DualPore OPEN使い方のコツ

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よしじろうみしま
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1 DualPore OPEN 使い方のコツ 1. TLCで展開溶媒の分離条件を定める 2. パーツを組み立てカラムを前洗浄する 3. サンプルをカラムにロードする 4. カラムに溶媒をフローする 5. 使用後のカラムを洗浄する従来シリカゲルと比べて極性溶媒の比率を 3 割ほど下げて使用すると似たような分離挙動になります - ヘキサン : 酢酸エチル =1:1 4:1 - ヘキサン : 酢酸エチル =3:1 40:1( 少量加えるのがポイント ) 市販 TLC にてヘキサン : 酢酸エチル =3:1 で Rf=0.7 以上の低極性化合物や原点に吸着して取れない高極性化合物は DualPore SIL でも分離を苦手ですその場合は DualPore ODS の使用と酢酸エチル等での抽出をおすすめします 2019/4/16ver

DualPore OPEN/Flash 分離能チェック用 DualPoreTLC スティック DualPore シリカをスティック状にした TLC です初期の展開溶媒検討用にお使いくださいガラス支持板がなく割れやすいのでご注意ください UV 未対応です使用方法 - 平らなピンセット等でやさしさを込めてお取扱いください - スポットを打ちすぎるとバンドが広がる傾向があります - ヘキサン :

2 DualPore OPEN/Flash 分離能チェック用 DualPoreTLC スティック DualPore シリカをスティック状にした TLC です初期の展開溶媒検討用にお使いくださいガラス支持板がなく割れやすいのでご注意ください UV 未対応です使用方法 - 平らなピンセット等でやさしさを込めてお取扱いください - スポットを打ちすぎるとバンドが広がる傾向があります - ヘキサン : 酢酸エチル =4:1を目安に分離条件を定めてください市販 TLC から極性溶媒の比率が 20% 程度下がります 6 ページ以降をご参照いただきおおよその分離条件をチェックする場合の目安としてください - 小型のサンプル瓶で立てかけて展開すると便利です - 呈色試薬処理後に加熱する場合はホットプレートが便利ですホットプレート = キムワイプを敷くと移動せず加熱しやすくなりますヒートガン = 風向きと並行にすると折れにくくなります - 簡易分取 TLC(PLC) として使用も可能です - アルコールで洗うと再利用できます DualPore TLC スティックは 1 本が高価ですカラム後に分離したかを調べる場合は安価な市販 TLC をおすすめします DPS Inc. All rights reserved. 2

4 カラム洗浄サンプルロードカルシウムナトリウム塩を含むサンプルはカラムの寿命を極端に縮めますのでご注意ください洗浄 ( 順相 ) メタノール 2CV 展開溶媒 1CV で洗浄 ( 逆相 ) メタノール 2CV 展開溶媒 or 水 1CV で洗浄再使用前にアルコールで洗っていればメタノールでの洗浄は省略可能ですメタノールの代わりにエタノール 2- プロパノールアセトニトリルなどお好みの溶媒でお使いください! ヘキサンメタノールなど種類や使用温度によって混ざりにくい場合がありますロード 1. 溶液にしてサンプルロードカラムのフリット上に展開溶媒に溶かしたサンプルを注射器などで直接ロードします高分離能が必要であればサンプル溶液高さ 1cm 以下を目安に空気が入ってしまっても OK です別売りの固相抽出用カラムでの前処理やプレフィルターを使用するとカラム寿命が延びます最大負荷量は 8 ページ以降の表を目安にサンプル量を決めてください 2. シリカと混ぜてドライロード ( 原点吸着除去キットをご利用ください ) 移動相に溶けにくいサンプルはシリカ粉体にまぶしてソルベントリザーバーに入れカートリッジ上部に接続します! 従来シリカゲルはドライロードなどでも併用しないでください保持挙動が異なり分離できません DPS Inc. All rights reserved. 4

5 カラム分離洗浄保管 OPEN カラム分離 Rf 値から算出した溶出溶媒量を目安にフラクションを回収してください ( 順相 ) ヘキサン : 酢酸エチル or メタノール ( 逆相 ) 水 : メタノール or アセトニトリルなど TLC を省略する場合徐々に溶媒極性を上げて溶出を早くすると効果的です TLC と同一溶媒組成で 10CV 流すと Rf = 1.0~0.1 程度を分離できますゆっくり流すほど分離能は向上します洗浄保管メタノール 2CV で洗浄してください溶媒を充填したままでも空気を送り脱液して保管も可能ですカラムを立てたまま保管すると長持ちします! 水の存在下で加水分解によりカラムの劣化を早めます有機溶剤 100% に置換して保管ください再利用使用上限目安は10 回ですがサンプル溶媒保管条件などによって変動しますカラム入り口が着色してきたら寿命ですカラム上部に隙間が空いてきた場合フィルターを上から押して隙間を埋めてください再利用時には同じ種類の化合物の分離に使用することをおすすめします原点吸着した成分との反応が気になる場合は原点吸着除去キットをご利用ください DPS Inc. All rights reserved. 5

