平成 25 年度新潟薬科大学薬学部卒業研究 Ⅱ 論文題目 ROCK1 Rho-kinase の核局在メカニズム解明を目的とした ROCK1 発現プラスミドの構築 Construction of ROCK1 expression plasmid to clarify Nuclear Localiza

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かおりしげまつ
5 years ago
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1 平成 25 年度新潟薬科大学薬学部卒業研究 Ⅱ 論文題目 ROCK1 Rho-kinase の核局在メカニズム解明を目的とした ROCK1 発現プラスミドの構築 Construction of ROCK1 expression plasmid to clarify Nuclear Localization Mechanism of ROCK1 Rho-kinase 薬品製造学研究室 6 年 08P066 平岡詩織 ( 指導教員 : 浅田真一 )

2 要旨 Rho-associated coiled coil kinase (ROCK) は低分子量 GTP 結合タンパク質の一種であり Rho-kinase とも呼ばれ Rho の標的として同定されている ROCK は細胞質内に局在し種々の機構によりストレス線維の形成を促進することで細胞運動に関与している近年 ROCK が核内にも細胞質と同程度の濃度で存在することが報告された一般に核内に存在するタンパク質はその配列中に核移行シグナルと呼ばれる特徴的な配列を有しているが ROCK の配列中にそのような配列は存在しないそこで ROCK の 2 種類あるサブタイプ (ROCK1 ROCK2) のうち ROCK1 の核移行メカニズムの解析を目的としたプラスミドの構築を行ったプラスミドの構築を行うため Gateway システムを用いた attb1 配列を含むプライマーである attb1_h_rock1_ _fw attb1 配列及び STOP コドンを含むプライマーである attb1_rock1_stop_ _rv を用いて PCR を行った PCR 産物を電気泳動したところ目的の PCR 産物 ROCK1 ( ) であると予想された作製した PCR 産物 ROCK1 ( ) を用いて BP 反応を行い sequencing を行いエントリークローン ROCK1 ( ) /pdonr221 の構築を確認した今後このエントリークローンを用いて LR 反応核移行の確認を行う予定である Gateway システムで様々な欠損変異体を作製できれば ROCK1 の核移行に関与する遺伝子領域を明らかにしていくことが可能である

3 キーワード 1. Rho-associated coiled 3. 低分子量 GTP 結合タ 2.Rho coil kinase(rock) ンパク質 4. 分子スイッチ 5.ROCK1 6.ROCK2 7.ROCK 阻害剤 8. nuclear localization signal (NLS) 9. 欠損変異体 10.Gateway システム 11. 部位特異的組み換え 12. エントリークローン 13. クローニング 14.PCR 15.BP 反応 16. 形質転換 17. プラスミド 18. 制限酵素 19. アガロースゲル電気泳動 20.sequencing

4 目次 1. はじめに Rho Rho-kinase ROCK 阻害薬の現状本研究の目的 3 2. 実験材料大腸菌株プラスミドプライマーベクター制限酵素培養液実験操作プラスミドの決定 5 3. 結果 PCR BP 反応考察 12 謝辞 13 引用文献 14

5 1. はじめに 1.1. Rho Rho は分子量 2 万 ~3 万の低分子量 GTP 結合タンパク質であり Rho サブファミリーの 1 つに分類され分子スイッチとして機能している低分子量 GTP 結合タンパク質は GDP 結合型の不活性型と GTP 結合型の活性型があり非刺激下では GDP 結合型の不活性型として存在するが特定の細胞外シグナルが細胞に作用することにより GTP 結合型の活性型に変換される [1 ] この GTP 結合型が標的タンパク質に結合することで様々な生理作用を引き起こす (Fig. 1) Rho は細胞増殖因子等の細胞外シグナルを受けてアクチン系の細胞骨格を制御しておりストレス線維の形成平滑筋の収縮細胞骨格の再構築細胞遊走能に深く関与している [1 ] この他にも冠動脈攣縮動脈硬化症遺伝子発現制御胚の発生分化への関与が示唆されているこのような Rho の生理作用の多くは ROCK を経由して発現している [1 ] Fig. 1 低分子 GTP 結合タンパク質 Rho の分子スイッチモデル [2 ] 不活性型の GDP 結合型が GDP/GTP 交換反応促進タンパク質 (GDP/GTP exchange protein: GEP) の作用により活性型である GTP 結合型に変換されエフェクターと結合してシグナル伝達を開始するその後 GTP 活性促進タンパク質 (GTP activating protein: GAP) により GDP 結合型に変化しシグナル伝達が終了する 1.2. Rho-kinase ROCK は Rho-kinase とも呼ばれ分子量約 160 kda のセリン / スレオニンリン酸化酵素であり線虫ショウジョウバエのような下等生物からマウスヒトのような高等真核生物まで広く保存されている遺伝子である [3] ヒトでは ROCK1 と 1

