酵素消化低分子化フコイダン抽出物の抗ガン作用増強法の開発

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あゆみおなか
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1 LMF 研究会低分子化フコイダンの抗腫瘍効果に関する最新研究平成 25 年 2 月 23 日九州大学大学院農学研究院生命機能科学部門システム生物学講座細胞制御工学分野白畑實隆

2 現在のガンの治療とその課題外科的療法再発や免疫力低下の可能性進行度合いによる限界放射線療法ガンの種類による感受性の違い治療に時間を要する抗ガン剤療法副作用薬剤耐性の問題機能性食品などを用いた補完代替医療治療の効果を増強させることが狙いしかし有効性や作用メカニズムが十分明らかになっていない

3 酵素消化低分子化フコイダン抽出物の細胞表面糖鎖構造変化を伴うガン細胞死誘導効果

4 フコイダンワカメコンブモズクなどの褐藻類から抽出される硫酸化多糖の一種主に L- フコースが α1-3 結合で数十から数十万個も結合した化合物で平均分子量は約 2,~3, OH CH 3 O O フコイダン (Fucoidan) O O CH 3 OH HO 3 SO O O CH 3 OH HO 3 SO CO 2 H O O O CH 3 OH OH OH OH OH フコイダンの基本構造フコイダンによる主な抗腫瘍効果 O アポトーシス誘導作用免疫賦活作用血管新生抑制作用

5 目的ガン化ガン細胞の悪性化に伴い糖鎖発現あるいは糖鎖構造が変化することが報告されているガン化悪性化 Malignant alteration Change of sugar chain structures 正常細胞ガン細胞悪性化したガン細胞糖鎖ガン細胞? フコイダンフコイダンのガン細胞死誘導効果の検証ガン細胞表面糖鎖構造に及ぼす効果ならびにその作用メカニズムの解析!

酵素消化低分子フコイダン抽出物 Preparation トンガ王国産モズク有機酸抽出 / 脱塩処理高分子フコイダン ( 分子量 : 約 2 万 ~3 万 ) グリコシダーゼ処理トンガ王国産モズク (Cladosiphon novae-caledniae Kylin) 酵素消化低分子化フコイダン抽出物 (

6 酵素消化低分子フコイダン抽出物 Preparation トンガ王国産モズク有機酸抽出 / 脱塩処理高分子フコイダン ( 分子量 : 約 2 万 ~3 万 ) グリコシダーゼ処理トンガ王国産モズク (Cladosiphon novae-caledniae Kylin) 酵素消化低分子化フコイダン抽出物 ( 分子量 : 約 5) (Fucoidan Extract : FE) Components Fucose 62.1 % Xylose 1.5 % Mannose 6. % Glucose 3.5 % Galactose 3.3 % Uronic acid 14.6 % Sulfate group 14.5 %

7 糖鎖の分岐度の評価高度な分岐構造 ( 悪性 ) 分岐構造の減少? PHA-L4 PHA-L4 減少? Con A FE 処理 Con A 増加? FE 処理 :Mannose :N-acetylglucosamine :β-1,6-glcnac

8 FE の各種ガン細胞への細胞死誘導効果の検証使用した細胞ヒト線維肉腫由来細胞株 HT18 ヒト肺腺ガン由来細胞株 A549 正常ヒト線維芽細胞 TIG-1 2x1 4 cells/ml で播種実験方法各濃度 FE 添加 MEM 培地と交換 Incubation (24 h 前培養 ) Cell counter で細胞数測定 (5 日間 ) Incubation day 1 day 2 day 3 day 4 day 5 day

9 Cell number (x1-3 cells/ml) FE のガン細胞死誘導効果 1 HT18 1 A549 1 TIG Day Day Day Cancer cells Nomal cells FE 処理によるガン細胞への細胞死誘導効果が確認された正常細胞においては多少増殖が抑えられるものの細胞数の減少は確認されなかった