6 Rf 値とカラムサイズ溶媒比の関係 TLC の Rf 値と溶出時のカラム溶媒体積比 CV に以下の相関があります DualPore OPEN/Flash で分離の際に必要溶媒量の比率を概算できます CV = 1 / Rf CV カラム体積比 = 溶媒比 (DualPore の場合 ) カラム体積が 20mL の場合 Rf=0.5 であれば 40mL 流すとフラクション回収できます Rf 値の逆数の差分より分離の難易度が決まります >1.5 になるよう溶媒組成比を調整すると楽に精製できます = CV A CV B = 1 / Rf A 1/ Rf B = ~ 1.5 : 難しい ( 精密精製向け ) = 1.5 ~ 4 : 標準的 = 4 ~ : 簡単 ( 粗精製向け ) 標準的難しい RfとCVの関係 Rf CV 注 : 従来粒子は CV= カラム体積 (1- 空隙率 ) で算出されます DPS Inc. All rights reserved. 6

7 = = = TLC の Rf 値比からカラムサイズに応じてサンプル負荷量を決めてください TLC とカラムは相関していますが溶媒の微妙な比率や温度でも変わりますあくまでもフラクション回収の目安としてお考え下さい簡単 ( 粗精製向け ) 普通難しい ( 精密精製向け ) wt% wt% wt% Rf 値との相関表 = CV A CV B = 1 / Rf A 1/ Rf B Rf A Rf B DPS Inc. All rights reserved. 7

8 6mL カラム分離の難しさカラムの最適サンプル量 < 1.5 難しい ( 精密分離向け ) = 標準的 > 4 簡単 ( 粗精製向け ) 負荷量範囲 3 21 mg mg mg は 6 ページ Rf 値とカラムサイズ溶媒比の関係をご参照ください 1CV の容量 [ml] 最適流速おすすめ流速目安となる 1 秒間の液滴数 6 ml 2 ~ 4 ml/min 1 ~ 2 滴 / 秒ゆっくり流すと高分離能早く流すと分離能が低下傾向時間優先 or 分離能優先で選んでください秒間液滴数はカラム出口からの液滴の落ちる速度目安としてください Rf 値とカラム出口総液量の目安 Rf 値カラム出口総液量 60mL 30mL 19.8mL 15mL 12mL 9.9mL 8.4mL 7.5mL 6.6mL 6mL Rf= の成分はそれぞれ7.5mL 12mL 19.8mL 付近でカラム出口からフラクション回収できる 6mL 時点から1mLずつ回収すれば Rf=0.5~1.0の成分をある程度分けることができる難しい場合はカラムを連結する DPS Inc. All rights reserved. 8

9 12mL カラム分離の難しさカラムの最適サンプル量 < 1.5 難しい ( 精密分離向け ) = 標準的 > 4 簡単 ( 粗精製向け ) 負荷量範囲 6 42 mg mg mg 1CV の容量 [ml] 最適流速おすすめ流速目安となる 1 秒間の液滴数 12 ml 3 ~ 6 ml/min 1 ~ 3 滴 / 秒ゆっくり流すと高分離能早く流すと分離能が低下傾向時間優先 or 分離能優先で選んでください秒間液滴数はカラム出口からの液滴の落ちる速度目安としてください Rf 値とカラム出口総液量の目安 Rf 値カラム出口総液量 120mL 60mL 40mL 30mL 24mL 20mL 17mL 15mL 13mL 12mL Rf= の成分はそれぞれ15mL 24mL 40mL 付近でカラム出口からフラクション回収できる 12mL 時点から2mLずつ回収すれば Rf=0.5~1.0の成分をある程度分けることができる難しい場合はカラムを連結する DPS Inc. All rights reserved. 9

