The Application of Synthetic Thrombin Inhibitor to Determination of Thrombin-Antithrombin III Complex (TAT). Tsutomu YAMASHITA*, Kaori KOUZAI*, Noriko

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1 The Applicion Syntic Thrombin Inhibitor to Determinion Thrombin-Antithrombin III Complex (TAT). Tsutomu YAMASHITA*, Kaori KOUZAI*, Noriko INOUE*, Koichi MIMURA* Akira MATSUOKA* Key words: Thrombin-antithrombin III complex (TAT), syntic thrombin inhibitor, Argroban, FOY, Heparin

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3 山 下,ほ か:合 成 トロ ン ビ ン 阻 害 剤 の トロ ン ビ ン ア ン チ トロ ン ビ ンIII複 Fig.1 合 体(TAT) 51 Sodiumdodecyl sulfe gel electrophoretic analysis thrombin-antithrombin III thrombin-antithrombin III heparin. Prior to electrophoretic samples min were in to M 6.8) analysis, heed 100 containing 2% mercaptoethanol,2% dodecyle sulfe, n 10%glycer- applied to gradient slab gel, were lhour run 60mA. Thrombin-antithrombin A III inter- B:Thrombin-antithrombin III-heparin Fig.2 7μl gel(4 20% mm) action R- Samples Polyacrylamide 2 sodium- ol,0.01%bpb. were Tris-HCl(pH interaction. Time course TAT mion in purifiedsystem. 500kl Antithrombin ml)was bin(250 NIH reaction Samples (ph were 7.4)to urined III(1.0U/ 500μl U/ml) by adding diluted 150 throm- incubed stopped 0.2MDFP. holds Tris-HCl concentrion deter complex. ( ):Thrombin-antithrombin III interaction. ( ):Thrombin-antithrombin heparin 早 期 か ら多 くのTATが 3)保 存 に よ るTAT測 健 常 人5名 形 成 さ れ た. 定値の推移 よ り3種 類 の 抗 凝 固 剤(3義13% ク エ ン 酸 ナ ト リ ウ ム,EDTA-2 用 い て2本 III- interaction. Na, 注 射 器 法(two-syringes に て 血 液 を 採 取 し,得 た 血 漿 中 のTATを NaF)を method) 経 時

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5 山 下,ほ か:合 成 トロ ン ビ ン阻 害 剤 の ト ロ ン ビ ン ア ン チ ト ロ ン ビ ンIII複 Fig.5 合 体(TAT) 53 Sodiumdodecyl sulfe gel electrophoretic analysis effect syntic thrombin inhibitorsin purifiedsystem. 245μl Antithrombin ml)was Argroban ed III(1.0U/ or FOY 5 min μl thrombin(250 incubed NIH analysis added reaction 0.2MDFP. incub245 U/ml) stopped ding 10μl by ad- Electrophoretic was done A:Containing similarly. Argroban(final concentrion:0.1mm) B:Containing FOY(final concen- trion:0.1mm) Fig.6 The effect hibitors on vion 50μl ture thrombin TAT inby acti- mm)or added to 200μl M amounts acid, incubed FOY plasma cephalin, determined ( ):Control, ( ):Containing FOY NIH TAT. groban,( ):Containing The effect hibitors was activor(mix- eladic 0.025MCaCl2) Fig.7 on syntic change thrombin levels TAT inby incubion. coagulion. Argroban(0.23 (0.1M)was syntic mion ar- Antithrombin U/ml) added 200μl saline adding 0.2MDFP thrombin(250 l hour argroban(1.0mm)or furr incubed amount III(1.0U/ml) incubed stopped reaction determined complex. ( ):Control,( ):Containing argroban by

6 54 日本 血 栓 止 血学 会 誌 第3巻 第1号 Fig.8 Sodiumdodecyl sulfe electrophoretic analysis effect syntic thrombin hibitorson change TAT incubion. ml, Antithrombin containing was bin(250 ed 100 NIH or thromincub- added by 200μl stopped adding electrophoretic done incubed reaction heparin) argroban(1.0mm) furr III(1.0U/ U/ml U/ml) 1 hour saline gel inby 0.2MDFP analysis was similarly. A:Control, B:Containing Ar- groban 間 以 後 は コ ン トロ ー ル と 同 様 に低 下 し て 行 っ 場 合,分 た.こ 形 成 さ れ た(Fig.1A).一 れ を 同 時 にSDS-PAGEに て 分 析 し た. 子 量90,000の コ ン ト ロ ー ル で は イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン時 間 と と す る 場 合,分 も に 複 合 体1か 合 体(複 IIIへ ら複 合 体IIへ,そ して 複 合 体 と小 分 子 量 化 が 認 め ら れ た の に 対 し て Argrobanを 添 加 した 方 は イ ン キ ュベ ー シ ョ ン 後 期 ま で 分 子 量90,000の 複 合 体IIが 認 め ら れ た(Fig.8A,B)- パ リ ンが 存 在 複 数 の複 合 体III,II,I)が 早 期 に 認 め ら れ た.さ ン 初 期 に 形 成 さ れ る 複 合 体(複 ン キ ュベ ー シ ョ 合 体1)に ロ ン ビ ン はAT-IIIと1:1の モ ル比 で 結 の複 合 体 は トロ ン ビ ン の 活 性 中 心 の セ リ ン 残 基 とAT-IIIの アル 比 べ て イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン後 期 に 形 成 さ れ る複 合 体 ン,AT-IIIを よ り不 活 化 さ れ る場 合 し複 合 体 を 形 成 す る2).こ イ ン キ ュベ ー シ ョン ら に,イ そ の分 子 量 が 小 さ くそ の 小 分 子 量 化 は 経 時 的 で あ っ た(Fig義1B).ト 察 トロ ン ビ ン がAT-IIIに 合,ト 方,ヘ 子 量78,000 93,000の (複 合 体III)は 考 単一 の複 合体 が 徐々 に ロン ビ 同様 に そ れ ぞ れ 単 独 で イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン し た と き72時 間 まで そ れ ぞ れ の 分 子 量 に 変 化 は 認 め な か っ た(成 績 未 表 示).ま た ヘ パ リ ン が 存 在 し な い 場 合 で もイ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン 後24時 間 程 度 か ら小 分 子 量 化 が認 め ら ギ ニ ン残 基 との 間 に形 成 され る ア シル 結 合 に よ れ た(成 る1)9).こ の 複 合 体 の 結 合 は 安 定 で あ る と 考 え 合 部 位 と は 別 に ヘ パ リ ン 結 合 部 位 が 存 在 し,ヘ ら れ て い る.今 パ リ ン はAT-IIIと 回,わ れ わ れ が用 い た 系 に お い て ヒ ト トロ ン ビ ン に ヒ トAT-IIIを 反 応 させ た 績 未 表 示).AT-IIIに ビ ンAT-IIIの は トロ ン ビ ン結 結 合 す る こ と に よ り トロ ン 複 合 体 形 成 を 著 明 に 促 進 す

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