セミドライブロッティング実験方法 Semi-dry Blotting Protocol for Western Blotting 平成 16 年 4 月 19 日作製平成 18 年 12 月 12 日改定平成 21 年 1 月 13 日改定アトー株式会社 1

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せせらふじした
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1 セミドライブロッティング実験方法 Semi-dry Blotting Protocol for Western Blotting 平成 16 年 4 月 19 日作製平成 18 年 12 月 12 日改定平成 21 年 1 月 13 日改定アトー株式会社 1

2 1. SDS-PAGE 使用機器 AE-6530 型ラピダスミニスラブ電気泳動槽 AE-8500 型コンスタパワー 3500( 電源装置 ) 使用ゲル市販品販品あり! E-T12.5L e パジェル ( 既製ゲル : 12.5% 均一ゲル ) サンプル大腸菌抽出タンパク質試薬 SDS 処理液 0.5M トリス -HCl(pH6.8),1%SDS,20% グリセリン, 1%2- メルカプトエタノール SDS-PAGE 用緩衝液 25mM トリス,192mM グリシン,0.1%SDS 分子量マーカー市販品あり! APRO プレステインドマーカー ( 低分子量 ) 市販品あり! タンパク質概算分子量 βガラクトシダーゼ 114,000 血清アルブミン 84,200 オブアルブミン 47,800 カーボニックアンヒドラーゼ 32,700 トリプシンインヒビター 25,700 リゾチーム 16,800 1 サンプル処理大腸菌抽出タンパク質を SDS 処理液で希釈 1 分間煮沸してサンプル溶液としました 2サンプルアプライ両端中央にプレステインドマーカー間にサンプルをすべてのレーンに同量アプライしました同じように2 枚のゲルにサンプルアプライしました 3 電気泳動ゲル 2 枚 40mA 定電流 (85V ~ 200V),70 分 4 泳動中にメンブレンの湿潤化作業を行います (4 ページ ) 5 泳動終了後 1 枚は CBB 染色もう一枚はブロッティングに使用します 2

3 1. SDS-PAGE SDS-PAGE の結果電気泳動が終了したゲルを CBB 染色で検出しました概算分子量 114,000 84,200 47,800 32,700 25,700 16,800 Lane1,7,14 APRO プレステインドマーカー 10uL Lane2-6,8-13 サンプル ( 大腸菌抽出タンパク質 ) 10uL GEL e PAGEL E-T12.5L (Lot No.473T0042) 緩衝液 25mM トリス 192mM グリシン 0.1%SDS 泳動装置 AE-6530 型ラピダスミニスラブ電気泳動槽泳動条件 40mA 定電流 ( ゲル 2 枚 ) 電圧 V 73 分関連試薬のご紹介市販品あり! 既製ゲル e-pagel シリーズ 10 枚 /1 箱サンプル処理液 AE-1430 EzApply SDS-PAGE 緩衝液 AE-1410 EzRun 分子量マーカー AE-1440 EzStandard セミドライブロッティング試薬 AE-1460 EzBlot 13,800 6,800 4,800 9,800 12,000 3

4 ２セミドライブロッティングブロッティング準備ブロッティング溶液は A/B/C の 3 種類を用意しました(組成は下記を参照) メンブレン 1 枚ろ紙 6 枚はゲルサイズに合わせて8.5 9cmにカットしましたメンブレンろ紙はゲルサイズに合ったものを販売していますメンブレン AE-6665クリアブロット P膜(20枚入り) ろ紙 CB-09Aろ紙(400枚入り) ブロッティング溶液の準備市販品ありブロッティング溶液Ａ 100ml調製試薬名濃度トリスヒドロキシメチルアミノメタン(Tris) メタノール蒸留水 300mM 5% 95ml ブロッティング溶液Ｂ 100ml調製試薬名濃度トリスヒドロキシメチルアミノメタン(Tris) メタノール蒸留水ブロッティング溶液Ｃ 100ml調製試薬名 25mM 5% 95ml 濃度トリスヒドロキシメチルアミノメタン(Tris) 6-アミノカプロン酸 6-アミノヘキサン酸メタノール蒸留水 25mM 40mM 5% 95ml ブロッティング準備(重要) 電気泳動の最中にメンブレンの湿潤作業を行います ①まずはじめに 100% メタノールに秒浸します ②続いてタッパーに入れたブロッティング溶液Bに沈めますこのまま振とう器で30分以上(メンブレンが水をはじかなくなるまで)振とうしますメンブレンが十分ブロッティング溶液Ｂになじまないと水をはじいてしまいますメンブレンが十分ブロッティング溶液Ｂに沈むように強く振とうします ③他のタッパーでろ紙をブロッティング溶液に浸します (A 2 枚, Ｂ 1 枚, Ｃ 3 枚) 4 メンブレンが十分ブロッティング溶液Ｂになじんだ状態は水をはじきません

