技術論文質量分析法 VITEK MS と生化学的性状による臨床分離株同定の比較検討服部拓哉 1) 村上いつか 1) 西山秀樹 1) 美濃島慎 1) 1) 名古屋第一赤十字病院検査部要池上志乃富 1) 山岸宏江 1) 鈴木真由子 1) 湯浅典博 1) 愛知県名古屋

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りえたなせ
5 years ago
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1 技術論文質量分析法 VITEK MS と生化学的性状による臨床分離株同定の比較検討服部拓哉 ) 村上いつか ) 西山秀樹 ) 美濃島慎 ) ) 名古屋第一赤十字病院検査部 - 要池上志乃富 ) 山岸宏江 ) 鈴木真由子 ) 湯浅典博 ) 愛知県名古屋市中村区道下町 - 旨マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析 MALDI-TOF MS 法による細菌名同定に関する報告は多数あるが最新の MALDI-TOF MS 装置である VITEK MS と従来の細菌名同定法を比較した報告は少ない我々は臨床分離株株を用いて VITEK MS と細菌の生化学的性状に基づく菌名同定機器 VITEK の菌名同定結果を比較した VITEK MS の同定率は属レベルで.% 種レベルで.% VITEK の同定率は属レベルで.% 種レベルで.0%であった属レベルでは VITEK の方が VITEK MS より高い同定率を示したが種レベルでは VITEK MS が VITEK より有意に高い同定率を示した腸内細菌科の株では検査手技に起因して VITEK MS で菌種が同定できないことがあった手技の向上及びデータベースの整備により VITEK MS の同定率は上がると考えられるキーワード質量分析 MALDI-TOF MS VITEK MS VITEK のでわずかな菌量で迅速な細菌同定が可能であ序る ), ) 本法による細菌同定結果に関する研究はこれまで多数報告されそれらでは菌名同定に関して従近年細菌感染症において薬剤耐性菌や抗菌薬適来法と比較して本法が優れていることが示される一正使用の観点から起因菌の迅速かつ正確な同定が方問題点も指摘されている ), ), 7) 我々の調べ得たますます重要となっているこれまで臨床細菌検査限りでは最新の MALDI-TOF MS 装置であるVITEK 室では形態学的及び生化学的手法により菌名を同定 MS Sysmex biomérieux と従来法による同定結果してきたがこうした同定には数時間から数日を要を比較した報告は Dubois らの報告のみであり本邦する一方 S rrna 解析等の分子生物学的手法からの報告は極めて少ない ) 今回我々は VITEK は正確な同定に優れているがサンプル処理が煩雑で MS が従来法に劣らない細菌同定能を有するかどうあり多量の検体を扱う臨床細菌検査室での日常検かを明らかにするため VITEK MS と生化学的性状査には不向きであるに基づく菌名同定装置 VITEK コンパクト Sysmex ) ) 年マトリックス支援レーザー脱離イオ biomérieux による同定結果の比較を行ったン化飛行時間型質量分析 matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry I 対象及び方法 MALDI-TOF MS 法が開発され蛋白質解析技術 ) が臨床細菌検査にも応用されるようになった ) 本法による細菌同定は生化学物質の反応を必要としない対象対象は 0 年月月のヵ月間に当院細菌平成年月日受付平成年月日受理 7 7

2 検査室に提出された臨床材料分離株株であるカードを用いた全ての分離株は時間の培養後あるいはコロニー VITEK MS 及び VITEK が複数菌名を表示した場が微小な場合は肉眼で確認できる大きさになるまで合や属レベルまでしか同定ができなかった場合そ発育させた後菌名同定を行った分離培養にはポれ以上の追加同定検査は行わなかったアメディア羊血液寒天培地栄研化学チョコレー結果の解釈ト寒天培地極東製薬パールコアマッコンキー寒 VITEK MS と VITEK 各機器によって菌名が得ら天培地栄研栄研化学またはカンピロバクターれた場合に同定率と両者の一致率を計算したが血液無添加選択寒天培地関東化学を用いた Table に示すように同定率と一致率を算出する際菌名同定検査の例外を設けた VITEK MS では Table 左列に MALDI-TOF MS 法として VITEK MS とその専用示す Acromobacter denitrificans A. xylosoxydans など解析ソフトである VITEK MS ver..0 が有するデータの菌種は判別ができないため統一菌名としてベースを用いた分離培養後独立した一つのコロ Acromobacter denitrificans/xylosoxydans などの右列にニーを釣菌しターゲットスライド Sysmex 示す菌名を採用した biomérieux に直接塗布したその上に専用の CHCA 統計解析マトリックス試薬 Sysmex biomérieux を.0 μl 滴 VITEK と VITEK MS の同定率は属レベルと種レ下して室温で十分に乾燥させた検体毎にベルにおいてそれぞれ McNemar 検定により比較し Esherichia coli ATCC 7 を較正スポットに塗布し P < 0.0 を統計学的有意差ありとした解析ソフト較正及び内因性コントロールとして使用した全ては EZR The R Foundation for Statistical Computing, の菌株にスポット測定を適用し蟻酸による蛋白 Perugia, Italy を用いた抽出処理は行わなかった従来法として細菌の生化学的性状に基づいて細菌 II 結果名判定を行う VITEK コンパクトを用いたコロニーの性状もしくはグラム染色結果によってそれぞれに適した同定カード GP GN NH ANC 及び YST Table VITEK MS と VITEK