10 実験方法 FE による細胞表面糖鎖構造変化の解析使用した細胞ヒト線維肉腫由来細胞株 HT18 ヒト肺腺ガン由来細胞株 A549 正常ヒト線維芽細胞 TIG-1 IN Cell Analyzer 1 測定で用いた蛍光試薬 Hoechst solution FITC-Casein (Control) FITC-Con A FITC-PHA-L4 各濃度 FE 添加 MEM 培地と交換 IN Cell Analyzer 1 測定 Incubation (24 h 前培養 ) Incubation 各種レクチン h 48 h

11 FITC fluorescence intensity FITC-PHA-L4 FITC-Con A Cell number (cells/5 fields) Cell area mean (mm 2 ) FITC-Casein FE による HT18 細胞の細胞表面糖鎖構造変化 FE mg/ml FE mg/ml 1. mg/ml FE mg/ml

12 FITC fluorescence intensity FITC-PHA-L4 FITC-Con A Cell number (cells/5 fields) Cell area mean (mm 2 ) FITC-Casein FE による A549 細胞の細胞表面糖鎖構造変化 FE mg/ml FE mg/ml 1. mg/ml FE mg/ml

13 FITC fluorescence intensity FITC-PHA-L4 FITC-Con A Cell number (cells/5 fields) Cell area mean (mm 2 ) FITC-Casein FE による正常細胞 TIG-1 の細胞表面糖鎖構造変化 4 25 FE mg/ml 1. mg/ml FE mg/ml FE mg/ml

5 mg/ml 各濃度 FE 添加 MEM 培地 Incubation (24 h 前培養 ) Incubation Protein

14 実験方法 FE による細胞タンパク質糖鎖構造変化の解析使用した細胞ヒト線維肉腫由来細胞株 HT18 ヒト肺腺ガン由来細胞株 A549 正常ヒト線維芽細胞 TIG-1 生育に影響の出ない最大濃度.2-.3 mg/ml.5 mg/ml.5 mg/ml 各濃度 FE 添加 MEM 培地 Incubation (24 h 前培養 ) Incubation Protein extraction 各レクチン Western blotting (Lectin blot) HRP-Con A HRP-PHA-L4 LAS-1 で測定 h 24 h 48 h

15 PHA-L4/b-actin Con A/b-actin HT18 細胞のタンパク質糖鎖構造変化 HRP-Con A HRP-PHA-L4 12 kd FE.25.3 mg/ml b-actin 8 FE mg/ml FE 処理によって濃度依存的にCon Aの結合が増加し PHA-L4の結合が減少する傾向を示した FE.25.3 mg/ml

16 PHA-L4/b-actin Con A/b-actin A549 細胞のタンパク質糖鎖構造変化 HRP-Con A HRP-PHA-L4 kd b-actin 1 FE.5 mg/ml FE.5. 5 mg/ml 8 FE 処理によって 6 Con A の結合が増加する傾向を 4 示し PHA-L4 の結合が減少する 2 傾向を示した FE.5 mg/ml

17 PHA-L4/b-actin Con A/b-actin 正常細胞 TIG-1 のタンパク質糖鎖構造変化 HRP-Con A HRP-PHA-L4 kd FE.5 mg/ml b-actin FE.5. 5 mg/ml FE 処理によって 6 Con A 及び PHA-L4 の結合が 4 減少する傾向を示した 2 FE.5 mg/ml

総括 FEはガン細胞に細胞死を誘導する正常細胞では増殖は抑制するが細胞死までは誘導しない FE 処理によってガン細胞のCon A 結合型糖鎖の発現の増加及びPHA-L4 結合型糖鎖の発現の減少傾向が確認された FEにより細胞表面糖鎖のN- 型糖鎖の分岐が減少したことでマンノースが露出したことを示している正常細胞では FE

18 総括 FEはガン細胞に細胞死を誘導する正常細胞では増殖は抑制するが細胞死までは誘導しない FE 処理によってガン細胞のCon A 結合型糖鎖の発現の増加及びPHA-L4 結合型糖鎖の発現の減少傾向が確認された FEにより細胞表面糖鎖のN- 型糖鎖の分岐が減少したことでマンノースが露出したことを示している正常細胞では FE 処理による糖鎖発現の傾向はガン細胞のものとは異なる FEによる一連の細胞表面糖鎖構造の変化はガン細胞において見られる Malignant alteration PHA-L4 FE treatment Con A :Mannose :N-acetylglucosamine PHA-L4 Con A PHA-L4 Con A :β-1,6-glcnac