10 12g カートリッジ分離の難しさカラムの最適サンプル量 < 1.5 難しい ( 精密分離向け ) = 標準的 > 4 簡単 ( 粗精製向け ) 負荷量範囲 mg mg mg は 6 ページ Rf 値とカラムサイズ溶媒比の関係をご参照ください 1CV の容量 [ml] 最適流速おすすめ流速目安となる 1 秒間の液滴数 26 ml 5 ~ 10 ml/min 3 ~ 6 滴 / 秒ゆっくり流すと高分離能早く流すと分離能が低下傾向時間優先 or 分離能優先で選んでください秒間液滴数はカラム出口からの液滴の落ちる速度目安としてください Rf 値とカラム出口総液量の目安 Rf 値カラム出口総液量 260mL 130mL 86mL 65mL 52mL 43mL 36mL 33mL 29mL 26mL Rf= の成分はそれぞれ33mL 52mL 86mL 付近でカラム出口からフラクション回収できる 26mL 時点から3mLずつ回収すれば Rf=0.5~1.0の成分をある程度分けることができる難しい場合はカラムを連結する DPS Inc. All rights reserved. 10

11 25g カートリッジ分離の難しさカラムの最適サンプル量 < 1.5 難しい ( 精密分離向け ) = 標準的 > 4 簡単 ( 粗精製向け ) 負荷量範囲 mg mg mg 1CV の容量 [ml] 最適流速おすすめ流速目安となる 1 秒間の液滴数 41 ml 5 ~ 10 ml/min 3 ~ 6 滴 / 秒ゆっくり流すと高分離能早く流すと分離能が低下傾向時間優先 or 分離能優先で選んでください秒間液滴数はカラム出口からの液滴の落ちる速度目安としてください Rf 値とカラム出口総液量の目安 Rf 値カラム出口総液量 410mL 205mL 135mL 103mL 82mL 68mL 57mL 51mL 45mL 41mL Rf= の成分はそれぞれ51mL 82mL 135mL 付近でカラム出口からフラクション回収できる 41mL 時点から5mLずつ回収すれば Rf=0.5~1.0の成分をある程度分けることができる難しい場合はカラムを連結する DPS Inc. All rights reserved. 11

12 40g カートリッジ分離の難しさカラムの最適サンプル量 < 1.5 難しい ( 精密分離向け ) = 標準的 > 4 簡単 ( 粗精製向け ) 負荷量範囲 mg mg 1 4 g 1CV の容量 [ml] 最適流速おすすめ流速目安となる 1 秒間の液滴数 69 ml 8 ~ 17 ml/min 5 ~ 10 滴 / 秒ゆっくり流すと高分離能早く流すと分離能が低下傾向時間優先 or 分離能優先で選んでください秒間液滴数はカラム出口からの液滴の落ちる速度目安としてください Rf 値とカラム出口総液量の目安 Rf 値カラム出口総液量 690mL 345mL 228mL 173mL 138mL 114mL 97mL 86mL 76mL 69mL Rf= の成分はそれぞれ86mL 138mL 228mL 付近でカラム出口からフラクション回収できる 69mL 時点から8mLずつ回収すれば Rf=0.5~1.0の成分をある程度分けることができる難しい場合はカラムを連結する DPS Inc. All rights reserved. 12

13 120g カートリッジ分離の難しさカラムの最適サンプル量 < 1.5 難しい ( 精密分離向け ) = 標準的 > 4 簡単 ( 粗精製向け ) 負荷量範囲 g g 3 12 g は 6 ページ Rf 値とカラムサイズ溶媒比の関係をご参照ください 1CV の容量 [ml] 最適流速おすすめ流速試験管に 15mL 溜める秒数 205 ml 15 ~ 31 ml/min 30 ~ 60 秒ゆっくり流すと高分離能早く流すと分離能が低下傾向時間優先 or 分離能優先で選んでください秒間液滴数はカラム出口からの液滴の落ちる速度目安としてください Rf 値とカラム出口総液量の目安 Rf 値カラム出口 2050mL 1025mL 677mL 513mL 410mL 338mL 287mL 256mL 226mL 210mL 総液量 Rf= の成分はそれぞれ256mL 410mL 677mL 付近でカラム出口からフラクション回収できる 210mL 時点から15mLずつ回収すれば Rf=0.5~1.0の成分をある程度分けることができる DPS Inc. All rights reserved. 13

