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1 2010 年度修士論文 クルクミンはダウンヒル運動後のマウスの 骨格筋における NADPH-oxidase および MCP-1 の遺伝子発現を抑制する Curcumin suppresses NADPH-oxidase and MCP-1 mrna expression in skeletal muscle of mice following downhill running 早稲田大学大学院 スポーツ科学専攻 スポーツ科学研究科 スポーツ医科学研究領域 5009A025-9 加藤 Kato, 孝基 Koki 研究指導教員 : 鈴木克彦准教授

2 目次 1 ) 緒言 1 2 ) 方法 ) 実験動物と飼育条件 2-2 ) ダウンヒル走行運動負荷 2-3 ) クルクミン投与 2-4 ) 採血および筋組織採取 2-5 ) クレアチンキナーゼ活性 2-6 ) r e a l - t i m e q u a n t i t a t i v e P C R 2-7 ) タンパク質濃度測定 2-8 ) H y d r o g e n p e r o x i d e 濃度測定 2-9 ) 統計処理 3 ) 結果 8 4 ) 考察 ) 結論 ) 謝辞 ) 参考文献 ) おわりに - 今後の展望 3 1

3 1 ) 緒言生体には損傷に対する防御機構が存在し 組織の恒常性を保っている 骨格筋においても 運動や圧迫ストレス 外傷に伴う組織の損傷が引き起こされると 組織を再生する機構がはたらく しかしながら 過度な運動により防御機構のバランスが崩れると 組織再生の遅れ 機能障害などを引き起こす ダウンヒル運動などにみられる伸張性筋収縮は 筋繊維 の過剰な損傷や炎症反応を伴うことが知られている [ 1, 2 ] これまでに実 験動物を用いた研究より ダウンヒル運動は炎症性サイトカインおよび活性酸素の産生を伴うことが報告されている [ 3, 4 ] 近年 これらの炎症反応には好中球やマクロファージなどの免疫細胞が関与していることが明らかになった [ 5 ] 骨格筋損傷後の炎症反応は 損傷した骨格筋組織での t u m o r n e c r o s i s f a c t o r ( T N F ) - や i n t e r l e u k i n ( I L ) - 1 β I L - 6 などの炎症性サイトカインの産生により惹起される 実際に マウス前脛骨筋のカルディオトキシン誘発性筋損傷直後に 組織内で T N F - α と I L - 1 β の遺伝子発現が増加することが報告されている [ 6 ] また ラットを用いた研究では ダウンヒル運動直後に外側広筋および腓腹筋で T N F - α の遺伝子発現が増加することが報告されている [ 7 ] さらに 運動 2 4 時間後にマウス腓腹筋の I L - 1 β タンパク質濃度が増加することが報告されている [ 8 ] また 骨格筋損傷時には 組織内に好中球 マクロファージなどの白血球が浸 潤することが知られている [ 9 ] 白血球の浸潤は T N F - α や I L - 1 β により E セレクチンなどの細胞接着分子の発現が増加し I L - 8 m o n o c y t e c h e m o a t t r a c t a n t p r o t e i n ( M C P ) - 1 などのケモカインが損傷後に増加す ることで誘導される [ 6, 1 0, 1 1 ] 最も早く組織に浸潤する白血球は好中 球である 実際に ダウンヒル誘導性筋損傷 4 5 分後に損傷部位に浸潤 1

4 することが報告されている [ 9 ] ケモカインで誘導された好中球は活性化 され 損傷組織に浸潤し貪食を行う [ 1 2 ] また 筋損傷時には M C P - 1 の作用によりマクロファージの浸潤が誘導されることが知られている [ 1 3, 1 4 ] 組織に浸潤したマクロファージは 損傷部位の貪食を行うだけでなく 炎症の鎮静化と筋サテライト細胞を含む筋幹細胞の活性化も引き起こ すことが考えられている [ 1 5 ] 一方で 好中球やマクロファージの形質膜 に存在し 酸化酵素としてはたらく N A D P H - o x i d a s e により活性酸素が産生される [ 1 6, 1 7 ] N A D P H - o x i d a s e は 好中球やマクロファージが貪食を行った際に活性化され 電子供与体として酸素を 1 電子還元してスーパーオキシド ( O - 2 ) を産生する [ 1 8 ] また 生成された O - 2 は 過酸化水素 ( h y d r o g e n p e r o x i d e : H 2 O 2 ) に代謝される 実際に 2 時間のダウンヒル運動後 ラットの腓腹筋およびヒラメ筋の H 2 O 2 濃度が上昇することが報告されている [ 7 ] また H 2 O 2 は N F - κ B などのシグナル伝達経路を活性化し それらの伝達経路は I L - 1 I L - 6 などの炎症性サイトカインを 誘導することが報告されている [ 1 9 ] 生体には 運動および骨格筋損傷 により生じた活性酸素を生成する系と消去する系が存在しバランスを保っ ているが 活性酸素生成系が消去系の能力を超えると酸化ストレス状態 となり デオキシリボ核酸 ( D N A ) 細胞膜などの脂質およびタンパク質を 傷害し 細胞死を引き起こすことが考えられる [ 2 0 ] また 過剰な活性 酸素により運動パフォーマンスが低下することも知られている [ 2 1 ] 天然ウコンの主成分であるクルクミンは様々な疾患モデルにおいて抗炎症作用を示すことが明らかにされている [ 2 2, 2 3 ] クルクミンの作用機序について これまでに N F - B の活性を抑制することが報告されている [ 2 4, 2 5 ] したがって N F - B シグナル伝達経路の活性抑制を介して T N F - I L - 1 β などの炎症性サイトカインを抑制すると考えられる また クルクミンは 2

5 H 2 O 2 などの活性酸素の産生を阻害することが報告されている [ 2 6 ] クルクミンは抗炎症作用および抗酸化作用を示すことから 筋損傷を伴う運動においても炎症状態を抑制する可能性が考えられる 実際に マウスを用いた動物実験で クルクミン投与によりダウンヒル運動誘発性筋損傷後の骨格筋の I L - 1 β I L - 6 T N F - α タンパク質濃度が減少することが報 告されている [ 8 ] しかしながら クルクミン摂取によるダウンヒル運動時の 筋組織での炎症反応抑制の作用機序に関しては十分に解明されていな い クルクミンは p h o r b o l m y r i s t a t e a c e t a t e ( P M A ) 誘導性 M C P - 1 の産 生を抑制することが報告されている [ 2 7 ] したがって クルクミンによる筋 損傷時の炎症反応の改善には マクロファージ浸潤の抑制が関与している可能性が考えられる さらに クルクミンの抗酸化作用から好中球やマクロファージの活性酸素産生が抑制される可能性も考えられる そこで 本研究では 高吸収のクルクミンを経口で単回投与し マウスのダウンヒル走行運動誘導性筋損傷後の骨格筋組織の炎症反応 酸化ストレスおよび免疫細胞浸潤に及ぼす影響を明らかにすることを目的とした 3