19 酵素消化低分子化フコイダン抽出物と抗ガン剤との併用による抗腫瘍作用増強効果

20 実験に用いている抗ガン剤についてカルボプラチン (CBDCA) 抗腫瘍効果のメカニズムはシスプラチンとほぼ同じでガン細胞の 2 本の DNA 鎖と結合することで DNA の複製を阻害してガン細胞を死滅させるパクリタキセル (PAC) 微小管に結合して安定化させ脱重合を阻害することでガン細胞の分裂を阻害する 5- フルオロウラシル (5-FU) 細胞が分裂増殖する際に必要な代謝物質の代わりにガン細胞に取り込まれることでその DNA の合成を阻害するという特徴を持つ

21 目的抗ガン剤と FE 併用による抗腫瘍作用増強効果の検討 FE による抗ガン剤由来細胞死からの正常細胞保護効果検討

22 実験方法 A549 細胞 ( ヒト肺腺ガン細胞 ) TIG-1 細胞 ( ヒト線維芽細胞 ) 播種 24 時間前培養 FE 抗ガン剤処理 48 時間培養 IN Cell Analyzer 1 Hoechst 染色後 IN Cell Analyzer 1 を用いて解析 WST-1 染色後細胞の代謝活性を測定

23 A549 細胞における FE の効果 (CBDCA) 細胞生存率 CBDCA (17 μg/ml)+fe (.2,.4 mg/ml) WST-1 CBDCA (17 μg/ml)+fe (.2,.4 mg/ml) CBDCA (552 μg/ml)+fe (.2,.4 mg/ml) CBDCA (552 μg/ml)+fe (.2,.4 mg/ml)

24 A549 細胞における FE の効果 (5-FU) 細胞生存率 WST-1 5FU (19 μg/ml)+fe (.2,.4 mg/ml) 5FU (19 μg/ml)+fe (.2,.4 mg/ml) 5FU (5 μg/ml)+fe (.2,.4 mg/ml) 5FU (5 μg/ml)+fe (.2,.4 mg/ml)

25 A549 細胞における FE の効果 (PAC) 細胞生存率 WST-1 PAC (.3 μg/ml)+fe (.2,.4 mg/ml) PAC (.3 μg/ml)+fe (.2,.4 mg/ml) PAC (.6 μg/ml)+fe (.2,.4 mg/ml) PAC (.6 μg/ml)+fe (.2,.4 mg/ml)

26 TIG-1 細胞における FE の効果 (CBDCA) 細胞生存率 CBDCA (5 mg/ml)+fe (.2,.4 mg/ml) WST-1 CBDCA (5 mg/ml)+fe (.2,.4 mg/ml) CBDCA (1 mg/ml)+fe (.2,.4 mg/ml) CBDCA (1 mg/ml)+fe (.2,.4 mg/ml)

27 TIG-1 細胞における FE の効果 (5FU) 細胞生存率 WST-1 5-FU (5 mg/ml)+fe (.2,.4 mg/ml) 5-FU (5 mg/ml)+fe (.2,.4 mg/ml) 5-FU (1 mg/ml)+fe (.2,.4 mg/ml) 5-FU (1 mg/ml)+fe (.2,.4 mg/ml)

28 TIG-1 細胞における FE の効果 (PAC) 細胞生存率 Pac (2.4 μg/ml)+fe (.2,.4 mg/ml) WST-1 Pac (2.4 μg/ml)+fe (.2,.4 mg/ml) PAC (8.6 μg/ml)+fe (.2,.4 mg/ml) Pac (8.6 μg/ml)+fe (.2,.4 mg/ml)

