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1 QuantStudio 3D デジタル PCR system アプリケーション集 r141010

2 デジタル PCR が可能にするアプリケーション デジタル PCR は核酸の絶対定量を必要とするアプリケーションにおいて リアルタイム PCR の限界を超える能力を提供する画期的な技術です 標準曲線を必要とせず 高感度 高精度な絶対定量を可能にする技術は 複数の遺伝子間における発現量の比較やレアバリアントの検出 微量な濃度差を比較するようなアプリケーションにおいて 威力を発揮する新しい解析手法として期待されています QuantStudio 3D デジタル PCR システムは 微細な 20,000 個のウェルを持つチップを利用した新しいデジタル PCR システムです 1 サンプルあたり 20,000 データポイントを提供する新しいフォーマットは シンプルなワークフローを実現し 誰にでも利用できる新しい技術をお届けします

3 スライド # アプリケーション 1. 病原菌遺伝子の絶対定量 2. 標準物質の濃度測定 3. 体細胞変異の解析 4. CNV (Copy Number Variation) 解析 5. NGS ライブラリー定量 6. 融合遺伝子の正確な定量 7. エクソソーム内の mirna 発現定量 8. Pri-miRNA の絶対定量 9. デジタル PCR によるキメリズム解析 10. デジタル PCR によるハプロタイピング 11. User s Voice 1 乳がんの腫瘍マーカーとして期待される血中の微量 DNA 変異 加々良尚文先生 大城智弥先生 ( 大阪大学医学部乳腺 内分泌外科 ) 12. User s Voice 2 血栓性血小板減少性紫斑病の確実な遺伝子診断を目指して 小亀浩市先生 ( 国立循環器病研究センター分子病態部血栓止血研究室 )

4 病原菌遺伝子の絶対定量 デジタルPCRとリアルタイムPCRの相関性は非常に高い 植物に感染する病原菌遺伝子の定量 RNA 抽出 逆転写 植物の内在性遺伝子 + 病原菌遺伝子の定量 薬剤処理濃度の異なるサンプルで比較 qpcr のデータ qpcr と dpcr の相関性 リアルタイムPCR ( コピー数 /well ) 薬剤濃度 病原菌 内在性 病原菌 / 内在性 相対値 高 中 VIC: 内部標準 FAM: 病原菌 低 Control 薬剤濃度 薬剤濃度 薬剤濃度 Control 高 中 低 デジタル PCR ( コピー数 /chip) 薬剤濃度 病原菌 内在性 病原菌 / 内在性 相対値 高 中 低 Control 標準物質の濃度測定 デジタル PCR で標準物質の濃度を決定 濃度よりコピー数を算出し 10 倍希釈系列を作成し digital PCR で測定 600 塩基の核酸標準品 (DNA) NのサイトがA,T,G,Cの4 種類 増幅領域が99bpのAssayをデザイン 希釈系列の測定 10 希釈系列の測定 -7 Sample Dilution Copies/Rxn CI Copies/Rxn Copies/microliter CI Copies/microliter C2 1.00E データのご提供 : 独立行政法人産業技術総合研究所計測標準研究部門藤井紳一郎郎先生 C2 1.00E C2 1.00E デジタルPCRによる最終結果と他の手法 ( 同位体希釈質量分析法 ) との比較 同位体稀釈質量分析法 デジタル PCR (QS3D) certified value(ng/ul) copies/ul ng/ul D A E D C E D G E D T E *(copies/ul) is calculated by "(ng/ul) / MW

5 体細胞変異の解析 デジタル PCR は 1% 以下の体細胞変異を検出することが出来ます 反応液 分配 増幅 甲状腺がん メラノーマサンプルの BRAF V600E の検出 TaqMan SNP Genotyping Assays を使用 正常検体 メラノーマ (FFPE)5.57% デジタルPCR 各区画に分配されるため 野生型の干渉が減少する FAM 希少変異検出 甲状腺がん 0.72% 甲状腺がん ( 細針吸引 )0.19% リアルタイム PCR VIC リアルタイム PCR では 10% 以上変異型が存在しないと野生型の干渉により検出困難 3 CNV (Copy Number Variation) 解析 デジタル PCR はリアルタイム PCR の限界を超え 1,2 倍未満の違いも識別が可能 dpcr による CNV 解析 フラグメント内に duplication している場合 制限酵素処理が必要 制限酵素処理を行わないと 2 コピーが 1 コピーのように分配される dpcr は 1.2 倍未満の違いも識別が可能 Coriell Cell Repository から入手した代表的な 9 種類のゲノムパネルを使用 CCL3L1 遺伝子の CNV をデジタル PCR で解析 (TaqMan Copy Number Assay を利用 制限酵素処理 正しい分配が可能 過少評価される CCL3L1 コピー数を RnaseP コピー数で補正して算出 コピー数が 7 回と 8 回の違いであっても サンプルの間には明らかな統計学的有意差が認められる 各サンプルの Cv 値は 2.55% 以下で 再現性が高いことが示された 4