6 2 ) 方法 1. 実験動物と飼育条件 本実験では 1 0 週齢の C 5 7 B / 6 J 雄マウス ( 紀和実験動物研究所, W a k a y a m a, J a p a n ) を用いた 室温 2 1 湿度 3 5 % 2 1 : : 0 0 を暗 期に 9 : : 0 0 を明期に設定した飼育室において ゲージ内で飼育した M F ( オリエンタル酵母, T o k y o, J a p a n ) の飼料を使用し 飲水は水道水 を用い ともに自由摂取とした マウスは 無作為に安静 + クルクミン非投 与群 ( n = 1 2 ) 安静 + クルクミン投与群 ( n = 1 2 ) 運動 + クルクミン非投 与群 ( n = 1 4 ) 運動 + クルクミン投与群 ( n = 1 4 ) の 4 群に分けた なお 本実験は早稲田大学動物実験委員会の承認を得て行った ( 1 0 K ) 2. ダウンヒル走行運動負荷 ダウンヒル走行運動負荷には 小動物用運動負荷装置 K N トレッ ド ミル ( 夏目製作所, T o k y o, J a p a n ) を用いた まず運動開始から m / m i n, 傾斜 の条件で 1 5 分間ウォーミングアップを負荷した その後 速度 2 2 m / m i n, 傾斜 の条件で 分間ダウンヒル走行運動を行い 合計 分間の走行運動を負荷した 3. クルクミン投与 運動 + クルクミン投与群には運動終了直後に麻酔下にてマウス 1 匹あ たりクルクミン成分 3 m g を含む P B S 溶液を μ l 経口投与した 運動 + クルクミン非投与群には運動終了直後に麻酔下 P B S を μ l 経口投 与した なお 経口投与にはマウス用ゾンデ ( 夏目製作所, T o k y o, J a p a n ) を使用した また 安静群も同様の方法で投与した 麻酔は実験 4

7 小動物用ガス麻酔システム ( D S ファーマバイオメディカル, O s a k a, J a p a n ) を使用して イソフルランフォーレン吸入麻酔液 ( アボットジャパン, T o k y o, J a p a n ) を用いた 麻酔は 流速 0. 8 L / m i n 濃度 4. 0 % に設定した 4. 採血および筋組織採取 クルクミン投与 2 4 時間後に解剖を行った イソフルラン吸入麻酔下で 開腹し 腹部大動脈から血液をヘパリン処理された真空採血管 ( T E R U M O, T o k y o, J a p a n ) に採取した プレ麻酔時は 流速 0. 8 L / m i n 濃度 4. 0 % に設定し 維持麻酔時は 流速 0. 8 L / m i n 濃度 1. 0 % に設定した 採取した血液は 2, x G 1 0 分間の条件で遠心を行い 上清の血漿成分を分離し の冷凍庫にて保存した また 両脚から腓腹筋を摘出した 摘出した腓腹筋は R N A l a t e r ( A p p l i e d B i o s y s t e m s, C a r l s b a d, C a l i f o r n i a, U S A ) に浸して液体窒素 で凍結させた後 の冷凍庫にて保存した 5. クレアチンキナーゼ活性 血漿中のクレアチンキナーゼ活性は長浜ライフサンエンスラボラトリーに 依頼して測定した 6. r e a l - t i m e q u a n t i t a t i v e P C R 腓腹筋の T o t a l R N A は R N e a s y M i n i K i t ( Q I A G E N, V a k e n c i a, C a l i f o r n i a, U S A ) および R N a s e - F r e e D N a s e S e t ( Q I A G E N, V a k e n c i a, C a l i f o r n i a, U S A ) を用いて抽出した その後 N a n o D r o p s y s t e m ( N a n o D r o p T e c h n o l o g i e s, W i l m i n g s t o n, D e l a w a r e, U S A ) を用いて R N A 濃 度を測定した T o t a l m R N A は H i g h C a p a c i t y c D N A R e v e r s e 5

8 T r a n s c r i p t i o n k i t w i t h R N a s e i n h i b i t o r ( A p p l i e d B i o s y s t e m s, C a r l s b a d, C a l i f o r n i a, U S A ) を用いて 逆転写反応により c D N A を作製した 作製した c D N A は P o w e r S Y B R G r e e n P C R M a s t e r M i x ( A p p l i e d B i o s y s t e m s, C a r l s b a d, C a l i f o r n i a, U S A ) を用いて F a s t r e a l - t i m e P C R 装置 ( A p p l i e d B i o s y s t e m s, C a r l s b a d, C a l i f o r n i a, U S A ) により P C R を行った P C R 条件は 9 5 で 1 0 分間 c D N A を変性させた後に 1 サイクル 9 5 で 1 5 秒間 6 0 で 1 分間の条件で 4 0 サイクル繰り返した 構成的に発現する遺伝子として g l y c e r a l d e h y d e p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s e ( G A P D H ) を使用した 標的遺伝子および内因性遺伝子として使用したプライマーは T a b l e 1 に 示した 7. タンパク質濃度測定 腓腹筋は T i s s u e P r o t e i n E x t r a c t i o n R e a g e n t ( T - P E R ) w i t h P r o t e a s e i n h i b i t o r ( T h e r m o, R o c k f o r d, I l l i n o i s, U S A ) 溶液でホモジ ナイズした後 1 0, x G 1 0 分間の条件で遠心操作を行い上清のタン パク質を分離した タンパク濃度は B C A P r o t e i n A s s a y ( T h e r m o, R o c k f o r d, I l l i n o i s, U S A ) を用いて測定した 腓腹筋内の T N F - α タンパク質濃度は M o u s e T N F - α E L I S A k i t ( R & D s y s t e m s, M c k i n l e y, M i n n e s o t a, U S A ) I L - 6 タンパク質濃度は M o u s e I L - 6 E L I S A k i t ( R & D s y s t e m s, M c k i n l e y, M i n n e s o t a, U S A ) M C P - 1 タンパク質濃度は M o u s e M C P - 1 E L I S A k i t ( R & D s y s t e m s, M c k i n l e y, M i n n e s o t a, U S A ) を用いて測定した M P O タンパク質濃度は M o u s e M P O E L I S A k i t ( H y c u l t b i o t e c h, U d e n, N e t h e r l a n d ) を用いて測定した なお 吸光度の測定には V E R S A M a x m i c r o p l a t e r e a d e r 6

