プロトコル細胞増殖 / 毒性酸化ストレス分子生物学細胞内蛍光プローブ細胞染色ミトコンドリア関連試薬細菌研究用試薬膜タンパク質可溶化剤ラベル化剤二価性試薬イオン電極その他機能性有機材料酵素 (POD,ALP) を標識したい利用製品 < 少量抗体 (10μg) 標識用 > Ab-10 Rap

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あつのめいこ
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増殖 / 毒性酸化ストレス分子生物学内蛍光プローブ染色ミトコンドリア関連試薬細菌研究用試薬膜タンパク質可溶化剤ラベル化剤二価性試薬イオン電極機能性有機材料酵素 (PD,ALP) を標識したい利用製品 < 少量抗体 (0μg) 標識用 > Ab-0 Rapid Peroxidase Labeling Kit < 抗体タンパク質 (0-00μg) 標識用 > Peroxidase

1 増殖 / 毒性酸化ストレス分子生物学内蛍光プローブ染色ミトコンドリア関連試薬細菌研究用試薬膜タンパク質可溶化剤ラベル化剤二価性試薬イオン電極機能性有機材料酵素 (PD,ALP) を標識したい利用製品 < 少量抗体 (0μg) 標識用 > Ab-0 Rapid Peroxidase Labeling Kit < 抗体タンパク質 (0-00μg) 標識用 > Peroxidase Labeling Kit-NH Peroxidase Labeling Kit-SH Alkaline Phosphatase Labeling Kit - NH Alkaline Phosphatase Labeling Kit - SH I はじめに [LK] [LK] [LK09] [LK] [LK] Peroxidase (PD) および alkaline phosphatase (ALP) は基質特異性が高くかつ分光法蛍光法発光法用の検出試薬も豊富に揃っていることから酵素免疫測定 ( E I A ) で汎用されている一般には P D または A L P を標的分子 ( 抗原抗体等 ) に標識しその標識体を用いて抗原 - 抗体反応を行う標識体は標的分子のアミノ基または S H 基に P D または ALP を反応させることで安定な共有結合体として得られる Peroxidase Labeling Kits および Alkaline Phosphatase Labeling kit は P D または A L P を標的分子のアミノ基または S H 基に標識するためのキットである P D および A L P はあらかじめスクシンイミジルエステル基やマレイミド基で活性化されているため標的分子と混合するだけで標識体を得ることができる小社ではサンプルの種類や量に応じて試薬を混ぜるだけで 0 分以内に標識体を得ることのできる Ab-0 Rapid Peroxidase Labeling Kit 及び前処理 - 反応までを一つのフィルトレーションチューブ上で行い時間以内に目的の標識体を得ることができる Peroxidase Labeling Kit - NH /SH Alkaline Phosphatase Labeling Kit NH /SHを製品化しているこれらのキットを使用した酵素標識体の作製法について紹介する a)nh 標識 * b)sh 標識解析装置 II Ab-0 Rapid Peroxidase Labeling Kit によるアミノ基への Peroxidase 標識 (Code: LK). キット内容 Reactive Peroxidase Stop Solution. キット以外に必要なもの 0 μl,00 μl マイクロピペッタ- マイクロチューブ( サンプル及び Working buffer 調製用 ) インキュベーター (7 ). 操作 ) 抗体量が 0 μg に相当する量の 0. ~ mg/ml に調製した抗体溶液をマイクロチューブに入れる ) 操作の抗体溶液に Reaction Buffer を加えピペッティングにより混合する ) 操作の溶液を Reactive Peroxidase に加えピペッティングにより混合する ) 7 で 0 分間反応する ) 操作の溶液に Stop Solution を加えピペッティングにより混合する ) 室温で 0 分間反応する 7) 操作の標識抗体を実験に用いるまたは冷蔵で保存する抗体溶液に含まれる添加剤はその濃度が高い場合に標識反応を妨害することがあります詳細は取扱い説明書参照 Antibody + Reaction Buffer Stop Solution 標識抗体を実験に使用 NH -Reactive reagent Reducing Agent 0 分 0 分 C N H C N C N H N SH reactive reagent 図 Labeling Kits による酵素標識 lgg の作製法 (* ヒンジ部分以外の SS が還元される場合もある ) HS HS N N S N HS 図酵素標識の操作. Peroxidase 標識抗体での検出例 < ミトコンドリアの免疫染色 > ) μ- スライド 8 ウェル (ibidi 社製 ) に HeLa を播種し 7 %C インキュベーター内で一晩培養した ) 培地を取り除き PBS で回洗浄後 % パラホルムアルデヒド / PBS 溶液を添加した ) 室温で時間静置した ) 上清を取り除き % Triton-X / PBS 溶液を添加した ) 室温で 0 分間静置した ) 上清を取り除き PBS で回洗浄後 PBS で調製したブロッキング溶液を添加した 7) 冷蔵で時間静置した 8) ペルオキシダーゼ標識 - 抗ミトコンドリア抗体をブロッキング溶液で 0 倍希釈した抗ミトコンドリア抗体 ( 商品コード : ab98) は abcam 社から購入