ROCK2 という 2 つのアイソフォームが存在する [3] 構造は N 末端部に kinase domain 中央部に Rho-binding domain (RBD) を含む coiled-coil domain C 末端部に cysteine-rich domain (CRD) を含む pleckstrin-homology (PH) domain が存在する (Fig.

6 ROCK2 という 2 つのアイソフォームが存在する [3] 構造は N 末端部に kinase domain 中央部に Rho-binding domain (RBD) を含む coiled-coil domain C 末端部に cysteine-rich domain (CRD) を含む pleckstrin-homology (PH) domain が存在する (Fig. 2) [3 ] RB domain と PH domain は直接キナーゼドメインに結合し活性を抑制する [1 ] ROCK1 と ROCK2 は全体で 65% の相同性があり特に kinase domain では 92% という高い相同性がある ROCK1 は全身に発現しているが ROCK2 は脳や筋肉での発現レベルが高いことがわかっているため ROCK1 と ROCK2 は Rho の細胞内シグナル伝達経路においてそれぞれ異なる役割を果たしている可能性が考えられる [3 ] (AA) Fig. 2 マウス ROCK1 および ROCK2 のドメイン構造と相同性 ( 引用文献 5 Fig. 1 より改変 ) 数字はアミノ酸の番号を割合は ROCK1 と ROCK2 相同性を表すなお ROCK2 の RBD のアミノ酸番号は確定していない近年細胞質に局在しているとされていた ROCK2 は核にも細胞質と同程度の濃度で存在することが明らかになった [6] さらに p300 アセチルトランスフェラーゼや MLH1 (MutL homologue1) のような核内で ROCK2 と相互作用するタンパク質も報告され ROCK2 の細胞内全域に亘る機能について研究が進められている [7] 1.3. ROCK 阻害薬の現状 ROCK を標的とした薬にファスジル塩酸塩 ( 商品名 : エリル R ) がある (Fig. 3) ファスジル塩酸塩は ROCK を阻害しくも膜下出血後の脳血管攣縮および脳虚血症状を改善するファスジル塩酸塩のような臨床現場で使用されている ROCK 阻害剤はまだ多くないが ROCK が仲介するシグナル伝達経路は平滑筋の収縮や 2

7 細胞遊走細胞の分化など様々な生理機能を制御しており医薬品の標的として非常に有力である特に ROCK が関与する平滑筋収縮機構は細胞内 Ca 2+ 濃度に依存しないため ROCK 阻害剤は新しい作用機序の高血圧治療薬となりうるま Fig. 3 ファスジル塩酸塩の構造た ROCK が関与する細胞遊走は癌細胞で多く確認されており癌の浸潤転移を引き起こしていることから ROCK 阻害剤は癌の転移を抑制する薬となる可能性を秘めている [8,9] 1.4. 本研究の目的一般に核へ移行するタンパク質は核局在シグナル (nuclear localization signal: NLS) と呼ばれるアミノ酸配列を持つか NLS を持つタンパク質と相互作用して核へ移行することが知られている NLS の代表的なものに一次配列中に塩基性アミノ酸のリジンとアルギニンを複数含んでいる classical NLS (cnls) モチーフが知られている cnls としてシミアンウイルス 40 (simian virus40: SV40) large T 抗原の持つ ( 126 PKKKRKV 132 ) やアフリカツメガエルの核質タンパクに存在する配列 ( 155 KRPAATKKAGQAKKKK 169 ) Y 染色体性決定領域遺伝子 (Sex-determining region Y: SRY) の持つ ( 59 KRPMNAFIVWSRDRRK RPRRK 135 ) などが報告されている [11] このほかに塩基性アミノ酸に加えプロリンとチロシンも含む PY-NLS モチーフや核内のタンパク質ウイルス由来のタンパク質に特異的な NLS 配列 [10] 一次配列上では分散していた塩基性アミノ酸がタンパク質として三次構造をとった時に集合して NLS の役割を果たす散在性 NLS も報告されている [11] ROCK2 は核に存在することは前述で述べたが ROCK2 の配列中に NLS の配列や NLS と類似の配列は存在しないそこで本研究では ROCK2 と相同性の高い ROCK1 の様々な欠損変異体を用いて transfection を行い ROCK の核移行に関与する領域の探索を行うことにした transfection に用いる発現プラスミド構築のため Gateway システム Invitrogen (USA) を使用し今回は RBD を含む coiled-coil domain の配列を解析するための発現プラスミド構築を行った 3