9 ( M o l e c u l a r D e v i c e s, C a l i f o r n i a, U S A ) を使用した 8. H 2 O 2 濃度測定腓腹筋内の H 2 O 2 濃度は S e n s o L y t e A D H P h y d r o g e n p e r o x i d e a s s a y k i t ( F r e m o u n t, C a l i f o r n i a, U S A ) を用いて測定した なお 蛍光強度の測定には F L U O s t a r O P T I M A ( B M G L A B T E C H, O f f e n b u r g, G e r m a n y ) を使用した 9. 統計処理結果は 平均値 + 標準誤差で表した 運動およびクルクミン投与を要因とした測定項目の変化については 二元配置分散分析を行い 優位水準は 5 % 未満とした P o s t h o c テストは T u r k e y s t e s t の検定を行い 優位水準は 5 % 未満とした 全ての分析は S P S S V. 1 7 を用いて行った 7

10 3 ) 結果ダウンヒル運動およびクルクミン投与による血漿中のクレアチンキナーゼ活性の変化血漿中のクレアチンキナーゼ活性はダウンヒル運動による影響がみられた [ a n e f f e c t o f d o w n h i l l e x e r c i s e : F = , P < , c u r c u m i n : F = , n. s., a n d e x e r c i s e x c u r c u m i n i n t e r a c t i o n : F = , n. s. ] また クルクミン非投与群においてクレアチンキナーゼ活性はダウンヒル運動によって増加する傾向がみられた ( P = ) しかしながら ダウンヒル運動群において クレアチンキナーゼ活性についてはクルクミン投与による有意な変化はみられなかった ( F i g. 1 ) ダウンヒル運動およびクルクミン投与による骨格筋組織の炎症性サイトカ インのタンパク質濃度の変化 筋組織中の T N F - のタンパク質濃度はダウンヒル運動およびクルクミン 投与による影響はみられなかった [ a n e f f e c t o f d o w n h i l l e x e r c i s e : F = , n. s., c u r c u m i n : F = , n. s., a n d e x e r c i s e x c u r c u m i n i n t e r a c t i o n : F = , n. s. ] 一方 クルクミン非投与群においても T N F - のタンパク質濃度はダウンヒル運動による有意な変化はみられなかった 加えて ダウンヒル運動群において T N F - のタンパク質濃度はクルクミン投与による有意な変化はみられなかった ( F i g. 2 A ) また 筋組織中の I L - 6 のタンパク質濃度はダウンヒル運動およびクルクミン投与による影響はみられなかった [ a n e f f e c t o f d o w n h i l l e x e r c i s e : F = n. s., c u r c u m i n : F = , n. s., a n d e x e r c i s e x c u r c u m i n i n t e r a c t i o n : F = , n. s. ] また クルクミン非投与群において I L - 6 のタンパク質濃度はダウンヒル運動による有意な変化はみられなかった 加え 8

11 て ダウンヒル運動群において I L - 6 のタンパク質濃度についてはクルクミ ン投与によって有意な変化はみられなかった ( F i g. 2 B ) ダウンヒル運動およびクルクミン投与による骨格筋組織の炎症性サイトカ インの遺伝子発現の変化 筋組織中の T N F - の遺伝子発現はダウンヒル運動およびクルクミン投 与による影響はみられなかった [ a n e f f e c t o f d o w n h i l l e x e r c i s e : F = , n. s., c u r c u m i n : F = , n. s., a n d e x e r c i s e x c u r c u m i n i n t e r a c t i o n : F = , n. s. ] また クルクミン非投与群において T N F - の遺伝子発現はダウンヒル運動による有意な変化はみられなかった 加えて ダウンヒル運動群において T N F - の遺伝子発現についてはクルクミン投与による有意な変化はみられなかった ( F i g. 3 A ) 一方 筋組織中の I L - 6 の遺伝子発現量はダウンヒル運動およびクルクミン投与の影響はみられなかった [ a n e f f e c t o f d o w n h i l l e x e r c i s e : F = , n. s., c u r c u m i n : F = , n. s., a n d e x e r c i s e x c u r c u m i n i n t e r a c t i o n : F = , n. s. ] また クルクミン非投与群において I L - 6 の遺伝子発現はダウンヒル運動による有意な変化はみられなかった 加えて ダウンヒル運動群において I L - 6 の遺伝子発現についてはクルクミン投与 による有意な変化はみられなかった ( F i g. 3 B ) 筋組織中の I L - 1 の遺伝子発現はダウンヒル運動およびクルクミン投 与の影響はみられなかった [ a n e f f e c t o f d o w n h i l l e x e r c i s e : F = , n. s., c u r c u m i n : F = , n. s., a n d e x e r c i s e x c u r c u m i n i n t e r a c t i o n : F = , n. s. ] また クルクミン非投与群において I L - 1 の遺伝子発現はダウンヒル運動による有意な影響はみられなかった 加えて ダウンヒル運動群において I L - 1 の遺伝子発現についてはクルクミン投与による有意 9

12 な変化はみられなかった ( F i g. 3 C ) 加えて 筋組織中の I L の遺伝子発現はダウンヒル運動およびクルクミン投与による影響はみられなかった [ a n e f f e c t o f d o w n h i l l e x e r c i s e : F = , n. s., c u r c u m i n : F = , n. s., a n d e x e r c i s e x c u r c u m i n i n t e r a c t i o n : F = , n. s. ] また クルクミン非投与群において I L の遺伝子発現はダウンヒル運動による有意な変化はみられなかった 加えて ダウンヒル運動群において I L の遺伝子発現についてはクルクミン投与による有意な変化はみられなかった ( F i g. 3 D ) ダウンヒル運動およびクルクミン投与による骨格筋組織の H 2 O 2 濃度およ び N A D P H - o x i d a s e 遺伝子発現の変化 筋組織中の H 2 O 2 濃度はダウンヒル運動およびクルクミン投与の影響は みられなかった [ a n e f f e c t o f d o w n h i l l e x e r c i s e : F = , n. s., c u r c u m i n : F = , n. s., a n d e x e r c i s e x c u r c u m i n i n t e r a c t i o n : F = , n. s. ] また クルクミン非投与群において H 2 O 2 濃度はダウンヒル 運動によって有意に増加した ( P < ) しかしながら ダウンヒル運動群 において H 2 O 2 濃度はクルクミン投与によって有意に減少した ( P < , F i g. 4 A ) 筋組織中の N A D P H - o x i d a s e の遺伝子発現量はダウンヒル運動によ る影響がみられた [ a n e f f e c t o f d o w n h i l l e x e r c i s e : F = , P < , c u r c u m i n : F = , n. s., a n d e x e r c i s e x c u r c u m i n i n t e r a c t i o n : F = , P < ] また クルクミン非投与群において N A D P H - o x i d a s e の 遺伝子発現量はダウンヒル運動によって有意に増加した ( P < ) し かしながら ダウンヒル運動群において N A D P H - o x i d a s e の遺伝子発現 量はクルクミン投与によって有意に減少した ( P < , F i g. 4 B ) 10

