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1 DNA を用いた微生物 分析の現場での活用 平成 18 年 10 月 5 日 B 会場 15:30~15:50 三井農林 ( 株 ) 食品総合研究所微生物分析サービス

2 衛生管理手法の変化 従来の方法 公定法に基づく微生物検査 一般性菌数 大腸菌群の判定など 実際は HACCP や cgmp の導入 大規模 大量生産 流通の多様化 迅速化 安全性追求意識の高まり より正確正確で迅速迅速かつ簡便簡便な微生物検査方法が必要 複雑な製造工程を管理するためには菌数だけでなく 菌の名前を決め (= 同定 ) フローラを把握 フローラを把握することが必要 2

3 これからの微生物管理 菌数測定 + 同定検査 常在菌の把握 原料管理 ライン管理 環境管理 イレギュラー菌の把握 的確な問題解決 ( 殺菌 洗浄など ) 出荷判定 クレーム原因菌の特定 顧客への迅速な対応 再発防止 信用回復 3

4 表現形質に基づく同定法 従来の微生物同定法 形態的特徴 細胞やコロニーの色や形 その他の特徴 生理 生化学的特徴 生育温度や ph 栄養要求性 酸素の要求性など 既知種 推定種数 真菌 ( カビ 酵母 ) 80,000 種 >1,000,000 種 細菌 5,000 種 >50,000 種 さらに年間数百種の割合で増加している 微生物同定検査 専門家でなければ困難 操作が煩雑 判定が主観的長期間 (~1 ヶ月 ) を要する再現性がない場合がある 従来の同定法は企業の TPO にマッチしない しかし DNA 検査法はその問題を克服 4

5 A. niger MicroSeq D2 解析の結果 黒麹カビの一例 A. awamori A. carbonarius 黒いコロニーが特徴 A. japonicus 5

6 DNA 分析導入のハードル 分析機器 試薬が高額 いつも使用するわけではない 人的 スペース的に余裕がない 同定した後の情報収集が難しい 第三者に依頼しなければならない 三井農林 ( 株 ) 食品総合研究所 微生物分析サービス 微生物の簡易同定分析 オプション 系統解析 形態観察 リボタイピング解析 6

7 簡易同定分析 シークエンス法) 部分塩基配列解析 MicroSeqキット使用 16S rdna塩基配列1,500bp解析 MicroSeqキット使用 16S rdnaまたは28s rdna 微生物のコロニー PCR反応 染色体DNA 遺伝子増幅装置 遺伝子増幅装置 Bacillus subtilis 塩基配列解読装置 7

8 微生物の説明文 8

9 系統解析 形態観察 ( オプション ) オプション 94 A. acidocaldarius subsp. acidocaldarius ATCC T 100 A. acidocaldarius subsp. rittmannii DSM T Alicyclobacillus genomic species 1 DSM Alicyclobacillus genomic species 2 MIH332 A. acidiphilus TA 67 T A. acidoterrestris ATCC T A. hesperidum DSM T 分離株 A. cycloheptanicus DSM 4006 T S. disulfidooxidans DSM T A. herbarius CP 1 T B. tusciae IFO T B. subtilis IAM T S. acidophilus DSM T 100 S. thermosulfidooxidans DSM 9293 T Arthrobacter globiformis JCM 1332 T 麹カビの一種 カビ分生子 芽胞菌 9

10 MMID 利用例 1 リボタイピング解析リボタイピング解析は 複数の菌株間の類縁性を評価するのに有効な手法であり 菌株レベルの同一性を判定 ( 個体識別 ) することが可能です 製品原料 加熱殺菌後 16S rdan 部分配列に基づくフローラ調査の結果 A Bacillus coagulans Bacillus licheniformis Bacillus pumilus Bacillus sp. ( 近縁種 B. oleronius ) Bacillus subtilis B C Bacillus megaterium Bacillus sp. ( 近縁種 B. circulans ) Klebsiella sp. Paenibacillus glycanilyticus Paenibacillus sp. Bacillus fusiformis Bacillus megaterium Bacillus pumilus Bacillus sp. Paenibacillus favisporus Paenibacillus sp. Paenibacillus sp. ( 近縁種 P. chibensis ) Paenibacillus sp. ( 近縁種 P. curdlanolyticus ) Paenibacillus sp. ( 近縁種 P. stellifer ) 加熱前の原料にいた菌が生残したのか? どのパーツに由来しているのか? どうすれば改善されるのか? リボタイピング解析 10

11 同一菌種であっても リボパターンは個体レベルで異なっている A1 Bacillus sp. ( 近縁種 B. oleronius ) a A2 Bacillus sp. ( 近縁種 B. oleronius ) b c d e f g h i j k C1 Bacillus sp. A3 Bacillus subtilis l B1 Bacillus sp. ( 近縁種 B. circulans ) A4 Bacillus coagulans C2 Bacillus megaterium C3 Bacillus fusiformis A5 Bacillus pumilus m C4 Bacillus pumilus B2 Bacillus megaterium B3 Klebsiella sp. B4 Paenibacillus glycanilyticus A6 Bacillus licheniformis A7 Bacillus licheniformis A8 Bacillus licheniformis A9 Bacillus subtilis n o A10 Bacillus subtilis C5 Paenibacillus sp. ( 近縁種 P. stellifer ) C6 Paenibacillus favisporus C7 Paenibacillus sp. ( 近縁種 P. chibensis ) C8 Paenibacillus sp. B5 Paenibacillus sp. C9 Paenibacillus sp. ( 近縁種 P. curdlanolyticus ) 加熱殺菌後に検出された菌は 1 製品原料中のパーツ A に由来する 2 検出された多くの株が Bacillus sp. ( 近縁種 B. oleronius) であり 耐熱性が高いと推察される 3 パーツ A のみ殺菌温度を高く設定し 他の原料は現状のまま使用することが可能 11

12 MMID 利用例 2 乳製品および原料の大腸菌群検査 BGLB 法 (-) VS 特定酵素基質培地法 (+) 試験方法によって結果が違うのは何故か? <BGLB 法 > 大腸菌群の中には β-ガラクトシダーゼを産生しても透過酵素を欠くため乳糖を発酵しない菌がいるため 陰性となる場合がある < 特定酵素基質反応法 > Bacillus 属などの一部の菌は β-ガラクトシダーゼを産生するため 大腸菌群以外の菌も陽性となる場合がある ラウリル酸ナトリウム等のグラム陰性菌の選択剤が培地中に添加されている 12

13 特定酵素基質培地 (+) 16S rdna による同定の結果 グラム陽性細菌 Enterococcus faecium β- ガラクトシダーゼ (+) 純粋培養したコロニー フィルター滅菌した乳成分 + 純粋培養したコロニー 乳成分が菌の生育力を増進させてしまい 擬陽性となった 特定酵素基質培地 (-) 特定酵素基質培地 (+) 13

14 研究実績 2003 年 10 月全国清涼飲料研究会会長賞受賞 Alicyclobacillus 属細菌のグアイアコール生産性とその検査方法 2006 年 6 月日本微生物資源学会奨励賞受賞 好気性有胞子細菌の分類学的研究とその遺伝情報および生物資源の産業界での活用 現場に通じ 学術の知識を兼ね揃えたスタッフが皆様のご要望にお応えします norin.co.jp/mmid/ 14

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