学位論文の内容の要旨論文提出者氏名松尾祐介論文審査担当者主査淺原弘嗣副査関矢一郎金井正美論文題目 Local fibroblast proliferation but not influx is responsible for synovial hyperplasia in a mur

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あつとしあんさい
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1 学位論文の内容の要旨論文提出者氏名松尾祐介論文審査担当者主査淺原弘嗣副査関矢一郎金井正美論文題目 Local fibroblast proliferation but not influx is responsible for synovial hyperplasia in a murine model of rheumatoid arthritis ( 論文内容の要旨 ) < 要旨 > 関節リウマチ (RA) において増多した滑膜線維芽細胞と炎症細胞がパンヌスと呼ばれる増生滑膜組織を形成することは病理組織学的な特徴であるその増多した滑膜線維芽細胞は RA の炎症や骨破壊に重要な役割を果たすしかし滑膜線維芽細胞の増多の機序はよくわかっていない本研究は RA の動物モデルにおいて滑膜線維芽細胞の増多が局所での増殖に因るのか関節外部由来細胞の滑膜組織への流入に因るのかを明らかにすることを目的としたまず Ⅰ 型コラーゲンを発現する細胞において GFP を発現するレポーターマウス (Col1a2-GFP マウス ) に対して抗 ΙΙ 型コラーゲン抗体誘導関節炎 (CAIA) を誘導し増多した滑膜線維芽細胞を GFP 陽性細胞として同定した次に Col1a2-GFP マウスから野生型マウスへ骨髄移植を行い CAIA を誘導したまた Col11a2-GFP マウスと野生型マウスにて併体結合を行い CAIA を誘導した骨髄移植を受けたマウスと併体結合したマウスの増生滑膜組織に GFP 陽性細胞を認めなかったまた CAIA を誘導した Col1a2-GFP マウスの滑膜組織において GFP 陽性細胞のうち Ki67( 細胞増殖マーカー ) を発現している滑膜線維芽細胞が正常マウスと比して有意に高かった (34% 対 0.40%) 細胞周期の S/G2/M 期に Azami-Green を発現する遺伝子改変マウス (Fucci マウス ) に CAIA を誘導すると Vimentin( 線維芽細胞マーカー ) 陽性細胞のうち Azami-Green を発現している滑膜線維芽細胞が正常マウスと比して有意に高かった (19% 対 0.26%) これらの結果から RA のマウスモデルにおいて滑膜線維芽細胞の増多が関節外由来細胞の滑膜組織への流入に因らず局所での増殖に因ることを示した滑膜線維芽細胞の増殖は RA の有望な治療標的となりうる < 緒言 > RA において増多した滑膜線維芽細胞と炎症細胞がパンヌスと呼ばれる増生滑膜組織を形成することは病理組織学的な特徴であるその増多した滑膜線維芽細胞は RA やその動物モデルたとえばⅡ 型コラーゲン抗体誘導性関節炎 (CAIA) やコラーゲン誘導性関節炎 (CIA) の炎症や骨破壊に重要な役割を果たすことが知られてきたしかし滑膜線維芽細胞の増多の機序はいまだによくわかっていない - 1 -