13 ダウンヒル運動およびクルクミン投与による骨格筋組織の M P O 濃度の変化筋組織中の M P O のタンパク質濃度はクルクミン投与による影響がみられた [ a n e f f e c t o f d o w n h i l l e x e r c i s e : F = , n. s., c u r c u m i n : F = , P < , a n d e x e r c i s e x c u r c u m i n i n t e r a c t i o n : F = , n. s. ] また クルクミン非投与群において M P O のタンパク質濃度についてはダウンヒル運動によって有意な変化はみられなかった しかしながら ダウンヒル運 動群において M P O のタンパク質濃度はクルクミン投与によって有意に増 加した ( P < , F i g. 5 ) ダウンヒル運動およびクルクミン投与による骨格筋組織の M C P - 1 タンパク質濃度および M C P - 1 の遺伝子発現の変化筋組織中の M C P - 1 のタンパク質濃度はダウンヒル運動による影響がみられた [ a n e f f e c t o f d o w n h i l l e x e r c i s e : F = , P < , c u r c u m i n : F = , n. s., a n d e x e r c i s e x c u r c u m i n i n t e r a c t i o n : F = , n. s. ] また クルクミン非投与群において M C P - 1 のタンパク質濃 度はダウンヒル運動によって有意に増加した ( P < ) しかしながら ダウンヒル運動群において M C P - 1 のタンパク質濃度についてはクルクミン投与による有意な変化はみられなかった ( F i g. 6 A ) また 筋組織中の M C P - 1 の遺伝子発現はダウンヒル運動およびクルクミン投与による影響がみられた [ a n e f f e c t o f d o w n h i l l e x e r c i s e : F = , P < , c u r c u m i n : F = , P < , a n d e x e r c i s e x c u r c u m i n i n t e r a c t i o n : F = , n. s. ] 一方 クルクミン非投与群において M C P - 1 の遺伝子発現はダウンヒル運動によって有意に増加した ( P < ) しかしながら ダウンヒル運動群において M C P - 1 の遺伝子 11

14 発現はクルクミン投与によって有意に減少した ( P < , F i g. 6 B ) さらに 筋組織中の F 4 / 8 0 の遺伝子発現はダウンヒル運動およびクルクミン投与による影響がみられた [ a n e f f e c t o f d o w n h i l l e x e r c i s e : F = , n. s., c u r c u m i n : F = , n. s., a n d e x e r c i s e x c u r c u m i n i n t e r a c t i o n : F = , n. s. ] また クルクミン非投与群において F 4 / 8 0 の 遺伝子発現はダウンヒル運動によって有意に増加した ( P < ) しかし ながら ダウンヒル運動群において F 4 / 8 0 の遺伝子発現はクルクミン投与 によって有意に減少した ( P < , F i g. 7 A ) 12

15 T a b l e 1 P r i m e r s e q u e n c e s f o r r e a l - t i m e R T - P C R a n a l y s i s gene forward reverse GAPDH TGAAGCAGGCATCTGAGGG CGAAGGTGGAAGAGTGGGAG TNF-a CCTCCCTCTCATCAGTTCTA ACTTGGTGGTTTGCTACGAC IL-6 TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC IL-1b CTGGAGAGTGTGGATCCCAAG GGAAGACACGGATTCCATGGTG IL-12 GGAGCACGGCAGCAGAATA AACTTGAGGGAGAAGTAGGAATGG NADPH oxidase TTGGGTCAGCACTGGCTCTG TGGCGGTGTGCAGTGCTATC MCP-1 CTTCTGGGCCTGCTGTTCA CCAGCCTACTCATTGGGATCA F4/80 CTTTGGCTATGGGCTTCCAGTC GCAAGGAGGACAGAGTTTATCGTG G A P D H : G l y c e r a l d e h y d e p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s e T N F t u m o r n e c r o s i s f a c t o r I L : i n t e r l e u k i n N A D P H o x i d a s e : n i c o t i n a m i d e a d e n i n e d i n u c l e o t i d e p h o s p h a t e M C P - 1 : m o n o c y t e c h e m o t a c t i c p r o t e i n

16 F i g. 1 E f f e c t s o f d o w n h i l l r u n n i n g a n d c u r c u m i n a d m i n i s t r a t i o n o n p l a s m a c r e a t i n k i n a s e a c t i v i t y. T h e v a l u e s a r e t h e m e a n s + S E M. P <

17 A B F i g. 2 E f f e c t s o f d o w n h i l l r u n n i n g a n d c u r c u m i n a d m i n i s t r a t i o n o n T N F - ( A ) a n d I L - 6 ( B ) p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n s i n g a s t r o c n e m i u s m u s c l e o f m i c e. T h e v a l u e s a r e t h e m e a n s + S E M. 15

18 A B C D F i g. 3 E f f e c t s o f d o w n h i l l r u n n i n g a n d c u r c u m i n a d m i n i s t r a t i o n o n T N F - ( A ), I L - 6 ( B ), I L - 1 ( C ), a n d I L ( D ) m R N A e x p r e s s i o n s i n g a s t r o c n e m i u s m u s c l e o f m i c e. T h e v a l u e s a r e t h e m e a n s + S E M. 16

19 A B F i g 4 E f f e c t s o f d o w n h i l l r u n n i n g a n d c u r c u m i n a d m i n i s t r a t i o n o n H 2 O 2 c o n c e n t r a t i o n ( A ) a n d N A D P H - o x i d a s e m R N A e x p r e s s i o n ( B ) i n g a s t r o c n e m i u s m u s c l e o f m i c e. T h e v a l u e s a r e t h e m e a n s + S E M. P < a n d P <

20 F i g. 5 E f f e c t s o f d o w n h i l l r u n n i n g a n d c u r c u m i n a d m i n i s t r a t i o n o n M P O p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n i n g a s t r o c n e m i u s m u s c l e o f m i c e. T h e v a l u e s a r e t h e m e a n s + S E M. P <

21 A B F i g. 6 E f f e c t s o f d o w n h i l l r u n n i n g a n d c u r c u m i n a d m i n i s t r a t i o n o n M C P - 1 p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n ( A ) a n d m R N A e x p r e s s i o n ( B ) i n g a s t r o c n e m i u s m u s c l e o f m i c e. T h e v a l u e s a r e t h e m e a n s + S E M. P <