9) 上清を取り除き 8) の溶液を添加した 0) 冷蔵で一晩静置した ) 上清を取り除き 0 mmol/l トリス緩衝液 (ph 7.) で回洗浄した ) 上清を取り除き 0. mg/ml DAB(Code:D00) 0.00% H 0 mmol/l トリス緩衝液 (ph 7.) を添加した ) 室温で 0 分間静置した ) 上清を取り除き 0 mmol/l トリス緩衝液 (ph 7.

2 9) 上清を取り除き 8) の溶液を添加した 0) 冷蔵で一晩静置した ) 上清を取り除き 0 mmol/l トリス緩衝液 (ph 7.) で回洗浄した ) 上清を取り除き 0. mg/ml DAB(Code:D00) 0.00% H 0 mmol/l トリス緩衝液 (ph 7.) を添加した ) 室温で 0 分間静置した ) 上清を取り除き 0 mmol/l トリス緩衝液 (ph 7.) で回洗浄した後 0 mmol/l トリス緩衝液 (ph 7.) を添加した ) 染色を顕微鏡で観察した図 HeLa のミトコンドリアの免疫染色画像 FAQ Q : 抗体溶液中に含まれる添加剤は標識反応に影響しますか? A : 抗体溶液中の添加剤によっては影響を受ける場合がございますのでご使用前に必ず取り扱い説明書中の注意事項をご確認ください Q : 使用可能な抗体のクラスにはどのようなものがありますか? A : 本製品は IgG 抗体へ標識するよう最適化しています IgG 以外のクラス (IgM や IgA 等 ) では標識実績はございません最新の測定データやアプリケーション論文情報を小社 HP にて掲載ご興味のある方は小社 HP にて最新情報をご確認下さい Ab-0 同仁検索. 使用上の注意本キットは分子量 0,000 以上および,000 以下のタンパク質を対象としています標識するタンパク質溶液に分子量 0,000 以上の物質が含まれる場合はあらかじめ精製を行なって下さい ( 抗体を精製したいを参照 ) またタンパク質溶液に不溶性の低分子物質が含まれる場合は遠心して上清のみを標識反応に用いてください一回の標識操作に必要なタンパク質量は 0 00 μg です冷蔵保存中もしくは室温に戻した際にフィルトレーションチューブに水滴様の液粒が見られることがありますこれはメンブレンの乾燥防止剤が液粒化したもので製品の性能に問題はありません IgG 0 00 μg を含むサンプル溶液 a) と Washing Buffer 00 μl を Filtration Tube に入れる 8,000 x g で 0 分間遠心する b) Washing Buffer 00 μl を加えもう一度遠心する Reaction Buffer 0 μl を NH - Reactive Peroxidase に加え溶解させる c) NH -Reactive Peroxidase を含む溶液を IgG が濃縮されている Filtration Tube のメンブレン上に添加するピペッティングによりメンブレン上の IgG と混合させた後 7 で時間反応する増殖 / 毒性酸化ストレス分子生物学内蛍光プローブ染色ミトコンドリア関連試薬細菌研究用試薬膜タンパク質可溶化剤ラベル化剤二価性試薬イオン電極機能性有機材料 III Peroxidase Labeling Kit - NH によるアミノ基への PD 標識 (Code: LK). キット内容 NH -Reactive Peroxidase Washing Buffer. キット以外に必要なもの 0 μl 00 μl マイクロピペッタ- インキュベーター (7 ). 保存条件 0 で保存すること NH -Reactive Peroxidase は窒素封入されているので外装袋を一旦開封後は再度窒素封入し -0 で保存する 7 8 Washing Buffer 00 μl を Filtration Tube に加える 8,000 x g で 0 分間遠心する b) Storage Buffer 00 μl を加え d) ピペッティングにより標識体を溶解させる溶液をマイクロチューブに移し 0 で保存する e)

