Microsoft PowerPoint - 平成22年度第一回_武田.pptx

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たつぞうかいじ
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1 ヒト選択的スプライシングデータベース H DBAS の活用産業技術総合研究所バイオメディシナル情報研究センター武田淳一 1

2 目次選択的スプライシングについて H DBAS のデータと使い方 2

3 目次選択的スプライシングについて H DBAS のデータと使い方 3

4 スプライソソームによるスプライシング complex E スプライソソーム : 5つのsnRNP(small nuclear ribonucleoprotein particle) U1, U2, U4, U5, U6と数百のsplicing factorからなる細胞内で最大の複合体 pre mrna からいくつかの段階かの段階 (complex p E, A, B, C) ) を経てイントロンを除去し mrnaにする Wahl etal 2009 Cell The Splicesome: Design Principles 4 of a Dynamic RNP Machine

選択的スプライシング ESE: exonic splicing enhancer ESS: exonic splicing silencer ISE: intronic splicing enhancer ISS: intronic splicing silencer SR: arginine serine rich

5 選択的スプライシング ESE: exonic splicing enhancer ESS: exonic splicing silencer ISE: intronic splicing enhancer ISS: intronic splicing silencer SR: arginine serine rich protein hnrnp: heterogeneous nuclear ribonucleoprotein Wang and Burge 2008 RNA Splicing regulation: From a parts list of regulatory 5 elements to an integrated splicing code

6 ヒト遺伝子において選択的にスプライスされる遺伝子の割合 AS 遺伝子の割合 Method Year Author Journal % EST 2002 Modrek and Lee Nature Genetics 74 % Microarray 2003 Johnson etal Science % RNA Seq 2008 Wang etal Nature 6

7 Nova RNA interaction map Nova protein: ニューロン特異的選択的スプライシング因子 YCAYという配列に特異的に結合中の図 : Ule etal 2006 Nature によって予測された RNAマップ Licatalosi etal 2008 Nature HITS CLIP yields genome wide 7 insights into brain alternative RNA processing

8 組織特異的スプライシングパターンの予測 8

9 選択的スプライシングによって引き起こされる病気の例 Cooper etal 2009 Cell RNA and Disease 9

10 目次選択的スプライシングについて H DBAS のデータと使い方 10

11 H DBAS のデータ H InvDBの転写物からヒト代表選択的スプライシングバリアント (Representative AS Variant; RASV) を同定しているヒト RASV は下記解析がなされている 1. タンパク機能に影響を与えるか ( 機能解析 ) 2. モデル生物の対応するローカスのRASVと保存性があるか ( 比較ゲノム解析 ) 3.ASジャンクションがポリソーム分画で発現しているか (RNA Seq 解析 RefSeq を使用 ) 11

12 転写物の完全長判定と RASV の同定マッピング結果から転写物の完全長判定 RASV(Representative AS Variant) 同定 12

13 選択的スプライシングの比較ゲノム解析 13

14 選択的スプライシングの RNA Seq 解析ヒトDLD 1 細胞のcytoplasm( 細胞質 ) nuclear( ( 核翻訳していない ) polysome( ポリソーム : 複数のリボソームがある翻訳している ) から mrna を抽出計 1 億 4 千万のRNA Seqタグが生成ヒトゲノム中のジャンクションの検出には TopHat を用いた 2つ以上のタグがサポート ( 発現 ) されたジャンクションのみを解析に用いた厳密にするため RefSeqのジャンクションと同じ位置のものを選んだ上記ジャンクションのうち ASジャンクションについて評価 ( 翻訳してるしてない ) を行った 14

15 H DBAS の使い方クリックで直接 ASローカス構造図へ飛びます 15

16 機能解析 AS ローカス構造図メイン画面の表示形式操作比較ゲノム解析メイン画面 16

17 H DBAS の使い方 RNA-Seq 解析ページが現れます

21 H DBAS の活用例実験する前にバリアント間でタンパク機能モチーフに違いがないか確認するタンパクのアイソフォームの違いにより細胞内で異なる作用をする可能性があるマウスなどのモデル生物を使う場合ヒトと同じバリアント (ESV) が存在するか調べるるマウスヒトホモロジー検索だけでは保存度の高い遺伝子になるがヒトでの応用が難しいかもしれない

23 選択的スプライシングによって引き起こされる病気の例 Wang and Cooper 2007 NPG Splicing in disease: disruption of the splicing code and the decoding machinery