8 2. 実験 2.1. 材料大腸菌株形質転換には JM109 タカラバイオ ( 滋賀 ) の菌株を用いたプラスミド Homo sapiens ROCK1 ORF 全長を含むプラスミドである GC-Q0129 は Gene Copoeia (USA) より購入したプライマー Gateway システム及び sequencing に用いるプライマーは Invitrogen (USA) に合成を依頼したベクター pdonr221 Invitrogen (USA) を使用した制限酵素 EcoRⅤ HpaⅠ はタカラバイオ ( 滋賀 ) より購入した培養液使用した主な培養液の組成を以下に示す LB 培地 :1% bactotryptone,0.5% bacto yeast extract,1% NaCl SOC 培地 :1% bactotryptone,0.25% bacto yeast extract,0.025% NaCl, 2.5 mm KCl,10 mm MgCl 2,20 mm glucose TE:10 mmtris-hcl (ph 8.0), 1 mm EDTA (ph 8.0) LB 培地には必要に応じて Ampicillin (Amp) の場合終濃度 0.01% となるように Kanamycin (Kana) の場合終濃度 0.02% となるようにそれぞれ加えたまた平板培地として用いる場合にはさらに 1.5% の Agar Powder を加えた 4

9 2.2. 実験操作プラスミドの作成 Gateway システムの利用 Gateway システムは目的遺伝子を持つエントリークローンを構築すれば部位特異的な組み換え反応を利用して目的遺伝子をさまざまな Gateway 対応の発現ベクター ( ディスティネーションベクター ) に移入することが可能でありタグの導入も容易に行うことが可能といった特徴をもつ特に制限酵素やリガーゼを用いずに部位特異的な組み換え反応 (attb x attp attl x attr) を利用しているため制限酵素によるクローニングの制限をうけることがない (Fig. 4) 本研究では最終的に発現クローンを標識タグと融合させて哺乳動物細胞に発現させることを想定しているため発現クローンを効率的に構築することが可能な Gateway システムを用いることとした Fig. 4 Gateway システムの流れ両端に attb 配列を付加した遺伝子を部位特異的な組み換え反応である BP 反応と LR 反応によって目的に合わせたベクターへ移入できるプライマーの設計 Homo sapiens ROCK1 の RBD を含む coiled-coil domain 配列解析を行うため Gateway システムに対応するプライマーとして末端に attb 配列を付加し 5

10 attb1_h_rock1_ _fw attb1_h_rock1_stop_ _rv はそれぞれ ROCK1ORF の 1243~1263 塩基 3286~3309 塩基とアニーリングするように設計した BP 反応物の sequencing 結果で読み取れない個所があったためその個所をはさむように h_rock1_ _fw h_rock1_ _rv はそれぞれ ROCK1ORF の 1905~1925 塩基塩基とアニーリングするように設計した (Table 1) Table 1. 設計したプライマーの名称と配列名称 attb1_h_rock1_ _fw attb1_h_rock1_stop_ _rv h_rock1_ _fw h_rock1_ _rv 塩基配列 (5' 3') GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT ATATGAGAACTAGCTCCAATGCAGAT GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT GTCAAATGTCACTGTCCTTACTGTC AGAGGAGGTGAAGCATCTCAA AGCCGACTAACAGTGTGAGATTCT PCR 今回の実験では KOD (TOYOBO) を用いて PCR を行った氷上で 10 Buffer for KOD Plus ver.2 5 μl 2mM dntps 5 μl 25mM MgSO 4 5 μl プライマーとして 5 pmol/μl の attb1_h_rock1_ _fw attb1_h_rock1_stop_ _rv それぞれ 9 μl 鋳型 DNA として GC-Q μl KOD-Plus 1 μl dh 2 O 12 μl を混和し Predenature を行った後 Denature Annealing Extension の 3 つの段階を繰り返し 35 サイクル行った (Table 2) Table 2 KOD を用いた PCR の条件反応 Predenature Denature Annealing Extension 温度時間 94 2 分秒秒 68 4 分 6