の同定率 VITEK MS により属レベルで株同定率 VITEK MS では判別が不可能な菌種の一覧候補菌名統一菌名 Achromobacter denitrificans Achromobacter xylosoxidans Achromobacter denitrificans/xylosoxidans Bacillus cereus Bacillus thuringiensis Bacillus mycoides Bacillus cereus/thuringiensis/mycoides Bacillus subtilis Bacillus amyloliquefaciens Bacillus subtilis/amyloliquefaciens Corynebacterium amycolatum Corynebacterium xerosis Corynebacterium amycolatum/xerosis Enterobacter cloacae Enterobacter asburiae Enterobacter cloacae complex Lactobacillus acidophilus Lactobacillus gasseri Lactobacillus acidophilus/gasseri Lactobacillus casei Lactobacillus paracasei Lactobacillus paracasei subsp. paracasei Lactobacillus casei/paracasei/paracasei subsp. paracasei Proteus vulgaris Proteus penneri Proteus vulgaris/penneri Streptococcus dysgalactiae subsp. dysgalactiae Streptococcus dysgalactiae subsp. Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis dysgalactiae/equisimilis 7

3 Table 臨床分離株株の同定結果 VITEK MS による同定菌種名 Staphylococcus aureus Staphylococcus capitis Staphylococcus epidermidis Staphylococcus haemolyticus Staphylococcus hominis Staphylococcus lugdunensis Staphylococcus saprophyticus Staphylococcus simulans Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Enterococcus raffinosus Enterococcus avium Enterococcus gallinarum Streptococcus pyogenes Streptococcus agalactiae Streptococcus pneumoniae Streptococcus mitis/oralis Streptococcus equisimilis/dysgalactiae Streptococcus anginosus Streptococcus constellatus Streptococcus salivarius Streptococcus sanguis Aerococcus urinae Grobicatella sanguinis Esherichia coli Klebsiella oxytoca Klebsiella pneumoniae Proteus mirabilis Proteus vulgalis/penneri Morganella morganii Serratia marcescens Serratia liquefaciens Salmonella group Enterobacter cloacae complex Enterobacter aerogenes Citobacter freundii Citobacter amalonaticus Citobacter braakii Citobacter fermeri Citobacter koseri Citobacter youngae Kluyvera cryocrescens Raoultella planticola Acinetobacter baumannii complex Campylobacter jejuni Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas putida Plesiomonas shigeroides Elizabethkingela meningoseptica Stenotrophomonas maltophilia Achromobacter xylosoxidans/denitrificans Aeromonas hydrophila/caviae Moraxella catarrhalis Corynebacterium jeikeium Corynebacterium pseudodiphtheriticum Corynebacterium amycolatum/xerosis Corynebacterium striatum Bacillus thuringiensis/cereus/mycoides Rothia mucilaginosa Pasteurella multocida No identification Total 菌株数 VITEK と結果が一致した菌種種レベル属レベル VITEK と属レベルでも一致しなかった菌種