22 F i g. 7 E f f e c t s o f d o w n h i l l r u n n i n g a n d c u r c u m i n a d m i n i s t r a t i o n o n F 4 / 8 0 m R N A e x p r e s s i o n i n g a s t r o c n e m i u s m u s c l e o f m i c e. T h e v a l u e s a r e t h e m e a n s + S E M. P < a n d P <

23 4 ) 考察本研究の結果より ダウンヒル運動によって血漿クレアチンキナーゼ活性が上昇し 筋損傷を誘導できたことが確認できた しかしながら クルクミン投与によるダウンヒル運動後の血漿クレアチンキナーゼ活性は 少なくとも 1 日目では変化しなかった また ダウンヒル運動後のマウス腓腹筋の T N F - α I L - 6 I L - 1 β I L の遺伝子発現量 T N F - α I L - 6 のタンパク質濃度は 変化しないことが明らかになった しかしながら 筋組織での H 2 O 2 e 濃度および N A D P H - o x i d a s e 遺伝子発現はダウンヒル運動により増加し クルクミン投与により減少することが明らかになった また マクロファージの浸潤を特異的に誘導する M C P - 1 遺伝子発現およびマクロファージの浸潤を示す F 4 / 8 0 遺伝子発現がダウンヒル運動により増加し クルクミン投与により減少することも明らかになった 一方で 好中球の浸潤を示すマーカーである M P O 濃度はダウンヒル運動の影響を受けないことが示唆された 白血球は活性酸素を産生することが知られていることからも クルクミン投与によるダウンヒル運動後の H 2 O 2 濃度および N A D P H - o x i d a s e 遺伝子発現抑制は マクロファージの浸潤抑制が関与している可能性が考えられる 今回の実験では運動直後にクルクミンを投与し 1 日目にクレアチンキナーゼ活性を検討したため 効果が生じるのに作用時間が不十分であった可能性も考えられ 運動負荷前にクルクミンを投与した場合の筋損傷予防効果について今後検討する必要がある これまでに 激しい運動後のサイトカインの変動については 数多く報告がされている ヒトや実験動物を対象にした研究において マラソンレースやダウンヒル運動後に炎症性サイトカインの遺伝子発現が増加することが報告されている [ 7, 9, 2 8, 2 9 ] 一方で ダウンヒル運動後に T N F - α I L - 1 β I L の遺伝子発現が変化しなかったことも報告されている [ 3 0 ] 21

24 本研究では ダウンヒル運動 2 4 時間後においてマウス骨格筋の炎症性サイトカインの遺伝子発現は変化しなかった ダウンヒル運動後の炎症性サイトカインの変動は 動物の種類 運動条件 運動後の時間経過によって結果に差異が生じる可能性が考えられる 活性酸素は 運動後に筋組織で増加することが知られている 筋損傷をともなう運動では 浸潤した免疫細胞による N A D P H - o x i d a s e の活性によりスーパーオキシドが産生され さらに H 2 O 2 が生成される [ 2 1 ] ラットを 用いた研究では 分のダウンヒル運動 2 4 時間後に骨格筋組織での H 2 O 2 濃度が増加したことが報告されている [ 7 ] 本研究では ダウンヒル運動 2 4 時間後にマウスの腓腹筋において H 2 O 2 濃度および N A D P H - o x i d a s e の遺伝子発現が増加した 一方で クルクミン投与によってダウンヒル運動後の H 2 O 2 濃度および N A D P H - o x i d a s e 遺伝子発現は有意に抑制された 本研究の結果から クルクミン投与によりダウンヒル運動後の酸化ストレス状態が軽減する可能性が示唆された T N F - α は i n v i t r o において N A D P H - o x i d a s e 産生を促進することが明らかにされて いる [ 1 7, 3 1 ] クルクミンは N F - B の活性を抑制することからも クルクミン の示す抗炎症作用として T N F - α などの炎症性サイトカインの発現抑制 が関与すると考えられる しかしながら 本研究では炎症性サイトカインがダウンヒル運動により有意に増加しなかった したがって 好中球およびマクロファージ由来の活性酸素を 細胞浸潤の抑制を介して制御したものと考えられる M P O る M P O は 好中球が活性化すると 食胞内あるいは細胞外に放出され のタンパク質濃度は 激しい運動による好中球の脱顆粒に伴い 増加することが知られている [ 3 2, 3 3 ] 本研究では ダウンヒル運動 2 4 時 間後のマウス骨格筋の M P O 濃度は変化しないことが明らかになった 好 22

25 中球は損傷後 1 時間以内に組織に浸潤し始めることが知られている 実 際に 筋損傷を伴う運動後の M P O 濃度を検討した研究は 多くが運動 直後および 1 時間後に上昇したことを示している 本研究で測定したダウ ンヒル運動 2 4 時間後には 好中球の次に浸潤するマクロファージによって 貪食された可能性が考えられる これについては 運動直後から数時間 後の M P O の変動や組織学的検討を行い明らかにする必要がある また クルクミン投与によりダウンヒル運動 2 4 時間後の M P O の濃度が増加した が その要因としてマクロファージとの関連が考えられる マクロファージは好中球を貪食することが知られている したがって クルクミン投与によりマクロファージの浸潤が抑制されたため 貪食されずに組織に残る好中球が増加した可能性が考えられる マクロファージは 筋損傷を伴う運動後 1 日以内に 損傷組織に浸潤 することが知られている [ 5 ] 組織へのマクロファージの浸潤は N F - B シグナル伝達経路を介した M C P - 1 などのケモカインの産生により誘導される [ 1 3, 1 4 ] また 浸潤したマクロファージは T N F - α I L - 1 β などのサイトカインを産生することが知られている [ 3 4 ] ダウンヒル運動を用いた研究では 9 0 分間の走行運動 2 4 時間後および 4 8 時間後において マウス腓腹筋 のマクロファージの浸潤が増加することが報告されている [ 3 5 ] 本研究よ り ダウンヒル運動 2 4 時間後にマクロファージが筋組織に浸潤する可能 性が示唆された 一方で クルクミンはダウンヒル運動後のマクロファージの 浸潤を抑制する可能性が示唆された これまでに 糖尿病ラットを用いた 研究で M C P - 1 の血中濃度がクルクミン投与により抑制されることが報告 されている [ 3 6 ] 本研究においても クルクミンは F 4 / 8 0 発現同様に 筋 組織の M C P - 1 発現を減少させることが示された したがって クルクミンに よるマクロファージ浸潤の抑制には骨格筋の M C P - 1 産生の抑制が関与 23