3 増殖 / 毒性酸化ストレス分子生物学内蛍光プローブ染色ミトコンドリア関連試薬細菌研究用試薬膜タンパク質可溶化剤ラベル化剤二価性試薬イオン電極機能性有機材料 a) 00 μl 以下の液量で使用する IgG 濃度が 0. mg/ml 以下である場合には操作と操作を繰り返し IgG 量が 0 00 μg となるように調整する溶液に他のタンパク質やアミノ基を有する化合物が混在する場合は精製により除去していただきたい分間遠心する c) NH -Reactive Peroxidase は Reaction Buffer 中では不安定である溶解後は直ちに操作に進む d) 分子の PD が IgG 分子に標識される通常未反応の PD は EIA に影響を及ぼさない必要に応じてゲルろ過カラムあるいはアフィニティーカラム等により精製すること e) 長期保存する場合は同量のグリセロールを添加し 0 で保存する ) アミノ基を有する低分子化合物 ( 分子量 <,000) への標識 Reaction Buffer で調製した mmol/l サンプル溶液 0 μl を a) NH - Reactive Peroxidase に加えるピペッティングにより NH -Reactive Peroxidase を溶解した後 7 で時間反応する Washing Buffer 00 μl を反応溶液に加えマイクロピペットで Filtration Tube に移す 8,000 x g で 0 分間遠心する b) ろ液を捨てた後 Washing Buffer 00 μl を加え遠心する b) この操作をもう一度繰り返す Storage Buffer 00 μl を加え c) ピペッティングにより標識体を溶解させる溶液をマイクロチューブに移し 0 で保存する a) サンプルが Reaction Buffer に難溶の場合は水と混合する溶媒 (DMS DMF アルコール等 ) で 0 mmol/l サンプル溶液を調製しこの溶液 μl と Reaction Buffer μl を混合し mmol/l サンプル溶液とする被標識化合物以外にアミノ基を有する物質が含まれる場合は精製により除去していただきたい分間遠心する c) PD 分子に分子の低分子化合物が標識される μg 00 ng 0 ng ng 0. ng a) IV Peroxidase Labeling Kit - SH による SH 基への PD 標識 (Code: LK09). キット内容 SH-Reactive Peroxidase Reducing Agent Solution A Solution B. キット以外に必要なもの 0 μl 00 μl マイクロピペッタ- インキュベーター (7 ). 保存条件 0 で保存する SH-Reactive Peroxidase は外装袋を一旦開封後は 0 で保存する. 使用上の注意本キットは分子量 0,000 以上および,000 以下のタンパク質を対象としています標識するタンパク質溶液に分子量 0,000 以上の物質が含まれる場合はあらかじめ精製を行なって下さい ( 抗体を精製したいを参照 ) またタンパク質溶液に不溶性の低分子物質が含まれる場合は遠心して上清のみを標識反応に用いて下さい一回の標識操作に必要なタンパク質量は 0 00 μg です冷蔵保存中もしくは室温に戻した際にフィルトレーションチューブに水滴様の液粒が見られることがありますこれはメンブレンの乾燥防止剤が液粒化したもので製品の性能に問題はありません IgG 0 00 μg を含むサンプル溶液 a) と Solution A 00 μl を Filtration Tube に加えるピペッティングにより混合した後 8,000 x g で 0 分間遠心する b) Solution A 0 μl を Reducing Agent に加えボルテックスミキサー等で混合し溶解させる c) b) この溶液 00 μl を IgG が濃縮されている Filtration Tube のメンブレン上に加える図リン酸化チロシン BSA のウエスタンブロット a) PLK - NH を用いて作製した HRP 標識抗リン酸化チロシン抗体で検出 ( 直接法 ) b) 抗リン酸化チロシン抗体 /HRP 標識次抗体で検出 ( 間接法 ) それぞれ TMB 発色

