STAP現象の検証の実施について

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ときかたづ
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1 STAP 現象の検証の実施について実験総括責任者 : 独立行政法人理化学研究所発生再生科学総合研究センター特別顧問 ( 相澤研究ユニット研究ユニットリーダー兼務 ) 相澤慎一研究実施責任者 : 独立行政法人理化学研究所発生再生科学総合研究センター多能性幹細胞研究プロジェクトプロジェクトリーダー丹羽仁史 2014 年 4 月 7 日独立行政法人理化学研究所 1

2 検証実験の目的 STAP 現象が存在するか否かを一から検証する論文に記載された方法で再現性を検証する ( リンパ球からの多能性細胞誘導の検証 ) 論文に記載された方法とは異なるより厳密な細胞追跡法を用い STAP 現象の有無を検証する (Cre loxp システムを用いた検証 ) 2

3 STAP 現象 = 分化細胞が刺激によってリプログラミングされ多能性を獲得する現象 ( 論文の主張 ) 分化細胞 STAP 細胞塊 STAP 幹細胞 FI 細胞 ( リンパ球など ) (ES 細胞様 ) キメラ寄与能胎児胎盤自己複製能 3

4 多能性の厳密な評価 = 胚盤胞注入によるキメラ胚形成能 4 倍体キメラ法では注入した細胞のみにより胚が形成されるキメラ胚形成はテラトーマ形成よりもより厳密な多能性の評価法とされる (Obokata et al, Nature, 2014) 4

5 ES 細胞は分化転換されない限り胎盤には寄与できない LIF ES 細胞 -Oct3/4 +Cdx2 TS 細胞 FGF4 (Niwa, H. et al, Cell, 2005) 5

6 ( 参考 ) 胎児と胎盤に寄与する幹細胞の報告 ES 細胞に含まれる亜集団 ( 全体の約 2%) を蛍光遺伝子マーカーを導入して識別して回収しこれらを胚盤胞に注入すると胎児と胎盤に寄与する (Macfarlan et al, Nature, 2012) 遺伝子マーカーの導入なしには回収できず分離した亜集団は安定に培養できない特殊な環境で誘導した ips 細胞を胚盤胞に注入すると胎児と胎盤に寄与する (Abad et al, Nature, 2013) 6

7 STAP 細胞誘導手順の検討 1 週令マウスから再現性よく一定時間でリンパ球を調製することないしは組織から分散した単一細胞を調製すること自体が熟練を要するトランスジェニックマウスの安定供給酸処理 HCl 細ガラス管通過 (trituration 法 ) Vacanti protocolでは酸処理と併用 (Obokata et al, Nature, 2014) 7

8 分化した細胞から STAP 現象により多能性細胞が生じる事の証明方法分化細胞 ( リンパ球など ) STAP 細胞塊 STAP 幹細胞 (ES 細胞様 ) 分化した細胞を特異的に標識する分化した細胞由来である事を示す標識の検出 8

9 T 細胞受容体遺伝子再構成 = ゲノムに残る分化細胞の証拠 1 週令マウス脾臓由来 CD45 陽性血液細胞の10 20% がT 細胞でそのうち 10 20% が T 細胞受容体遺伝子再構成を持つ ( 全 CD45 陽性細胞の1 4% がT 細胞受容体遺伝子再構成を持つ ) これは決して効率のよい指標ではなく他の指標を用いた検証を併用する事が望ましい (Obokata et al, Nature, 2014) 9

10 STAP 細胞が出来る過程 ( 論文に基づく仮説 ) CD45 陽性血液細胞生存細胞リプログラムされた細胞 STAP 細胞塊 B cell T cell macrophages others 細胞死リプログラミング (70%) (50%) 細胞塊形成細胞数 STAP 細胞は細胞塊 ( クラスター ) として得られる細胞塊には T 細胞受容体遺伝子再構成を持たない細胞も多く含まれる 10

11 キメラ胚で T 細胞受容体遺伝子再構成を検出できる確率は低い small aggregates of STAP cells 胚盤胞注入キメラ胚 Origin STAP 細胞塊 Mechanical dissection? B cell T cell macrophages others?? Relative cell numbers clones per embryo 11