11 BP 反応 1.5 ml チューブに attb-pcr 産物 7 μl pdonr vector221 を 1 μl TE Buffer (up to 8 μl ) を加えて混和しさらに氷上で溶解させた BP ClonaseⅡ enzyme mix を 2 μl 加えて 25 で 1 時間静置したここに Proteinase k を 1 μl 加え 37 で 10 分間静置した形質転換氷上で溶解させたコンピテントセル JM μl にプラスミド溶液 1 μl を加え軽く混和した後 30 分間氷上で静置するその後 42 の温浴で 30 秒間加温しすぐに 2 分間氷上で冷却したこの液に溶解しておいた SOC 培地を加え rpm で 30 分間振盪培養した培養液を 1 分間遠心分離し上清を 170~450 μl 捨て残液を再懸濁したこの懸濁液を LB (Amp + ) または LB (Kana + ) 平地培地にプレーティングして 37 で一晩静置させコロニーを形成させた培養一晩静置して形成したコロニーを爪楊枝で取り LB (Amp + ) または LB (Kana + ) 液体培地 2 ml にコロニーを懸濁して rpm で一晩振盪培養したプラスミドの精製プラスミドは QIAprep mini Spin Column (QIAGEN) 又は Hispeed Plasmid Midi Kit (QIAGEN) を用いて精製した大量精製時のみ 280 nm の吸光度測定することにより DNA 濃度を測定した制限酵素処理精製したプラスミドに EcoR V の場合 10 H Buffer Hpa I の場合 10 K Buffer をそれぞれ 1.5 μl 制限酵素 0.7 μl dh 2 O を加え全量 15 μl にしたものを 37 1 時間静置する 7

12 アガロースゲル電気泳動電気泳動に使用するゲルは 1 TAE 150 ml に 0.8% の Agarose-ME を溶解し固めたものを使用したサンプルと 10 Loading Buffer を混ぜた物とマーカーとして 1kb DNA Ladder を泳動させたエチジウムブロマイド溶液にゲルを入れ振盪させた Sequencing プラスミドの塩基配列決定はファスマック ( 神奈川 ) に委託した 8

全長を含むプラスミドである GC-Q0129 Gene Copoeia (USA) を鋳型 DNA として PCR を行った (Fig.

13 3. 結果 3.1. PCR attb1 配列を含むプライマーである attb1_h_rock1_ _fw attb1 配列及び STOP コドンを含むプライマーである attb1_rock1_stop_ _RV を用いて Homo sapiens ROCK1 ORF 全長を含むプラスミドである GC-Q0129 Gene Copoeia (USA) を鋳型 DNA として PCR を行った (Fig. 5) その結果目的とする PCR 産物 ROCK1 ( ) が構築したと予想され電気泳動で目的の遺伝子が増幅されていることを確認した (Fig. 6) ROCK1 ( ) (AA) Fig. 5PCR で用いたプライマーの位置と PCR 産物今回は Rho 結合ドメイン (RBD) を含む coiled-coil ドメインの配列を解析するため Kinase Domain と Coild-coil Domain の間からと Coild-coil Domain と PH Domain の間から設計した Fig. 6 PCR 産物の制限酵素による切断部位作製した ROCK1 ( ) は理論上 2.1 kbp であり結果から 2.1 kbp 付近にバンドが確認できた 9

14 3.2. BP 反応目的とする PCR 産物 ROCK1 ( ) が得られたのでドナーベクター pdonr221 を用いての手順で BP 反応 (Fig. 7) を行い ROCK1 ( ) /pdonr221 プラスミドを構築した ROCK1 ( ) /pdonr221 のプラスミドを制限酵素処理後電気泳動行った結果それぞれ理論上 1.9 kbp と 2.6 kbp との断片とプラスミドの全長である 4.6 kbp の断片が確認された (Fig. 8) Fig. 7 BP 反応の機構 PCR 産物 ROCK1 ( ) とドナーベクター pdonr221 を BP 反応させるとエントリークローンと副生成物が構築される 10

Fig. 8 BP 反応産物の制限酵素による切断部位理論上 1 ヵ所で切断する EcoRⅤで処理したサンプルでは 4.6 kbp 理論上 2 ヵ所で切断する HpaⅠで処理したサンプルでは 1.9 kbp と 2.6 kbp の断片が確認された構築したプラスミドを sequencing した結果 C,N 末端側に変異は見られなかったが間の配列の約 0.