26 する可能性が示唆された 浸潤した好中球やマクロファージは活性酸素を産生することが知られている [ 3 7 ] N A D P H - o x i d a s e は好中球やマクロファージの形質膜に存在し 好中球やマクロファージが貪食を行った際に活性化される 本研究においてマクロファージが筋組織に浸潤する可能性が示唆された したがって ダウンヒル運動による N A D P H - o x i d a s e の遺伝子発現の増加は マクロファージの浸潤による可能性が示唆される また クルクミンは F 4 / 8 0 発現同様に ダウンヒル運動後の H 2 O 2 濃度および N A D P H - o x i d a s e 遺伝子発現を減少させた したがって クルクミン投与 によるダウンヒル運動後の H 2 O 2 濃度および N A D P H - o x i d a s e 遺伝子発 現の減少は マクロファージの浸潤抑制が関与している可能性が考えられ る 5 ) 結論クルクミン投 与 はダウンヒル運 動 後 の H 2 O 2 濃 度 および N A D P H - o x i d a s e 遺伝子発現を抑制した また クルクミン投与はダウンヒ ル運動後の M C P - 1 および F 4 / 8 0 遺伝子発現を抑制した したがって ク ルクミン投与はマクロファージの浸潤抑制を介して 活性酸素産生を抑 制する可能性が示唆された 24

27 6 ) 謝辞本稿の作成にあたり 御懇篤な御指導ならびに激励を賜りました本研究科の鈴木克彦准教授に深甚なる謝意を表します 本研究科入学当初から本稿提出に至るまで 免疫学を学んで間もない浅学非才な私に 多くの助言や暖かい御指導をしていただきました ここに心から御礼申し上げます また 副査として御指導いただきました坂本静男先生 福林徹先生にも厚く御礼申し上げます 実験計画 実験手法 論文作成に至るまで懇切丁寧に御指導して頂きました予防医学研究室博士課程の川西範明氏に心より御礼申し上げます また 本稿作成や大学院生活を様々な面から支えて下さった予防医学研究室の皆様に深く感謝致します セラバリューズ株式会社の大塚喜彦様には クルクミンの提供から研究における助言など様々な面で御協力して頂きましたこと厚く御礼申し上げます 最後に 本稿作成のための大学院生活を物心両面から支えてくださった両親に心より感謝致します 25

28 7 ) 参考文献 1 ) N o s a k a K, N e w t o n M. C o n c e n t r i c o r e c c e n t r i c t r a i n i n g e f f e c t o n e c c e n t r i c e x e r c i s e - i n d u c e d m u s c l e d a m a g e. M e d S c i S p o r t s E x e r c. 3 4 ( 1 ) : ) P e a k e J, N o s a k a K, S u z u k i K. C h a r a c t e r i z a t i o n o f i n f l a m m a t o r y r e s p o n s e s t o e c c e n t r i c e x e r c i s e i n h u m a n s. E x e r c I m m u n o l R e v. 1 1 : ) T h o m p s o n D, B a i l e y D M, H i l l J, H u r s t T, P o w e l l J R, W i l l i a m s C. P r o l o n g e d v i t a m i n C s u p p l e m e n t a t i o n a n d r e c o v e r y f r o m e c - c e n t r i c e x e r c i s e. E u r J A p p l P h y s i o l. J u n ; 9 2 ( 1-2 ) : ) P e a k e J M. E x e r c i s e - i n d u c e d a l t e r a t i o n s i n n e u t r o p h i l d e g r a - n u l a t i o n a n d r e s p i r a t o r y b u r s t a c t i v i t y : p o s s i b l e m e c h a n i s m s o f a c t i o n. E x e r c I m m u n o l R e v. 8 : ) T i d b a l l J G, W e h l i n g - H e n r i c k s M. M a c r o p h a g e s p r o m o t e m u s c l e m e m b r a n e r e p a i r a n d m u s c l e f i b r e g r o w t h a n d r e g e n e r a t i o n d u r i n g m o d i f i e d m u s c l e l o a d i n g i n m i c e i n v i v o. J P h y s i o l ( P t 1 ) : ) P e l o s i L, G i a c i n t i C, N a r d i s C, B o r s e l l i n o G, R i z z u t o E, N i - c o l e t t i C, W a n n e n e s F, B a t t i s t i n i L, R o s e n t h a l N, M o l i n a r o M, M u s a r ò A. L o c a l e x p r e s s i o n o f I G F - 1 a c c e l e r a t e s m u s c l e r e - g e n e r a t i o n b y r a p i d l y m o d u l a t i n g i n f l a m m a t o r y c y t o k i n e s a n d c h e m o k i n e s. FA S E B J. 2 1 ( 7 ) : ) L i a o P, Z h o u J, J i L L, Z h a n g Y. E c c e n t r i c c o n t r a c t i o n i n d u c e s i n f l a m m a t o r y r e s p o n s e s i n r a t s k e l e t a l m u s c l e : r o l e o f t u m o r n e c r o s i s f a c t o r - a l p h a. A m J P h y s i o l R e g u l I n t e g r C o m p P h y s i o l ( 3 ) : R ) D a v i s J M, M u r p h y E A, C a r m i c h a e l M D, Z i e l i n s k i M R, G r o s c h w i t z C M, B r o w n A S, G a n g e m i J D, G h a f f a r A, M a y e r E P. 26