2 その機序には元々局所に存在する滑膜線維芽細胞が増殖すると考えられていた一方近年 RA の動物モデルにおいて関節外からの細胞が流入する説も提唱されてきたまた皮膚や腎の線維症の動物モデルにおいて骨髄移植や併体結合の方法を用いて増多した線維芽細胞が外部からの流入による機序もあることが示されてきた本研究では RA の動物モデルを用いて滑膜線維芽細胞の増多の機序が局所増殖や関節外からの細胞流入に因るのかを明らかにすることを目的とした < 方法 > Ι 型コラーゲン陽性細胞に GFP を発現する遺伝子改変マウス (Col1a2-GFP マウス,) を用いた野生型マウスに CD45.2 もしくは CD45.1 マウス ( コンジェニックマウス ) を用いたなお全ての動物実験は動物実験委員会の承認を得たまず Col1a2-GFP マウスに対して RA の動物モデルである CAIA を誘導した次に致死的放射線を受けた野生型マウスに Col1a2-GFP マウスの骨髄細胞を移植したまた野生型マウスと Col1a2-GFP マウスを併体結合した骨髄移植や併体結合したマウスに CAIA を誘導し増生滑膜組織における GFP 陽性細胞を共焦点顕微鏡を用いて組織学的にフローサイトメトリーを用いて定量的に評価したキメリズムは既報に従い末梢血の細胞をサンプルとして内在性コントロールである GAPDH 遺伝子でノーマライズされた GFP 遺伝子をリアルタイム PCR にて相対定量もしくは CD45.1 と CD45.2 の発現をフローサイトメトリーで評価したさらに CAIA を誘導した群と誘導しない群を比較し Col1a2-GFP マウスの滑膜組織においては細胞増殖マーカーである Ki67 の発現細胞周期の S/G2/M 期に Azami-Green を発現するレポーターマウス (Fucci マウス ) の滑膜組織においては線維芽細胞マーカーである Vimentin の発現を組織学的に評価した増殖細胞の割合は対応のない t 検定を用いて統計学的に解析した < 結果 > 線維症モデルの既報で線維芽細胞の同定に用いられてきた Col1a2-GFP マウスに CAIA を誘導し免疫組織染色を用いて滑膜線維芽細胞を同定できるか調べた CAIA を誘導したマウスの増生滑膜組織において正常マウスと比して増多した GFP 陽性細胞は線維芽細胞マーカーである vimentin や hsp47 が陽性であったこれらの結果から Col1a2-GFP マウスの滑膜組織における GFP 陽性細胞は滑膜線維芽細胞として同定された次に滑膜線維芽細胞の増多が骨髄由来細胞の流入に因るかを明らかにするために骨髄移植を行った Col1a2-GFP マウスの骨髄細胞を野生型マウスに移植した 2 か月後のレシピエントマウスの末梢血のキメリズムは 87% 以上であり骨髄の再構築を確認した CAIA を誘導後十分な滑膜腫脹を認めた滑膜組織を組織学的にまたフローサイトメトリーを用いて解析したレシピエントマウスの増生した滑膜組織に GFP 陽性細胞を全く認めなかったこの結果から滑膜線維芽細胞の増多は骨髄由来細胞の流入に因らないことを示した骨髄移植モデルは in vivo で骨髄由来細胞を追跡する標準的な方法であるが全身への放射線照射によって滑膜の微小環境が変化する可能性や全ての間葉系の前駆細胞が置換されない可能性が考えられたまた免疫不全マウスの皮下に移植した RA の滑膜線維芽細胞は関節に流入 - 2 -

3 したという既報があるため関節炎の発症中においても血流を交流できる併体結合モデルの実験も行った結合した 2 か月後の野生型マウスの末梢血のキメリズムは 41-59% であり末梢血の交流を確認した十分腫脹した滑膜組織を組織学的にまたフローサイトメトリーを用いて解析した野生型マウスの増生した滑膜組織に GFP 陽性細胞を全く認めなかったこの結果からも滑膜線維芽細胞の増多は関節外からの流入に因らないことがわかった滑膜線維芽細胞の増多が関節外からの流入に因らないならば局所増殖に因ると考えた滑膜線維芽細胞の増殖を調べるために細胞周期の G0 期 ( 静止期 ) に発現せず増殖期の G1/S/G2/M 期に発現する Ki67 による免疫組織染色を行った Col1a2-GFP マウスに関節炎を誘導した滑膜組織では誘導しない滑膜組織と比べて GFP 陽性細胞のうちの Ki67 陽性細胞の割合が有意に高かった (34% 対 0.40%, P < 0.05) 次に滑膜線維芽細胞の増殖は Fucci マウスの解析を行った Fucci マウスに関節炎を誘導した滑膜組織では誘導しない滑膜組織と比べて滑膜線維芽細胞のマーカーである vimentin 陽性細胞のうちの細胞周期の S/G2/M 期に発現する Azami-Green 陽性細胞の割合が有意に高かった (19% 対 0.26%, P < 0.05) これらの結果は滑膜線維芽細胞の増多は局所増殖に因る仮説に合致していた < 考察 > 我々は滑膜線維芽細胞の増多の機序が関節外からの流入に因らず局所の線維芽細胞の増殖に因ることを示した近年培養した骨髄由来の間葉系細胞単離した血中の線維細胞培養した線維芽細胞を全身投与もしくは皮下移植することで関節にその細胞が流入することが RA の動物モデルにて報告されてきたこれは我々の結果と異なるこれらの研究では細胞の培養や単離により間葉系細胞の接着因子や細胞運動性に変化を与えひいては細胞の遊走能に変化を生じ人工的な結果が生じたのかもしれないまた我々と似た手法を用いて骨髄由来細胞が関節へ流入すると示した一つの報告があるユビキタスに GFP を発現するマウスの骨髄を野生型マウスに移植し骨髄再構築後に関節炎が誘導された腫脹した関節組織全体が採取され ex vivo にて培養すると GFP 陽性細胞が認められていた GFP 陽性細胞の解析はなされておらず骨髄細胞のコンタミネーションの可能性も否定できなかったが我々の実験系ではこの可能性を除外できるように行った本研究において RA マウスモデルにおいて滑膜線維芽細胞の増多は局所の線維芽細胞の増殖に因ることを示した RA においても細胞増殖マーカーを発現する滑膜線維芽細胞は変形性関節症患者よりも有意に多いことが報告されているそのため RA においても滑膜線維芽細胞の増多は局所の線維芽細胞の増殖に因ると考えられた現行の炎症細胞や炎症性サイトカインを標的とした RA の治療法は効果的であるもののなお不十分であるまた免疫抑制による重篤な感染症の危険性が高いことが問題であり炎症以外を標的とした治療標的の同定が求められているそのため線維芽細胞の増殖は RA の有望な治療標的となりうると考える - 3 -