14 330g カートリッジ分離の難しさカラムの最適サンプル量 < 1.5 難しい ( 精密分離向け ) = 標準的 > 4 簡単 ( 粗精製向け ) 負荷量範囲 g g g 1CV の容量 [ml] 最適流速おすすめ流速試験管に 25mL 溜める秒数 574 ml 40 ~ 85 ml/min 12 ~ 25 秒ゆっくり流すと高分離能早く流すと分離能が低下傾向時間優先 or 分離能優先で選んでください秒間液滴数はカラム出口からの液滴の落ちる速度目安としてください Rf 値とカラム出口総液量の目安 Rf 値カラム出口 5740mL 2870mL 1894mL 1435mL 1148mL 947mL 804mL 718mL 631mL 574mL 総液量 Rf= の成分はそれぞれ718mL 1148mL 1894mL 付近でカラム出口からフラクション回収できる 574mL 時点から50mLずつ回収すれば Rf=0.5~1.0の成分をある程度分けることができる DPS Inc. All rights reserved. 14

15 負荷量最適流速フラクション量カラム体積 100mL あたりカラムの最適サンプル量 < 1.5 高分解能 ( チャレンジャー ) = 普通 > 4 粗精製 ( 簡単 ) 負荷量範囲 mg mg mg 最適流速 ( カラム管内径 ) カラム直径おすすめ流速目安となる1 秒間の液滴数 Φ10 mm 2.5 ml/min 1 滴 / 秒 Φ15 mm 5 ml/min 3 滴 / 秒 Φ20 mm 9 ml/min 5 滴 / 秒 Φ30 mm 21 ml/min 12 滴 / 秒ゆっくり流すと高分離能早く流すと分離能が低下傾向時間優先 or 分離能優先で選んでください Rf 値カラム出口総液量 Rf 値とカラム出口総液量の目安 1000mL 500mL 330mL 250mL 200mL 165mL 140mL 125mL 110mL 100mL Rf= の成分はそれぞれ125mL 200mL 330mL 付近でカラム出口からフラクション回収できる 100mL 時点から10mLずつ回収すれば Rf=0.5~1.0の成分をある程度分けることができる難しい場合は粉体を高く積む DPS Inc. All rights reserved. 15

16 ( 一覧表 ) カラムサイズ負荷量流速の関係規格 CV 容量 [ml] おすすめ流速オープン6mL 3 21 mg mg mg 6 ml 2 ~ 4 ml/min オープン12mL 6 42 mg mg mg 12 ml 3 ~ 6 ml/min 12g ートリッジ mg mg mg 26 ml 5 ~ 10 ml/min 25gカートリッジ mg mg mg 41 ml 5 ~ 10 ml/min 40gカートリッジ mg mg 1 4 g 69 ml 8 ~ 17 ml/min 120gカートリッジ g g 3 12 g 205 ml 15 ~ 31 ml/min 330gカートリッジ g g g 574 ml 40 ~ 85 ml/min 容量 100mL あたり mg g g 100 ml n/d ゆっくり流すと高分離能早く流すと分離能が低下傾向時間優先 or 分離能優先かで決めてください適正流速を 2 倍近く超えても使用可能です DPS Inc. All rights reserved. 16

17 ( 一覧表 )Rf 値とカラム出口総液量の目安カラムタイプ規格 Rf 値カラム出口総液量 [ml] オープンカートリッジルアー接続型ロングカラム 6mL mL g g g g g 例えば6mLカートリッジの場合 Rf= の成分はそれぞれ7.5mL 12mL 19.8mL 付近でカラム出口からフラクション回収 6mL 時点から1mLずつ回収すれば Rf=0.5~1.0の成分をある程度分けることができる難しい場合はカラムを連結するか粉体を高く積む TLC とカラムは相関していますが溶媒の微妙な比率や温度でも変わりますあくまでもフラクション回収の目安としてお考え下さい DPS Inc. All rights reserved. 17

すとき, モサプリドのピーク面積の相対標準偏差は 2.0% 以下である. * 表示量溶出規格規定時間溶出率 10mg/g 45 分 70% 以上 * モサプリドクエン酸塩無水物としてモサプリドクエン酸塩標準品 C 21 H 25 ClFN 3 O 3 C 6 H 8 O 7 :

すとき, モサプリドのピーク面積の相対標準偏差は 2.0% 以下である. * 表示量溶出規格規定時間溶出率 10mg/g 45 分 70% 以上 * モサプリドクエン酸塩無水物としてモサプリドクエン酸塩標準品 C 21 H 25 ClFN 3 O 3 C 6 H 8 O 7 : モサプリドクエン酸塩散 Mosapride Citrate Powder 溶出性 6.10 本品の表示量に従いモサプリドクエン酸塩無水物 (C 21 H 25 ClFN 3 O 3 C 6 H 8 O 7 ) 約 2.5mgに対応する量を精密に量り, 試験液に溶出試験第 2 液 900mLを用い, パドル法により, 毎分 50 回転で試験を行う. 溶出試験を開始し, 規定時間後, 溶出液 20mL