. 難治なバイオフィルム感染症の制御法開発を目指したい参考文献 1) 17β-E s t r a d i o l i n h i bi ts estroge n b i n d i n g protei n -me d i a t e d h ypha f o r ma t i o n i n Candi da albicans. Kuraka do S., K u r o ga n e R., Su gi t a T., M i c rob Pathog., 1 09, ( ). 2) M i n o c yc l ine i n hi b its Candida albi c a n s budded-to-h yphal -f o r m t r a n s i t i o n a n d b i o film f o r ma t i on. K u r a ka d o S., T a ka t o r i K., S u gi t a T., J pn J Infect Dis., 70, ( ).

抑制することが知られている今回はヒト子宮内膜におけるコレステロール硫酸のプロテアーゼ活性に対する効果を検討することとしたコレステロール硫酸の着床期特異的な発現の機序を解明するために合成酵素であるコレステロール硫酸基転移酵素 (SULT2B1b) に着目したヒト子宮内膜は排卵後脱落膜化

抑制することが知られている今回はヒト子宮内膜におけるコレステロール硫酸のプロテアーゼ活性に対する効果を検討することとしたコレステロール硫酸の着床期特異的な発現の機序を解明するために合成酵素であるコレステロール硫酸基転移酵素 (SULT2B1b) に着目したヒト子宮内膜は排卵後脱落膜化論文の内容の要旨論文題目着床期ヒト子宮内膜におけるコレステロール硫酸の発現調節機序及び機能の解析指導教員武谷雄二教授東京大学大学院医学系研究科平成 15 年 4 月入学医学博士課程生殖発達加齢医学専攻清末美奈子緒言着床とは受精卵が分割し形成された胚盤胞が子宮内膜上皮へ接着貫通し子宮内膜間質を浸潤して絨毛構造を形成するまでの一連の現象をいう胚盤胞から分化したトロフォブラストが浸潤していく過程で

病原性真菌 Candida albicans の バイオフィルム形成機序の解析および形成阻害薬の探索 Biofilm Form ation Mech anism s of P at hogenic Fungus Candida albicans and Screening of Biofilm In

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