24 タンパク機能に影響を与える選択的スプライシングの統計 (H DBAS Version6) 転写物ローカスヒト完全長 cdna RASV ローカスタンパク機能モチーフ * (52%) 遺伝子オントロジー (GO) * (26%) 細胞内局在化シグナル * (46%) 膜タンパクドメイン * (10%) 計 7273 (63%) 予測プログラム : *1 InterPro Scan *2 TargetP WoLF PSORT *3 SOSUI TMHMM

25 選択的スプライシングの比較ゲノム解析結果と例計非保存ゲノム保存転写物保存 ESV 保存 AS RASV ローカスヒト RASV Src homology-3 RhoGAP domain サンプル図 : 保存 AS でかつタンパク機能に影響あり PI 3 キナーゼ調節サブユニット p55α PI 3 キナーゼ調節サブユニット p85α マウス cdna ヒトマウスゲノムアラインメント

26 選択的スプライシングの RNA Seq 解析 RefSeq statistics 結果と例 *Junctions expressed in *Junctions specifically expressed in Loci Transcripts Junctions Cytoplasm Nuclear Polysome Cytoplasm Nuclear (Nontranslation able) Polysome (Translation able) Total AS *Two or more RNA Seq tags were supported. caspase 4(CASP4) RefSeq RefSeq のエクソンのまとめジャンクションの位置にマップされたタグ ( 数 ) の表示各フラクションでジャンクションの位置にマップされたタグのヒストグラム

27 H DBAS の構築と更新

28 目次選択的スプライシングの機構我々の選択的スプライシング研究の結果次世代シークエンサーの可能性

29 HITS CLIP (high throughput sequencing of RNA isolated by crosslinking immunoprecipitation) 別名 CLIP Seq この方法により NOVAやFOX などの組織特異的スプライシング因子が結合する特徴 RNA 部位を大量に得ることができるようになった Jensen and Darnell 2008 Methods Mol Bio CLIP: crosslinking and immunoprecipitation in vivo RNA targets of RNA binding protein Wang etal 2009 Methods CLIP: Construction of cdna libraries for high throughput sequencing from RNAs cross linked to proteins in vivo

30 Nova RNA interaction map Nova protein: ニューロン特異的選択的スプライシング因子 YCAYという配列に特異的に結合中の図 : Ule etal 2006 Nature によって予測された RNAマップ Licatalosi etal 2008 Nature HITS CLIP yields genome wide insights into brain alternative RNA processing

31 次世代シークエンサー技術だけで哺乳類のゲノムを解読デノボアセンブリで高等動物のゲノム解読が可能 ( 十分なチェックは必要 ) 数多くのゲノムが解読される比較ゲノム解析で新たな知見が得られる ( と考えられる ) Scaffold: コンティグの連なり N50: 長いコンティグから並べていき全塩基配列長さの 50% になるのが期待される最小の長さのコンティグ Li etal 2010 Nature The sequence and de novo assembly of the giant panda genome

32 次世代シークエンサーの比較用途的にはサンガー法に近い single molecule real time (3 rd generation) GS FLX HiSeq 2000 SOLiD 4 Single Molecule l l (Roche) (Illumina) (Applied Biosystems) Sequencer version 年夏 2010 年 4 月 (Pacific Biosciences) 2010 年夏リード長 400~600b 100b x 2 50b x ~1200b (5% は3000~5000b に届く ) 1 run あたりのスルー 400~600Mb 200Gb 100Gb 1x 二倍体ヒトゲノムをプット (100bペアエンド法) 1 日 (version1) 1 run あたりの時間 10 時間 8 日 4~5 日 1 run あたりのコスト ( 消耗品含む ) 備考メイトペアで 12~14 日 80 万円 300 万円 ( 最大で ) 3+ で38 万円ライブラリ込みで1スライド60 万円 4ではもっと安く性能は去年から変化なし FLXの簡易版である GS Junior 発表 (2009/12/07) BGI が 128 台購入と発表 (2010/01/12) 数 xのヒトゲノムを15 分以下 (version2) single molecule 最初の10 顧客を発表 sequencing 値段は $695,000 technologyを発表 version2を2014 年に (2010/03/01) 市場投入予定と発表 (2010/02/23) 2010/03/02 調査

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GWB NGS データ解析入門 Web セミナー : De Novo シークエンス解析編 1 NGS 新規ゲノム配列解析の手順シークエンス遺伝子領域の検出アセンブルデータベース検索 2 解析ワークフローと使用ソフトウェアシークエンスデータのインポートクオリティチェック前処理コンティグ配列の作成 CLC Genomics Workbench 遺伝子領域の検出 Blast2GO PRO データベース検索