7 8 9 ピペッティングにより IgG と混合した後 7 で 0 分間反応する Solution B 00 μl を加え 8,000 x g で 0 分間遠心する b) ろ液を捨てた後 Solution B 00 μl を加え遠心する b) Reaction Buffer 0 μl を SH- Reactive Peroxidase に加えピペッティングにより溶解させるこの溶液を

4 7 8 9 ピペッティングにより IgG と混合した後 7 で 0 分間反応する Solution B 00 μl を加え 8,000 x g で 0 分間遠心する b) ろ液を捨てた後 Solution B 00 μl を加え遠心する b) Reaction Buffer 0 μl を SH- Reactive Peroxidase に加えピペッティングにより溶解させるこの溶液を Filtration Tube のメンブレン上にマイクロピペットで加えるピペッティングにより混合した後 7 で時間反応する Solution A 00 μl を反応溶液に加えマイクロピペットで Filtration Tube に移す 8,000 x g で 0 分間遠心する b) ろ液を捨てた後 Solution A 00 μl を加え遠心する b) この操作をもう一度繰り返す Storage Buffer 00 μl を加え c) ピペッティングにより標識体を溶解させる溶液をマイクロチューブに移し 0 で保存する a) サンプルが Reaction Buffer に難溶の場合は水と混合する溶媒 (DMS DMF アルコール等 ) で 0 mmol/l サンプル溶液を調製しこの溶液 μl と Reaction Buffer μl を混合し mmol/l サンプル溶液とする標識対象物以外に SH 基を有する物質が含まれる場合は精製により除去していただきたい分間遠心する c) PD 分子に分子の低分子化合物が標識される増殖 / 毒性酸化ストレス分子生物学内蛍光プローブ染色ミトコンドリア関連試薬細菌研究用試薬膜タンパク質可溶化剤ラベル化剤二価性試薬イオン電極 0 Solution A 00 μl を加え 8,000 x g で 0 分間遠心する b) Storage Buffer 00 μl を加え d) ピペッティングにより標識体を溶解させる溶液をマイクロチューブに移し 0 で保存する e) a) サンプル溶液量は 00 μl 以下で使用すること IgG 濃度が 0. mg/ml 以下である場合には操作と操作を繰り返し IgG 量が 0 00 μg となるように調整する溶液に標識対象物以外の分子量 0,000 以上の物質が含まれる場合は精製により除去していただきたい分間遠心する c) Reducing Agent がキャップの内側に付着している場合があるので開封にはご注意いただきたい d) 分子の PD が IgG 分子に標識される通常未反応の PD は EIA に影響を及ぼさない必要に応じてゲルろ過カラムあるいはアフィニティーカラム等により精製すること e) 長期保存する場合は同量のグリセロールを添加し 0 で保存する ) SH 基を有する低分子化合物 ( 分子量 <,000) への標識 Reaction Buffer で調製した mmol/l サンプル溶液 0 μl を a) SH-Reactive Peroxidase に加えるピペッティングにより SH- Reactive Peroxidase を溶解した後 7 で時間静置する V Alkaline Phosphatase Labeling Kit - NH によるアミノ基への ALP 標識 (Code.LK). キット内容 NH -Reactive Alkaline Phosphatase Washing Buffer. キット以外に必要なもの 0 μl 00 μl マイクロピペッタ- インキュベーター (7 ). 保存条件 0 で保存する NH -Reactive Alkaline Phosphatase は外装袋を一旦開封後は 0 で保存する. 使用上の注意本キットは分子量 0,000 以上および,000 以下のタンパク質を対象としています標識するタンパク質溶液に分子量 0,000 以上の物質が含まれる場合はあらかじめ精製を行なって下さいまたタンパク質溶液に不溶性の低分子物質が含まれる場合は遠心して上清のみを標識反応に用いて下さい一回の標識操作に必要なタンパク質量は 0 00 μg です冷蔵保存中もしくは室温に戻した際にフィルトレーションチューブに水滴様の液粒が見られることがありますこれはメンブレンの乾燥防止剤が液粒化したもので製品の性能に問題はありません機能性有機材料