4 < 結論 > 滑膜線維芽細胞の増多は関節外からの流入に因らず局所の滑膜線維芽細胞の増殖に因る滑膜線維芽細胞の増殖を標的とすることは RA の有望な治療戦略となりうる - 4 -

5 論文審査の要旨および担当者報告番号甲第 4914 号松尾祐介論文審査担当者主査淺原弘嗣副査関矢一郎金井正美 ( 論文審査の要旨 ) 1. 論文内容関節リウマチは未だ原因が不明の難病であるがその病態において関節局所の滑膜線維芽細胞の増多が重要な役割を果たしていることが知られているしかしその由来については十分な検討がされていなかった本研究においては複数の遺伝子改変マウスに関節炎を誘導し分子生物学的に詳細な解析を行うことで滑膜線維芽細胞の増多が関節外由来細胞の滑膜組織への流入に因らず局所での増殖に因ることを示した 2. 論文審査 1) 研究目的の先駆性独創性関節リウマチにおいて増多する滑膜線維芽細胞の由来を解析することは重要なテーマであるが十分に明らかにされていなかった結論を得るためには複数の遺伝子改変マウスおよび研究手法を用いた解析が必要となるが本研究ではこれらの研究を完遂することで滑膜線維芽細胞の増多は局所での増殖によるものであるという重要な結論を得るに至っており先駆性独創性ともに高いものである 2) 社会的意義関節リウマチの新しい治療法の開発において本研究の成果は重要な知見でありこれを基にした治療開発が期待される 3) 研究方法倫理観本研究では複数の遺伝子改変マウスおよびマウスモデルを適格に利用している点が評価されるまず Ⅰ 型コラーゲンを発現する細胞において GFP を発現するレポーターマウス (Col1a2-GFP マウス ) に対して抗 ΙΙ 型コラーゲン抗体誘導性関節炎 (CAIA) を誘導した実験次に Col1a2-GFP マウスから野生型マウスへ骨髄移植を行い CAIA を誘導した実験を行ったまた Col11a2-GFP マウスと野生型マウスにて併体結合を行い CAIA を誘導し併体結合した野生型マウスで増生滑膜組織を解析したさらに細胞周期の S/G2/M 期に Azami-Green を発現する遺伝子改変マウス (Fucci マウス ) に CAIA を誘導し細胞周期の観点からも検討を行っているこれら研究は動物実験委員会で認められた適切な実験動物計画に基づいて行われている 3. 考察今後の発展性申請者は本研究の結果から滑膜線維芽細胞の増殖を治療標的とした関節リウマチの新しい治療開発を議論しており今後の発展が期待されるまた基礎医学的にも滑膜細胞の起源という重要な課題を提示するものであり申請者の博士研究者としての更なる活躍に繋がるものである 4. その他特になし 5. 審査結果以上を踏まえ本論文は博士 ( 医学 ) の学位を申請するのに十分な価値があるものと認められ ( 1 )

6 た ( 2 )

東邦大学学術リポジトリタイトル別タイトル作成者 ( 著者 ) 公開者 Epstein Barr virus infection and var 1 in synovial tissues of rheumatoid 関節リウマチ滑膜組織における Epstein Barr ウイルス感染症と Epst

東邦大学学術リポジトリタイトル別タイトル作成者 ( 著者 ) 公開者 Epstein Barr virus infection and var 1 in synovial tissues of rheumatoid 関節リウマチ滑膜組織における Epstein Barr ウイルス感染症と Epst 東邦大学学術リポジトリタイトル別タイトル作成者 ( 著者 ) 公開者 Epstein Barr virus infection and var 1 in synovial tissues of rheumatoid 関節リウマチ滑膜組織における Epstein Barr ウイルス感染症と Epstein Barr nuclear antigen 1 の変異増岡, 正太郎東邦大学発行日 2019.03.13

学位論文の内容の要旨 論文提出者氏名 松尾祐介 論文審査担当者 主査淺原弘嗣 副査関矢一郎 金井正美 論文題目 Local fibroblast proliferation but not influx is responsible for synovial hyperplasia in a mur

学位論文の内容の要旨論文提出者氏名松尾祐介論文審査担当者主査淺原弘嗣副査関矢一郎金井正美論文題目 Local fibroblast proliferation but not influx is responsible for synovial hyperplasia in a mur