4 .% 種レベルで 7 株.% の菌名が同定された一方 VITEK により属レベルで 0 株 III 考察.% 種レベルで 7 株.0% が同定された統計学的に属レベルでは VITEK が VITEK MS 今回我々は VITEK MS と VITEK を用いた臨床分より有意に高い同定率を示し P = 0.0 種レベル離株の同定結果を比較することで両法による菌名同では VITEK MS が VITEK より有意に高い同定率を定の違いを明らかにした MALDI-TOF MS 法と生化示した P = 0.00 学的性状に基づく細菌名同定結果を比較した報告は同定結果の比較多数あるが ), ), 7) 最新の MALDI-TOF MS 装置であ VITEK MS で属レベルまで同定された株のうる VITEK MS の同定能を従来法と比較した報告は少ち VITEK の同定結果と属レベルで一致した菌株ない ) MALDI-TOF MS 法による細菌名同定ではは 7 株.% であった Table 属レベルで蟻酸による蛋白抽出やスポット測定を行うことでも両者が一致しなかった株 7.% のうち株より高精度の菌名同定を行えることが報告されていは VITEK では Unidentified と表示され同定されなるが我々は蟻酸処理を行わずスポット測定で実かった残りの 0 株.% の菌名を Table に示施したこれは日常検査においては簡便かつ低コスした Staphylococcus epidermidis VITEK MS とトの方法で細菌名同定を行うことが重要と考えたか Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris VITEK らであるの組み合わせが株その他の不一致例は株ずつ今回の検討では属レベルでは VITEK が VITEK であった VITEK MS で種レベルまで同定された 7 MS より種レベルでは VITEK MS が VITEK より株のうち VITEK による同定結果と種レベルまでそれぞれ同定率が高かった種レベルの細菌名同定一致した菌株は株.% であったで MALDI-TOF MS 法が従来法に劣らないことは複 VITEK MS により菌種名が同定されなかった No 数の研究者により報告されており我々の検討でも identification と表示された 0 株のうち 7 株 % 裏付けられた ), ) 我々の研究では属レベルでの同定は VITEK では菌種名が同定されたその内訳は率は VITEK に比べて VITEK MS 法が劣ったがこ S. aureus S. hominis S. caprae Streptococcus れは VITEK MS と VITEK の菌名判定法の違いが一 agalactiae Corynebacterium coli 因と考えられる VITEK は種レベルまでの同定が Enterobacter cloacae complex Klebsiella oxytoca 困難な場合でも属特異的な生化学的性状が得られ Citrobacter freundii C. koseri Kluyvera intermedia れば属レベルで候補菌名を表示するが VITEK MS K. ascorbata Campylobacter jejuni Pseudomonas はデータベースのデータ単位が菌種レベルなので aeruginosa P. putida E. cloacae complex のみ株属レベルでの候補菌名は表示せず No identification とその他はそれぞれ株ずつで 7%が腸内細菌科表示することが一因であろう jeikeium E. グラム陰性桿菌であったこの 0 株中株 % は VITEK でも菌種名が同定されなかった Table VITEK MS と VITEK の同定菌名が一致しなかった菌種名 VITEK MS VITEK Staphylococcus epidermidis Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris Streptococcus pyogenes Micrococcus luteus/lylae 今回の我々の検討で同定菌名が一致しなかった株中 VITEK では菌種が同定されなかった株を除いた 0 株 Table のうち臨床的に重要な不一致として S. pyogenes VITEK MS と Micrococcus luteus/lylae VITEK 及び C. jejuni VITEK MS と Neisseria cinerea VITEK の株が挙げられる M. luteus/lylae と N. cinerea はヒトの常在菌の一種で Morganella morganii Proteus mirabilis あるが S. pyogenes と C. jejuni は通常起因菌とみ Klebsiella pneumoniae Klebsiella oxytoca なされるのでこの不一致は臨床に与える影響が大き Enterobacter cloacae complex Raoultella planticola Klebsiella oxytoca 認めランスフィールド抗原分類セロアイデンス Campylobacter jejuni Neisseria cinerea Rothia mucilaginosa Granulicatella adiacens トレプトキット栄研では A 群に属したため M. 0 7 い前者のコロニーは羊血液寒天培地上に溶血環を