5 増殖 / 毒性酸化ストレス分子生物学内蛍光プローブ染色ミトコンドリア関連試薬細菌研究用試薬膜タンパク質可溶化剤ラベル化剤二価性試薬イオン電極機能性有機材料 IgG 0 00 µg を含むサンプル溶液 a) と Washing Buffer 00 µl を Filtration Tube に入れる 8,000 x g で 0 分間遠心する b) Washing Buffer 00 µl を加えもう一度遠心する b) Reaction Buffer 0 µl を NH - Reactive Alkaline Phosphatase に加え溶解させる c) NH -Reactive Alkaline Phosphatase を含む溶液を IgG が濃縮されている Filtration Tube のメンブレン上に添加するピペッティングによりメンブレン上の IgG と混合させた後 7 で時間反応する Storage Buffer 90 µl を加え d) ピペッティングにより標識体を溶解させる溶液をマイクロチューブに移し 0 で保存する e) a) サンプル溶液量は 00 µl 以下で使用すること IgG 濃度が 0. mg/ml 以下である場合には操作と操作を繰り返し IgG 量が 0 00 µg となるように調整する溶液に他のタンパク質やアミノ基を有する化合物が混在する場合は精製により除去していただきたい分間遠心する c) NH -Reactive Alkaline Phosphatase は Reaction Buffer 中では不安定である溶解後は直ちに操作へ進む d) 分子の ALP が IgG 分子に標識される通常未反応の ALP は EIA に影響を及ぼさない必要に応じてゲルろ過カラムあるいはアフィニティーカラム等により精製すること e) 長期保存する場合はそのまま 0 で保存すること () アミノ基を有する低分子化合物 ( 分子量 <,000) への標識 ) Reaction Buffer で調製した mmol/l サンプル溶液 0 µl を a) NH -Reactive Alkaline Phosphatase に加えるピペッティングにより NH -Reactive Alkaline Phosphatase を溶解した後 7 で時間放置する ) Washing Buffer 00 µl を反応溶液に加えマイクロピペットで Filtration Tube に移す ) 8,000 x g で 0 分間遠心する b) ろ液を捨てた後 Washing Buffer 00 µl を加え遠心する b) この操作をもう一度繰り返す ) Storage Buffer 00 µl を加え c) ピペッティングにより標識体を溶解させる溶液をマイクロチューブに移し 0 で保存する a) サンプルが Reaction Buffer に難溶の場合は水と混合する溶媒 (DMS DMF アルコール等 ) で 0 mmol/l サンプル溶液を調製しこの溶液 µl と Reaction Buffer µl を混合し mmol/l サンプル溶液とする被標識化合物以外にアミノ基を有する物質が含まれる場合は精製により除去していただきたい分間遠心する c) ALP 分子に分子の低分子化合物が標識される IV Alkaline Phosphatase Labeling Kit - SH による SH 基への ALP 標識 (Code:LK). キット内容 SH-Reactive Alkaline Phosphatase Reducing Agent Solution A Solution B. キット以外に必要なもの 0 µl 00 µl マイクロピペッタ- インキュベーター (7 ). 保存条件 0 で保存する SH-Reactive Alkaline Phosphatase は外装袋を一旦開封後は 0 で保存する. 使用上の注意本キットは分子量 0,000 以上および,000 以下のタンパク質を対象としています標識するタンパク質溶液に分子量 0,000 以上の物質が含まれる場合はあらかじめ精製を行なって下さいまたタンパク質溶液に不溶性の低分子物質が含まれる場合は遠心して上清のみを標識反応に用いてください一回の標識操作に必要なタンパク質量は 0 00 µgです冷蔵保存中もしくは室温に戻した際にフィルトレーションチューブに水滴様の液粒が見られることがありますこれはメンブレンの乾燥防止剤が液粒化したもので製品の性能に問題はありません IgG 0 00 μg を含むサンプル溶液 a) と Solution A 00 μl を Filtration Tube に加えるピペッティングにより軽く混合した後 8,000 x g で 0 分間遠心する b)

7 Solution A 0 μl を Reducing Agent に加えピペッティングにより溶解させる c) この溶液 00 μl を IgG が濃縮されている Filtration Tube のメンブレン上に加えるピペッティングにより IgG と混合した後 7 で 0 分間反応する Solution B 00 μl を加え 8,000 x g で 0 分間遠心する b)