29 C u r c u m i n e f f e c t s o n i n f l a m m a t i o n a n d p e r f o r m a n c e r e c o v e r y f o l l o w i n g e c c e n t r i c e x e r c i s e - i n d u c e d m u s c l e d a m a g e. A m J P h y s i o l R e g u l I n t e g r C o m p P h y s i o l ( 6 ) : R ) F i e l d i n g R A, M a n f r e d i T J, D i n g W, F i a t a r o n e M A, E v a n s W J, C a n n o n J G. A c u t e p h a s e r e s p o n s e i n e x e r c i s e. I I I. N e u t r o p h i l a n d I L - 1 a c c u m u l a t i o n i n s k e l e t a l m u s c l e. A m J P h y s i o l R e g u l I n t e g r C o m p P h y s i o l : R ) S h e p h a r d R J. A d h e s i o n m o l e c u l e s, c a t e c h o l a m i n e s a n d l e u c o - c y t e r e d i s t r i b u t i o n d u r i n g a n d f o l l o w i n g e x e r c i s e. S p o r t s M e d 3 3 ( 4 ) : ) B e l c a s t r o A N, A r t h u r G D, A l b i s s e r T A, R a j D A. H e a r t, l i v e r, a n d s k e l e t a l m u s c l e m y e l o p e r o x i d a s e a c t i v i t y d u r i n g e x e r c i s e. J A p p l P h y s i o l. 8 0 : ) L o w e D A, W a r r e n G L, I n g a l l s C P, B o o r s t e i n D B, A r m s t r o n g R B. M u s c l e f u n c t i o n a n d p r o t e i n m e t a b o l i s m a f t e r i n i t i a t i o n o f e c c e n t r i c c o n t r a c t i o n - i n d u c e d i n j u r y. J A p p l P h y s i o l. 7 9 ( 4 ) : ) W a r r e n G L, H u l d e r m a n T, M i s h r a D, G a o X, M i l l e c c h i a L, O ' F a r r e l l L, K u z i e l WA, S i m e o n o v a P P. C h e m o k i n e r e c e p t o r C C R 2 i n v o l v e m e n t i n s k e l e t a l m u s c l e r e g e n e r a t i o n. FA S E B J. 1 9 ( 3 ) : ) S h i n W S, S z u b a A, R o c k s o n S G. T h e r o l e o f c h e m o k i n e s i n h u m a n c a r d i o v a s c u l a r p a t h o l o g y : e n h a n c e d b i o l o g i c a l i n s i g h t s. A t h e r o s c l e r o s i s ( 1 ) : ) S e g a w a M, F u k a d a S, Ya m a m o t o Y, Ya h a g i H, K a n e m a t s u M, S a t o M, I t o T, U e z u m i A, H a y a s h i S, M i y a g o e - S u z u k i Y, T a k e d a S, T s u j i k a w a K, Ya m a m o t o H. S u p p r e s s i o n o f m a c r o p h a g e f u n c t i o n s i m p a i r s s k e l e t a l m u s c l e r e g e n e r a t i o n w i t h s e v e r e f i b r o s i s. E x p C e l l R e s ( 1 7 ) :

30 1 6 ) B e d a r d K, K r a u s e K H. T h e N O X f a m i l y o f R O S - g e n e r a t i n g N A D P H o x i d a s e s : p h y s i o l o g y a n d p a t h o p h y s i o l o g y. P h y s i o l R e v. 8 7 ( 1 ) : ) L i J M, F a n L M, C h r i s t i e M R, S h a h A M. A c u t e t u m o r n e c r o s i s f a c t o r a l p h a s i g n a l i n g v i a N A D P H o x i d a s e i n m i c r o v a s c u l a r e n d o t h e l i a l c e l l s : r o l e o f p 4 7 p h o x p h o s p h o r y l a t i o n a n d b i n d i n g t o T R A F 4. M o l C e l l B i o l. 2 5 ( 6 ) : ) D r ö g e W. F r e e r a d i c a l s i n t h e p h y s i o l o g i c a l c o n t r o l o f c e l l f u n c t i o n. P h y s i o l R e v. 8 2 ( 1 ) : ) P a h l H L. A c t i v a t o r s a n d t a r g e t g e n e s o f R e l / N F - k a p p a B t r a n - s c r i p t i o n f a c t o r s. O n c o g e n e. 1 8 ( 4 9 ) : ) A l e s s i o H M. E x e r c i s e - i n d u c e d o x i d a t i v e s t r e s s. M e d S c i S p o r t s E x e r c. 2 5 ( 2 ) : ) P o w e r s S K, J a c k s o n M J. E x e r c i s e - i n d u c e d o x i d a t i v e s t r e s s : c e l l u l a r m e c h a n i s m s a n d i m p a c t o n m u s c l e f o r c e p r o d u c t i o n. P h y s i o l R e v 8 8 : ; ) S i k o r a E, S c a p a g n i n i G, B a r b a g a l l o M. C u r c u m i n, i n f l a m m a t i o n, a g e i n g a n d a g e - r e l a t e d d i s e a s e s. I m m u n A g e i n g. J a n 1 7 ; 7 ( 1 ) : ) M e n o n V P, S u d h e e r A R. A n t i o x i d a n t a n d a n t i - i n f l a m m a t o r y p r o p e r t i e s o f c u r c u m i n. A d v E x p M e d B i o l : R e v i e w ) S i n g h S, A g g a r w a l B B. A c t i v a t i o n o f t r a n s c r i p t i o n f a c t o r N F - k a p p a B i s s u p p r e s s e d b y c u r c u m i n ( d i f e r u l o y l m e t h a n e ) [ c o r r e c t e d ]. J B i o l C h e m : , ) H a n S S, K e u m Y S, S e o H J, S u r h Y J. C u r c u m i n s u p p r e s s e s a c - t i v a t i o n o f N F - k a p p a B a n d A P - 1 i n d u c e d b y p h o r b o l e s t e r i n c u l t u r e d h u m a n p r o m y e l o c y t i c l e u k e m i a c e l l s. J B i o c h e m M o l B i o l 3 5 : ,

31 2 6 ) B i s w a s S K, M c C l u r e D, J i m e n e z L A, M e g s o n I L, R a h m a n I. C u r c u m i n i n d u c e s g l u t a t h i o n e b i o s y n t h e s i s a n d i n h i b i t s N F - k a p p a B a c t i v a t i o n a n d i n t e r l e u k i n - 8 r e l e a s e i n a l v e o l a r e p i t h e l i a l c e l l s : m e c h a n i s m o f f r e e r a d i c a l s c a v e n g i n g a c t i v i t y. A n t i o x i d R e d o x S i g n a l. 7 ( 1-2 ) : : , ) L i m J H, K w o n T K. C u r c u m i n i n h i b i t s p h o r b o l m y r i s t a t e a c e t a t e ( P M A ) - i n d u c e d M C P - 1 e x p r e s s i o n b y i n h i b i t i n g E R K a n d N F - k a p p a B t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v i t y. F o o d C h e m T o x i c o l. 4 8 ( 1 ) : ) P e a k e J M, S u z u k i K, H o r d e r n M, W i l s o n G, N o s a k a K, C o o m b e s J S. P l a s m a c y t o k i n e c h a n g e s i n r e l a t i o n t o e x e r c i s e i n t e n s i t y a n d m u s c l e d a m a g e. E u r J A p p l P h y s i o l. 9 5 ( 5-6 ) : ) H a m a d a K, Va n n i e r E, S a c h e c k J M, W i t s e l l A L, R o u b e n o f f R. S e n e s c e n c e o f h u m a n s k e l e t a l m u s c l e i m p a i r s t h e l o c a l i n - f l a m m a t o r y c y t o k i n e r e s p o n s e t o a c u t e e c c e n t r i c e x e r c i s e. FA S E B J. 1 9 ( 2 ) : ) B u f o r d T W, C o o k e M B, S h e l m a d i n e B D, H u d s o n G M, R e d d L, W i l l o u g h b y D S. E f f e c t s o f e c c e n t r i c t r e a d m i l l e x e r c i s e o n i n - f l a m m a t o r y g e n e e x p r e s s i o n i n h u m a n s k e l e t a l m u s c l e. A p p l P h y s i o l N u t r M e t a b. 3 4 ( 4 ) : ) F r e y R S, R a h m a n A, K e f e r J C, M i n s h a l l R D, M a l i k A B. P K C z e t a r e g u l a t e s T N F - a l p h a - i n d u c e d a c t i v a t i o n o f N A D P H o x i d a s e i n e n d o t h e l i a l c e l l s. C i r c R e s. 1 7 ; 9 0 ( 9 ) : ) K o k o t K, S c h a e f e r R M, T e s c h n e r M, G i l g e U, P l a s s R, H e i d l a n d A. A c t i v a t i o n o f l e u k o c y t e s d u r i n g p r o l o n g e d p h y s i c a l e x e r c i s e. A d v E x p M e d B i o l : ) M o r o z o v V I, T s y p l e n k o v P V, G o l b e r g N D, K a l i n s k i M I. T h e e f f e c t s o f h i g h - i n t e n s i t y e x e r c i s e o n s k e l e t a l m u s c l e n e u t r o p h i l m y e l o p e r o x i d a s e i n u n t r a i n e d a n d t r a i n e d r a t s. E u r J A p p l 29