5 luteus/lylae を否定したまた後者のコロニーはカン釣菌量が過剰だと良好なスペクトルを得られないこピロバクター血液無添加選択寒天培地に発育しグとはこれまで報告されてきたが ), ) 我々の経験ラム染色ではグラム陰性螺旋状桿菌が観察されたこでも同様であったしたがって日常検査においとから N. cinerea を否定した従って両菌株ともにて MALDI-TOF MS 法による同定結果が No VITEK MS での同定菌名が正しいことが確認された identification となった場合釣菌量を減らして再検残りの株はどちらの同定菌名であってもそれが査を行うことが推奨される ) こうした釣菌量の微治療計画に影響を及ぼすことは少ないと推定される調整は同定作業の経験の蓄積により習得されるであこのように同定結果を報告する際にはグラム染色やろうコロニーの所見発育培地を加味するべきである ) Risch らは臨床菌株株において従来法 VITEK 本研究では VITEK MS と VITEK で菌名が一致しなかった菌株について S rrna 解析等を用いてもしくは API システム Sysmex biomérieux で S. 菌名同定は行っていない臨床菌株には VITEK MS mitis/oralis と同定された菌が MALDI-TOF MS 法 VITEK それぞれのデータベースに収載されていなでは S. pneumoniae と同定されたと報告した ) 事実い菌種も存在することが推測される一方のデータ S. pneumoniae と S. mitis/oralis は遺伝子学的に極めてベースに収載されているが他方のデータベースに収類似している ) 今回の我々の検討では VITEK MS 載されていない菌種では菌名が一致しなかった可で S. pneumoniae と同定された株中株は菌名が能性がある一致し株は VITEK で S. mitis/oralis 株は MALDI-TOF MS 法による細菌名同定はこれまで VITEK で同定されなかった Dubois らは VITEK MS 微生物検査室が行ってきた同定法に比較していくつを用いて S. pneumoniae 株と S. mitis/oralis かの利点がある同定に要する時間が極めて短縮さ株を 00%識別できたことから VITEK MS は S. れ我々の検討では VITEK による細菌名同定は最 pneumoniae と他の α 溶血性連鎖球菌を区別すると報短でも時間時間を要したが VITEK MS 告した ) また Saffert らは S rrna 解析で K. では検体あたり数分であったまた同定にかか oxytoca と同定された株中 MALDI-TOF MS 法でるコストも従来の同定法より少ない 7), 0) Neville ら K. oxytoca と同定されたのは株のみであり残りの試算によると検体あたり VITEK による平均の株は Klebsiella 属の他菌種と同定されたと報告同定コストは Australian dollars AUD $0.00 であっした我々の検討では VITEK で K. oxytoca と同たのに対し MALDI-TOF MS のそれは AUD$0. で定された株中 VITEK MS でも K. oxytoca と同定あった 7) されたのは株であった残りの株は Raoultella 我々の検討で VITEK MS は VITEK と同等以上の planticola R. ornithinolytica 及び No identification で菌種同定能を有することが明らかになったが同定あった以上の結果よりこれまでの MALDI-TOF 結果を確認する際にはグラム染色発育培地及びコ MS 法を用いた研究で指摘された問題点の一部はロニーの所見を加味することで迅速性と精度を両 VITEK MS で改善される傾向にあることが示唆さ立した臨床現場での運用が実現できるであろうれた我々の検討では VITEK MS で菌名が同定されず IV 結語 VITEK で菌種名が同定された菌株の 7%が腸内細菌科グラム陰性桿菌であったこれは MALDI-TOF VITEK MS は VITEK に比べて菌種レベルの同定 MS 法に特有の検査手技に起因すると考えられる率は優れていたがその同定精度は検査担当者のサ MALDI-TOF MS 法は従来の細菌名同定法に比較しンプル処理技術に影響を受けるサンプル処理手技て同定作業に必要な手順が少なく複雑な知識を必要の向上及びデータベースの整備により VITEK MS としないので簡便かつ迅速に同定結果が得られるがの同定能は上がると考えられる慎重なサンプル処理が必要である ), ) MALDI-TOF MS 法で腸内細菌科グラム陰性桿菌を同定する際は 77

6 文献 ) Saffert RT et al. : Comparison of Bruker Biotyper matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometer to BD Phoenix automated microbiology system for identification of gram-negative bacilli, J Clin Microbiol 0 ; : 7. ) Risch M et al. : Comparison of MALDI TOF with conventional identification of clinically relevant bacteria, Swiss Med Wkly 00 ; 0 : w0. ) Karas M, Hillenkamp F : Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 0,000 daltons, Anal Chem ; 0 : 0. ) Seng P et al. : Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry, Clin Infect Dis 00 ; :. ) Sauer S, Kliem M : Mass spectrometry tools for the classification and identification of bacteria, Nat Rev Microbiol 00 ; : 7. ) Cherkaoui A et al. : Comparison of two matrix-assisted laser 7) ) ) 0) desorption ionization-time of flight mass spectrometry methods with conventional phenotypic identification for routine identification of bacteria to the species level, J Clin Microbiol 00 ; : 7. Neville