29 小括 A549 細胞 FE 及び各種抗ガン剤の併用処理において FE 処理濃度 (.2 mg/ml.4 mg/ml) 依存的に抗腫瘍作用増強効果を確認することができた TIG-1 細胞 FE を併用することにより CBDCA 及び 5-FU による細胞毒性軽減効果を確認することができた PAC に関しては FE による細胞毒性軽減効果は見られず逆に細胞毒性を強める結果となった

30 実験方法 A549 細胞 ( ヒト肺腺ガン細胞 ) TIG-1 細胞 ( ヒト線維芽細胞 ) 播種 24 時間前培養 FE 抗ガン剤処理 48 時間培養測定タンパク質 Cdc2: cell division cycle 2 細胞周期の G1/S と G2/M の移行に不可欠の M 期促進因子リン酸化されると M 期への移行が阻害される p53: リン酸化された p53 タンパク質は DNA の損傷をチェックして細胞周期を停止させるライセート回収後ウェスタンブロッティングにより検討

A549 細胞における細胞周期関連タンパク質の発現 p-cdc2 (34kD) CBDCA 5-FU PAC β-actin (47kD) CBDCA (μg/ml) 1.9.8.7.6.5.4.3.2.1 552 552 552 FE (mg/ml) -.

31 A549 細胞における細胞周期関連タンパク質の発現 p-cdc2 (34kD) CBDCA 5-FU PAC β-actin (47kD) CBDCA (μg/ml) FE (mg/ml) FU (μg/ml) 5 FE (mg/ml) PAC (μg/ml) FE (mg/ml) p-cdc2/β-actin

TIG-1 細胞における細胞周期関連タンパク質の発現 p-p53 (53kD) CBDCA p-cdc2 (34kD) CBDCA PAC β-actin (47kD).9.8.7.6.5.4.3.2.1.6.5.4.3.2.1 CBDCA (mg/ml) 5 5 5 CBDCA (mg/ml) 5 5 5 PAC (μg/ml) 2.

32 TIG-1 細胞における細胞周期関連タンパク質の発現 p-p53 (53kD) CBDCA p-cdc2 (34kD) CBDCA PAC β-actin (47kD) CBDCA (mg/ml) CBDCA (mg/ml) PAC (μg/ml) FE (mg/ml) FE (mg/ml) FE (mg/ml) p-p53/β-actin p-cdc2/β-actin

33 小括 A549 細胞 FE 及び各種抗ガン剤との併用において細胞周期関連タンパク質である p-cdc2 の上昇が確認できた PAC に関しては FE の濃度依存的に p-cdc2 の上昇が確認できた TIG-1 細胞 FE 及び CBDCA(5 mg/ml) との併用において FE 濃度依存的に p-p53 の減少を確認することができた FE 及び CBDCA PAC との併用において p-cdc2 の発現がほとんど見られなかった

34 総括 A549 細胞 FE 及び各種抗ガン剤との併用において抗腫瘍作用増強効果が確認できた細胞周期関連タンパク質である cdc2 のリン酸化上昇がこの現象の原因の一つとして考えられる臨床において化学療法の 1 つとして各種抗ガン剤を使用する際に FE を併用することで抗ガン作用を増強させる可能性が示唆された TIG-1 細胞 FE 及び CBDCA 5-FU との併用において細胞毒性軽減効果ができた CBDCA に関しては FE を併用させることによる p53 cdc2 のリン酸化減少が原因の一部であると考えられる 5-FU に関しても同様のことが示唆された PAC に関しては FE を併用させることにより cdc2 のリン酸化減少を確認することができたがそれ以上に違う経路における細胞毒性が強く出ているため細胞保護効果が示されないと考える

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Disclosure Information Name of Meeting Name of Speaker 酵素消化低分子化フコイダン抽出物による癌細胞特異的細胞死及び糖鎖合成経路の改変誘導 Kiichiro Teruya 1, Sanetaka Shirahata 1, Toshihiro Yoshida 2 (1. Dept. Biosci. and Biotech., Fac. Agr., Kyushu Univ., 2. Yoshida Clinic) 背景細胞表面に発現している糖鎖は免疫機能や恒常性維持機能のいずれにも密接に関与している