5 ２セミドライブロッティング泳動終了ろ紙メンブレンゲルの積層重要電気泳動が終了した時点でブロッティング溶液 Bへの湿潤時間が 30 分以上経過しているように実験を行ってください余裕を持って 60分湿潤(振とう)しておくと安心です以下の作業はグローブを着用して行ってください ①ブロッティング溶液Ａに浸したろ紙2枚を弓なりに反らしながらホライズブロットの電極へ積層しますこのときずれないように注意して重ねます ②続いてブロッティング溶液Ｂに浸したろ紙 1 枚を弓なりに反らしながら①のろ紙の上に積層しますずれないように注意して重ねます ③十分にブロッティング溶液Ｂに湿潤したメンブレンを弓なりに反らしながら②のろ紙の上に積層しますメンブレンの上にブロッティング溶液Ｂを少量たらします ④ゲルをガラスプレートから外しブロッティング溶液Ｂに一瞬浸しますすぐに③のメンブレンの上に積層しますこのときゲルを置いてからあまり動かさないようにしてください ⑤ブロッティング溶液Ｃに浸したろ紙3枚を順番に弓なりに反らしながら④のゲルの上に積層します ⑥グローブをはめた手の平で全体をつぶすように圧着しますピペットのような棒状の物で圧着するとムラになる原因となります３２押さえる位置は5箇所が基本です番号順に手のひらで押してください１５４ピペットでころころするとムラになりやすいのでお勧めできません 5

6 ２セミドライブロッティング泳動終了ろ紙メンブレンゲルの積層 ⑦一番上のろ紙にブロッティング溶液Ｃを少量たらしますホライズブロットのふたを閉め電極板を静かにろ紙に密着させますこのとき電極板はそっと乗せるように密着させます (圧をかけるとろ紙のずれなどの原因になります) 電極を乗せる前にブロッティング溶液Ｃを少量たらします通電メンブレンの取り出し ⑧通電条件単位面積 =1cm2 あたり 2mA 定電流) ゲルサイズ 8.5 9cm 電流量 mA 定電流 30 分間電圧 13V 18V) でブロッティングを行いましたはじめ終わり ⑨メンブレン取り出しゲルを外すとメンブレンにプレステインドマーカーが転写されているのが確認できます(写真右) またプレステインマーカーがない場合メンブレンを斜めから表面に光を反射させるように見るとタンパク質がブロッティングされている場所が白く光って確認できます(写真下) プレステインドマーカーがきれいに転写されました光の反射によってブロッティングされたタンパク質を目視で確認できます ⑩メンブレンとブロッティング後のゲルを CBB 染色しますメンブレンは 5 分程度染色しメタノール濃度を上げた脱色液で脱色します脱色後乾燥保存が可能です脱色完了乾燥開始乾燥初期 6 乾燥後期

7 ２セミドライブロッティングブロッティングの結果(CBB染色概算分子量 114,000 84,200 47,800 32,700 25,700 16,800 ブロッティング条件 153mA 定電流(12-18V 30 分間不連続系転写溶液使用 A 300mM トリス,5%MetOH B 25mM トリス,5%MetOH C 25mM トリス,40mM6- アミノカプロン酸,5%MetOH タンパク質量の多いバンドは多少残っています本実験では十分量のタンパク質をアプライしているためゲルに少し残ってしまったようですブロッティング後のゲルを CBB染色 7

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1. ウエスタンブロッティング電気泳動で分離したゲル中のタンパク質を膜 ( メンブラン ) に移す方法をウエスタンブロッティング (Western Blotting) と言っていますわざわざ膜に移すのは抗原抗体反応等を利用して特異的検出 ( 目的のタンパク質だけを検出 ) を行なう為ゲル

1. ウエスタンブロッティング電気泳動で分離したゲル中のタンパク質を膜 ( メンブラン ) に移す方法をウエスタンブロッティング (Western Blotting) と言っていますわざわざ膜に移すのは抗原抗体反応等を利用して特異的検出 ( 目的のタンパク質だけを検出 ) を行なう為ゲル電気泳動と 51 年 BIOSCIENCE & BIOTECHNOLOGY 1. ウエスタンブロッティング電気泳動で分離したゲル中のタンパク質を膜 ( メンブラン ) に移す方法をウエスタンブロッティング (Western Blotting) と言っていますわざわざ膜に移すのは抗原抗体反応等を利用して特異的検出 ( 目的のタンパク質だけを検出 ) を行なう為ゲルのままではせっかく分離した試料

セミドライブロッティング実験方法 Semi-dry Blotting Protocol for Western Blotting 平成 16 年 4 月 19 日作製 平成 18 年 12 月 12 日改定 平成 21 年 1 月 13 日改定アトー株式会社 1

セミドライブロッティング実験方法 Semi-dry Blotting Protocol for Western Blotting 平成 16 年 4 月 19 日作製平成 18 年 12 月 12 日改定平成 21 年 1 月 13 日改定アトー株式会社 1