12 再構成されたT 細胞受容体遺伝子を持つSTAP 幹細胞が得られる確率は低い small aggregates of STAP cells Culture in ACTH medium STAP 幹細胞 Origin STAP 細胞塊 Mechanical dissection? B cell T cell macrophages others?? Relative cell numbers

13 血液細胞の中でも STAP 細胞誘導効率に差があるかもしれない T 細胞に限定した評価は真偽を確定するためには不十分 (Obokata et al, Nature, 2014) 13

14 心筋からの STAP 細胞誘導 (Obokata et al, Nature, 2014) 14

15 血液細胞以外の酸処理による STAP 細胞誘導 (Obokata et al, Nature, 2014) 15

16 分化細胞特異的 Cre 組み換え酵素発現による恒常的子孫細胞追跡法 ( アルブミン遺伝子発現を指標とした肝細胞の標識化を例とした ) トランスジェニックマウスの交配恒常的に GFP を発現する肝細胞を含む肝臓を採取単一細胞に分散 Albumin promoter Cre recombinase pa Rosa promoter PGKneopA EGFP pa Albumin CreTg Rosa loxp STOP loxp GFP Tg STAP 細胞化肝細胞でのみ肝細胞でのみ loxp 配列 Creが発現の組み換えが起こりGFP が恒常的に発現小細胞塊の胚盤胞への注入 Rosa loxp GFP Tg Rosa promoter EGFP pa 肝細胞でのみ GFP を発現するマウスキメラ胚における三胚葉への寄与の検証 16

17 使用を予定する遺伝子改変マウス系統 Nkx2.5 Cre ( 心筋細胞特異的に発現 ) Albumin Cre ( 肝細胞特異的に発現 ) Rosa26 loxp STOP loxp 蛍光遺伝子 ( 変異マウス開発ユニットで作成済み ) Abe et al, Genesis, 2011 その他の組織特異的 Cre 発現マウスについても検討中 17

18 STAP 幹細胞作成を経た多能性獲得の検証 ES 細胞様の形態増殖能の獲得 2N 胎児キメラ形成能 4N (Obokata et al, Nature, 2014) 18

19 研究実施スケジュール ( 予定 ) T 細胞胞受容体遺伝子子再構成を指標とした追追跡 CD45 陽性細胞などの分化細胞からの STAP 様細胞の誘導 STAP 様細胞のキメラ寄与能の検証 STAP 様細胞からの STAP 幹細胞作製の検証 STAP 幹細胞のキメラ寄与能の検証分化細胞特異的にCre を発現するマウスの入手と交配 Cre loxp を用用いた厳密な細胞胞追跡分化細胞標識の検証分化細胞標識マウスからのSTAP 様細胞の誘導 STAP 様細胞のキメラ寄与能の検証 STAP 様細胞からの STAP 幹細胞作製の検証 STAP 幹細胞のキメラ寄与能の検証中間報告最終報告 19

20 研究実施体制理事長研究不正再発防止改革推進本部実験総括責任者 : 独立行政法人理化学研究所発生再生科学総合研究センター特別顧問 ( 相澤研究ユニット研究ユニットリーダー兼務 ) 相澤慎一研究実施責任者 : 独立行政法人理化学研究所発生再生科学総合研究センター多能性幹細胞研究プロジェクトプロジェクトリーダー丹羽仁史細胞培養に関わる実験は丹羽以下計 4 名が担当マウスに関わる実験は相澤以下計 2 名が担当 20

ＳＴＡＰ現象の検証結果

ＳＴＡＰ現象の検証結果 2014 年 12 月 19 日 STAP 現象の検証結果理化学研究所 1. これまでの経緯 STAP 現象の検証は 2014 年 1 月に英国科学誌 Nature に発表した 2 篇の研究論文 (7 月に撤回済み *) に記載された刺激による分化細胞の多能性誘導現象が存在するか否かを検証することを目的として 2014 年 4 月 1 日から 1 年間を期限に実験総括責任者に相澤慎一特任顧問