6 7 Solution A 0 μl を Reducing Agent に加えピペッティングにより溶解させる c) この溶液 00 μl を IgG が濃縮されている Filtration Tube のメンブレン上に加えるピペッティングにより IgG と混合した後 7 で 0 分間反応する Solution B 00 μl を加え 8,000 x g で 0 分間遠心する b) ろ液を捨てた後 Solution B 00 μl を加え遠心する b) Reaction Buffer 0 μl を SH- Reactive Alkaline Phosphatase に加えピペッティングにより溶解させる d) ) SH 基を有する低分子化合物 ( 分子量 <,000) への標識 () Reaction Buffer で調製した mmol/l サンプル溶液 0 μl を a) SH-Reactive Alkaline Phosphatase に加えるピペッティングにより SH-Reactive Alkaline Phosphatase を溶解した後 7 で時間反応する () Solution A 00 μl を反応溶液に加えマイクロピペットで Filtration Tube に移す () 8,000 x g で 0 分間遠心する b) ろ液を捨てた後 Solution A 00 μl を加え遠心する b) この操作をもう一度繰り返す () Storage Buffer 00 μl を加え c) ピペッティングにより標識体を溶解させる溶液をマイクロチューブに移し 0 で保存する d) a) サンプルが Reaction Buffer に難溶の場合は水と混合する溶媒 (DMS DMF アルコール等) で 0 mmol/l サンプル溶液を調製しこの溶液 μl と Reaction Buffer μl を混合し mmol/l サンプル溶液とする被標識化合物以外に SH 基を有する物質が含まれる場合は除去してすること分間遠心する c) ALP 分子に分子の低分子化合物が標識される d) 長期保存する場合はそのまま 0 で保存する 0 ng 0 ng ng kda 増殖 / 毒性酸化ストレス分子生物学内蛍光プローブ染色ミトコンドリア関連試薬細菌研究用試薬膜タンパク質可溶化剤ラベル化剤二価性試薬イオン電極 8 この溶液を還元 IgG が濃縮されている Filtration Tube のメンブレン上に加える kda 標的タンパク質機能性有機材料 9 ピペッティングにより混合した後 7 で時間反応する kda 0 Storage Buffer 0 μl を加えピペッティングにより標識体を溶解させる e) 溶液をマイクロチューブに移し 0 で保存する f) 図 ALP 標識一次抗体を用いたウェスタンブロット ALP 標識一次抗体の,000 倍希釈液で染色し ALP 発光基質 (Bold APB chemiluminescent substrate, Molecular Probes) を反応させ 0 秒間露光した a) サンプル溶液量は 00 μl 以下で使用すること IgG 濃度が 0. mg/ml 以下である場合には操作と操作を繰り返し IgG 量が 0 00 μg となるように調整する溶液に他のタンパク質や SH 基を有する化合物が混在する場合は精製により除去していただきたい分間遠心する c) Reducing Agent がキャップの内側に付着している場合があるので開封にはご注意いただきたい d) SH-Reactive Alkaline Phosphatase は Reaction Buffer 中では不安定なので溶解後は直ちに操作 8 を行う e) 分子の ALP が IgG 分子に標識される通常未反応の ALP は EIA に影響を及ぼさない必要に応じてゲルろ過カラムあるいはアフィニティーカラム等により精製する f) 長期保存する場合はそのまま 0 で保存する

プロトコル蛍光色素を標識したい利用製品 < 少量抗体 (10μg) 標識用 > ICG Labeling Kit- NH 2 [LK31] - アミノ基標識用 - R-Phycoerythrin Labeling Kit - NH 2 [LK23] Ab-10 Rapid Fluorescein

プロトコル蛍光色素を標識したい利用製品 < 少量抗体 (10μg) 標識用 > ICG Labeling Kit- NH 2 [LK31] - アミノ基標識用 - R-Phycoerythrin Labeling Kit - NH 2 [LK23] Ab-10 Rapid Fluorescein 蛍光色素を標識したい利用製品 < 少量抗体 (0μg) 標識用 > ICG Labeling Kit- H [LK] - アミノ基標識用 - R-Phycoerythrin Labeling Kit - H [LK] Ab-0 Rapid Labeling Kit [LK] Allophycocyanin Labeling Kit- H [LK] Ab-0 Rapid HiLyte Fluor TM