SA et al. : Utility of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry following introduction for routine laboratory bacterial identification, J Clin Microbiol 0 ; : 0. Dubois D et al. : Performances of the Vitek MS matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system for rapid identification of bacteria in routine clinical microbiology, J Clin Microbiol 0 ; 0 : 7. Bizzini A et al. : Performance of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for identification of bacterial strains routinely isolated in a clinical microbiology laboratory, J Clin Microbiol 00 ; :. Dhiman N et al. : Performance and cost analysis of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for routine identification of yeast, J Clin Microbiol 0 ; :. Technical Article Comparative study of bacterial identification using VITEK MS and VITEK in routine clinical microbiological analysis Takuya HATTORI ) Hideki NISHIYAMA ) Shinobu IKEGAMI ) Mayuko SUZUKI ) Itsuka MURAKAMI ) Makoto MINOSHIMA ) Hiroe YAMAGISHI ) Norihiro YUASA ) ) Department of Clinical Laboratory, Japanese Red Cross Nagoya Daiichi Hospital (-, Michishita-cho, Nakamura-ku, Nagoya -, Japan) Summary There have been many reports of bacterial identification using a matrix-assisted laser desorption/ionization time-offlight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) system. However, studies of the bacterial identification using the most recent MALDI-TOF MS system (VITEK MS) compared with that using a conventional biochemical identification system are scarce. We compared VITEK MS with VITEK (a conventional biochemical identification system) in the identification of clinical isolates. The identification rate at the genus level for VITEK MS (.%) was significantly lower than that for VITEK (.%); however, the identification rate at the species level for VITEK MS (.%) was significantly higher than that for VITEK (.0%). VITEK MS might fail to identify enterobacteria owing to inadequate sampling techniques in some cases or insufficient databases of these bacteria. It is necessary for bacterial identification using VITEK MS to take findings of Gram staining and bacterial colonies into consideration. The identification rate for VITEK MS will be increased by improving sampling techniques and upgrading databases. Key words: Mass spectrometry, MALDI-TOF MS, VITEK MS, VITEK (Received: January, 0; Accepted: May, 0) 7

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untitled Seminal paper Anhalt JP Pioneering paper Claydon MA Kishnamurthy T Enterobacter B. cereus Routine identification paper Eigner U Seng P Cherkaoui A Saureus S. Saureus* S. Vagococcus Haemophilus Mycobacterium