6 NGS ライブラリー定量 dpcr は 検量線を使用することなく 信頼性の高い絶対定量を可能にします Ion Torrentの4 種類のキットを用いて作製したライブラリーの定量を実施 (Ion DNA Fragment, Ion AmpliSeq Exome, Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel, Ion AmpliSeq Cancer HotSpot Panel Version2) Agilent 2100 Bioanalyzerによってサイズを測定 ( 約 100 ~ 700bpの範囲 ) さまざまな種類のライブラリーをdPCRで定量エラーバーが小さく 信頼性の高いデータを得ることができます 同じサンプルを反復 デジタル PCR による NGS ライブラリー定量のメリット デジタル PCR は 標準曲線やリファレンスサンプルが不要 サンプル数が少ない場合に 検量線が不要なので コスト削減が可能 マニュアル作業を最小限に抑えた簡単なワークフロー 完全にシールされた反応系でコンタミネーションのリスクを最小限に Ion Torrent Illuminaのライブラリーに対応したAssayを提供 dpcr と qpcr の相関図 dpcr で測定定した濃度 (nm) qpcrで測定した濃度 (nm) Ordering Info TaqMan Gene Expression Assays, Inventoried (250 反応 ) から 下表のTaqMan Assay ID を選択してください TaqMan Assay ID Ion Torrent Library Quantification Assay Ac _a1 Illumina Nextera Library Quantification Assay Ac _a1 Illumina TruSeq DNA/RNA Library Quantification Assay Ac _a1 Illumina TruSeq Small RNA Library Quantification Assay Ac _a1 TaqManR Assayのデザインの概略図 Probe FP RP Fwd Adapter Sequence of Interest Rev Adapter 5 融合遺伝子の正確な定量 デジタル PCR は 検量線を用いずに絶対定量を行います RNA シーケンスとデジタル PCR で 一歩進んだ発現解析を RNA シーケンスでスクリーニングした融合遺伝子のデジタル PCR による絶対定量 白血病細胞株 K562 由来のRNAを用い RNA シーケンスにより融合遺伝子のBreakpoint を含む配列情報を取得 機能未知の融合遺伝子を含む各融合遺伝子間の発現量を比較リアルタイムPCR デジタルPCR エラーバーも小さく 精度の高いリアルタイムPCRは 内在定量ができていることがわかる性コントロール (18S rrna 灰色の増幅曲線 ) との比較によって 発現量の強弱はある程度判別できるが 詳細は検量線を作成し 絶対定量をしないと分からない デジタル PCR は絶対値が得られるので 遺伝子間の比較が容易 融合遺伝子を検出する TaqMan Assay 設計例 Break point 上に TaqMan Assay を設計し 融合遺伝子を特異的に検出 Gene A Break point Gene B 6

7 エクソソーム内の mirna 発現定量 デジタル PCR は リファレンスサンプルや検量線を用いることなく 直接定量を行います シンプルなワークフローで エクソソーム中の mirna の絶対定量が可能 リアルタイム PCR 血清サンプル 0.5μL 中の mirna を解析 (mir320, let7a, mir143, mir145) 31.2 デジタル PCR 血清サンプル 0.5μL 中の mirna を解析 (mir320, let7a, mir143, mir145) 24.7 mir320 let7a mir mir145 mirna let7a を測定した QS3D チップの解析画面 合成 RNAを用いて 検量線を作製することは 非常に手間がかかり 安定したデータを得ることが困難 デジタルPCRは 検量線がなくても mirna の検出とコピー数の測定を同時に解析 7 Pri-miRNA の絶対定量 どの pri-mirna が mature mirna の発現上昇に寄与しているのか アルコール暴露による pri-mmu-mir 9-1, 9-2, 9-3 の発現変化 Locus A DNA Locus B pri-mirna mir-9-1 pre-mirna mir-9-2 mir-9 Mature mirna mir-9 Pri-mir-9-2 は他と比較して発現が高い Pri-mir-9-1 は長期のアルコール暴露で低下する Pri-mir-9-2 はアルコール暴露により上昇する Pri-mir-9-3 は短期のアルコール暴露には影響されないが長期暴露により上昇する 8

8 デジタル PCR によるキメリズム解析 デジタル PCR は高感度のキメリズム解析を可能とします 造血幹細胞移植後のキメリズム解析 レシピエント特異的遺伝子を検出するアッセイ (FAM) と β-globin アッセイ (VIC) のマルチプレックス レシピエント遺伝子コピー数 / 総コピー数でキメリズムの評価レシピエント特異的配列 FAM レシピエントサンプル VIC β-globin ( 内部標準 ) ドナーサンプル 再発例移植後 192 日 移植後日数 9 デジタル PCR によるハプロタイピング デジタル PCR は簡便なハプロタイピングを可能にします ハプロタイプを把握することにより 病気を正しく理解し適切な対処法をとることが可能となります 2 つの変異が同じアレルに存在する場合 2 つの変異が別アレルに存在する場合 10

9 QuantStudio 3D デジタル PCR system User s Voice 1 ライフテクノロジーズ情報誌 NEXT 2 月号 (2014 年 ) より抜粋

10 QuantStudio 3D デジタル PCR system User s Voice 2 ライフテクノロジーズ情報誌 NEXT 4 月号 (2014 年 ) より抜粋

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