15 Fig. 8 BP 反応産物の制限酵素による切断部位理論上 1 ヵ所で切断する EcoRⅤで処理したサンプルでは 4.6 kbp 理論上 2 ヵ所で切断する HpaⅠで処理したサンプルでは 1.9 kbp と 2.6 kbp の断片が確認された構築したプラスミドを sequencing した結果 C,N 末端側に変異は見られなかったが間の配列の約 0.9 kbp が読み取れなかったそのため読み取れなかった配列を確認するために h_rock1_ _fw h_rock 1_ _RV を設計し再度 sequencing を行ったその結果変異なく読み取れていたので BP 反応により目的のプラスミド ROCK1 ( ) /pdonr221 の構築が確認できたと予想される 11

16 4. 結論設計したプライマーから作製した PCR 産物を用いて電気泳動した結果目的の ROCK1 ( ) が得られたと予想されたその後 BP 反応によりできた生成物の sequencing を行ったところ変異が見られず読み取れていたのでエントリークローン ROCK1 ( ) /pdonr221 を構築することに成功したと考えられる今回構築したエントリークローン ROCK1 ( ) /pdonr221 を用いて N 末端に GFP タグが標識されているディスティネーションベクター pcdna-dest 53 で LR 反応を行い発現クローン構築し核移行について調べる予定であるそして ROCK1 全長の核移行についてまだ行われていないので発現クローンを構築しそれを用いてコントロール実験も可能となる今後 Gateway システムを利用して他の ROCK1 欠損変異体を作成しその結果とコントロールを比較することで ROCK1 の核移行に関わる領域の特定が可能になるのではないかと考えられる 12

17 謝辞本卒業研究の終わりに随時有益なご助言とご指導を賜りました新潟薬科大学薬学部薬品製造学研究室北川幸己教授に心より感謝申し上げます本卒業研究を進めるにあたり直接のご指導とご鞭撻を賜りました新潟薬科大学薬学部薬品製造学研究室浅田真一助教に深く感謝申し上げます本卒業研究を始めるにあたり ROCK1 プラスミドを供与いただきました新潟薬科大学応用生命学部食品科学コース栄養生化学研究室西田浩志准教授に深く感謝申し上げます本卒業研究を進めるにあたり実験操作の丁寧なご指導を賜りました新潟薬科大学薬学部薬品製造学研究室卒業生髙橋重行大田理沙両氏に深く感謝申し上げます本卒業研究を進めるにあたり実験操作にご協力頂きました新潟薬科大学薬学部薬品製造学研究室山木聡氏橋本翠氏小出絵梨氏に深く感謝申し上げます最後に本卒業研究を進めるにあたり多大なるご協力をいただきました研究室の皆様に感謝申し上げます 13

18 引用文献 1. Kawano Y., Yoshimura T., Kaibuchi K., Folia Pharmacol.Jpn., 120, (2002). 2. Hattori S., シグナル伝達がわかる, (2001). 3. Tahara S., Shimomura H., YAKUGAKUZASSHI, 127(3), (2007). 4. Nakagawa O., Fujisawa K., Ishizaki T., Saito Y., Nakao K., Narumiya S., FEBS Lett., 392, (1996). 5. Tanaka T., Nishimura D., Wu RC. Amano M. Iso T.et al., J. Biol. Chem., 281, (2006). 6. 山田優希, 平成 23 年度新潟薬科大学薬学部卒業論文 Ⅱ, (2011). 7. Ishizaki T., Folia Pharmacol. Jpn.121, (2003) 8. 今村正之, 成宮周, 曽根三郎, 第 119 回日本医学会シンポジウム記録集がん転移研究の新しい展開分子研究から臨床へ,18-25(2001). 9. Maclane L.M., Corbett A.H., IUBMB Life, 61, (2009). 10. Hatayama M., Tomizawa T., Sakai-Kato K., Patrice B.,Kose S., Imamoto N., Yokoyama S., Utsunomiya-Tate N., Mikoshiba K., Kigawa T., Aruga J., Hum. Mol. Genet., 17, 22, (2008). 14

平成 26 年度新潟薬科大学薬学部卒業研究 Ⅱ ROCK-1 Rho-kinase の核局在メカニズム解明を目的とした ROCK-1 一部欠損型発現プラスミドの構築 Construction of deletion mutant of ROCK1 plasmid to clarify nuclea

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