32 P h y s i o l. 9 7 ( 6 ) : ) T i d b a l l J G. I n t e r a c t i o n s b e t w e e n m u s c l e a n d t h e i m m u n e s y s t e m d u r i n g m o d i f i e d m u s c u l o s k e l e t a l l o a d i n g. C l i n O r t h o p R e l a t R e s. ( S u p p l ) : S ) T s i v i t s e S K, M c L o u g h l i n T J, P e t e r s o n J M, M y l o n a E, M c G r e g o r S J, P i z z a F X. D o w n h i l l r u n n i n g i n r a t s : i n f l u e n c e o n n e u t r o - p h i l s, m a c r o p h a g e s, a n d M y o D + c e l l s i n s k e l e t a l m u s c l e. E u r J A p p l P h y s i o l. 9 0 ( 5-6 ) : ) J a i n S K, R a i n s J, C r o a d J, L a r s o n B, J o n e s K. C u r c u m i n s u p - p l e m e n t a t i o n l o w e r s T N F - a l p h a, I L - 6, I L - 8, a n d M C P - 1 s e c r e - t i o n i n h i g h g l u c o s e - t r e a t e d c u l t u r e d m o n o c y t e s a n d b l o o d l e v e l s o f T N F - a l p h a, I L - 6, M C P - 1, g l u c o s e, a n d g l y c o s y l a t e d h e m o g l o b i n i n d i a b e t i c r a t s. A n t i o x i d R e d o x S i g n a l. 1 1 ( 2 ) : ) F o r m a n H J, T o r r e s M. R e a c t i v e o x y g e n s p e c i e s a n d c e l l s i g - n a l i n g : r e s p i r a t o r y b u r s t i n m a c r o p h a g e s i g n a l i n g. A m J R e s p i r C r i t C a r e M e d ( 1 2 P t 2 ) : S

33 8 ) おわりに 今後の展望 - 本研究では クルクミンの及ぼす影響を炎症性サイトカイン 酸化ストレス 免疫細胞浸潤の観点から検討した しかしながら クルクミン投与によるダウンヒル運動後の筋組織の分解および再生機構への影響 さらにはパフォーマンスへの影響に関しての検討は行っていない 近年 クルクミンは筋委縮や加齢性筋肉減弱症 ( サルコペニア ) の発 症を抑制することが示唆された ( A l m d a r i N e t a l ) 筋委縮および サルコペニアの発症には T N F - α を示す可能性が示唆されている などの炎症性サイトカインが重要な役割 ( G o o d m a n M N e t a l ) T N F - α は 筋のタンパク質分解に関与していることが知られており T N F - α 抗体の投 与により筋委縮を抑制したこと ( C o s t e l l i P e t a l ) からも T N F - α が 筋のタンパク質分解を促進することが考えられる 実際に T N F - α は 筋 タンパク質分解作用を有しているユビキチン プロテアソーム経路の活性に関与していることが明らかになった ( L i Y P e t a l ) ユビキチン プロテアソーム系路は 筋損傷を伴う激しい運動後においても筋タンパク質分解を引き起こすため 筋修復を遅延する要因とされる ( L i Y P e t a l ) したがって クルクミンは激しい運動後の筋タンパク質の分解にも N F - B の抑制を介して関与している可能性が考えられる 今後は T N F - α などの炎症性サイトカインが増加するダウンヒル運動モデルを用い て クルクミン摂取による運動後の筋修復への関与を検討する必要がある また これまでに活性酸素と運動パフォーマンスの関係は数多くの研究により検討されている ( P o w e r s S K e t a l ) 適度な筋肉中の活性酸素は運動パフォーマンスを向上させるが 激運動時の活性酸素の過 剰な増加はパフォーマンス低下をもたらすことが知られている ( R e i d M B e t 31

34 a l ) 実際に 筋組織での過剰な H 2 O 2 により 筋収縮能力が低下 することや ( O b a T e t a l ) 活性酸素は運動誘発性の筋疲労に関 与することも報告されている ( G a n d e v i a S C e t a l ) したがって 抗 酸化作用を示す薬物およびサプリメントの摂取により 激運動時の運動パ フォーマンスが改善する可能性が考えられる これまでに 抗酸化作用を 示す N - a c e t y l c y s t e i n e ビタミン C およびビタミン E などの薬物 サプリメ ント投与による活性酸素産生抑制を介したパフォーマンスへの影響が検討されてきた しかしながら 実際には スポーツ選手へのサプリメント補給による活性酸素産生の影響は明確にされていない 6 週間のビタミン E の投与は ウルトラマラソンのランナーでは筋損傷への影響が無いことが示され ( M a s t a l o u d i s A e t a l ) 生体に害を及ぼすとされる脂質膜の過酸化にも影響しないことが報告されている ( L e e u w e n g u r g h C e t a l ) また ビタミン C 投与による激運動後の筋損傷の抑制についても数多く検討されているが ( P e a k J M e t a l ) 明確な効果はみられず m g 以上の投与では逆にその回復を阻害するという結果が報告されている ( C l o s e G L e t a l ) 近年 D a v i s J M らにより クルクミン投与がマウスのダウンヒル運動のパ フォーマンスを向上させることが報告された ( D a v i s J M e t a l ) その 要因として 本研究で得られた クルクミンのダウンヒル運動後の抗酸化作用が関与している可能性が考えられる クルクミン投与によるダウンヒル運動後の筋組織の酸化ストレス状態とパフォーマンスとの関係について 更なる検討が必要である 32