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さやほうねん
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五十嵐研雑誌会 No. 1081 2010.12.17 D2 千葉洋子 TCA cycle は回転回転しているか?

1 五十嵐研雑誌会 No D2 千葉洋子 TCA cycle は回転回転しているか? Tricarboxylic acid (TCA) 回路は 1940 年 Hans Adolf Krebs により発表された (Krebs HA, 19401; Krebs HA, 19402) ハトの胸筋を用いた生化学試験により発見された本回路は 3 つのドメインにわたり存在し解糖糖新生アミノ酸合成などの生合成経路やエネルギー獲得経路を結び付ける炭素代謝の中心的なハブである TCA 回路は教科書的な酸化方向とは逆方向すなわち還元方向にも進むことが緑色硫黄細菌で提唱されおなじみの Hydrogenobacter は還元的 TCA 回路を用いて独立栄養的に増殖する加えて一部の生物の TCA 回路は不完全であったり両方向に流れていたりすることが明らかになってきた本雑誌会では 13 C 化合物を用いたトレーサー実験等から明らかになってきたいくつかの微生物の TCA 経路について最新の論文を紹介したいと思う Branched tricarboxylic acid metabolism in Plasmodium falciparum. Olszewski, K.L., Mather, M.W., Morrisey, J.M., Garcia, B.A., Vaidya, A.B., Rabinowitz, J.D., Llinas, M Nature. 466: 研究背景と目的 Plasmodium falciparum について P. falciparum はヒトのマラリアの原因である原虫である本原虫のミトコンドリアのゲノムサイズはこれまでに知られているものの中で最小であり機能を減らす方向に進化してきたと考えられている本原虫の生活環の中にヒトの赤血球内で増殖する赤血球期がある ( 右図 4) 赤血球期のマラリア原虫はほぼすべてのエネルギーを解糖系を用いた発酵により得ており TCA 回路電子伝達系は主要な ATP 供給源ではないと考えられているまたアミノ酸の de novo 生合成等を行わないので TCA 回路中間産物を生合成に必要とすることもないしかし本原虫は TCA 回路に必要な酵素遺伝子をすべて揃えており赤血球期出典京都薬科大学創薬科学系薬品化学分野 HP ( に転写している Citrate synthase orthologue, aconitase, isocitrate dehydrogenase(pfidh) はミトコンドリアに局在することが明らかになっており succinate dehydrogenase および 2-oxoglutarate (2-OG) dehydrogenase もミトコンドリアに存在することが示唆されているしかし解糖系と TCA 回路をつなぐ pyruvate dehydrogenase (PDH) 複合体はミトコンドリアではなく apicoplast という非光合成色素体様小器官に局在するしたがって本 PDH はグルコース由来の pyruvate から acetyl-coa を生成して 1

2 TCA 回路に供給するという教科書的な役割ではなく acetyl-coa を脂肪酸の伸長に供給する役割のみを有しているのではないかと考えられてきたそこで本研究は P. falciparum の TCA 回路の流れおよび acetyl-coa の行方について知見を得るため以下の実験を行った実験方法多くの生物において TCA 回路への主な炭素供給源はグルコースに加えて Asp, Asn(oxaloacetate; OAA として流入 ) Glu, Gln(2-OG として流入 ) であるそのためすべての C および N を安定同位体でラベルした U- 13 C-glucose, U- 13 C- 15 N-Asp または U- 13 C- 15 注 1) N-Gln を添加した培地を用いて宿主に感染させた赤血球期の P. falciparum を培養し細胞内の代謝産物のラベルパターンを分析した有機酸の分析には liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) 脂肪酸の分析には gas chromatography-ms (GC-MS) を用いた注 1) 細胞培養に一般に使われる RPMI Medium 種類のアミノ酸 (20mg/ L =0.15 mm Asp, 300 mg/ L =2.05 mm Glu) およびグルコース (2000 mg/ L =11.11 mm) ビタミン無機塩が含まれる結果 1 TCA 代謝産物の流れ U- 13 C-glucose を添加して培養した場合解糖系の中間産物は全て直ちにラベルされたが有機酸は限られたもののみがラベルされた (Fig. 1-1a) このうち C-malate および C-fumarate (+3 は 3 つの炭素がラベルされたことを示す ) は +3 phosphoenolpyruvate (PEP) に CO2 が付加して生じたと考えられる (Fig.1-2a) また 2-OG および succinate がラベルされなかったことからラベルされた malate と fumarate はミトコンドリアの TCA 回路ではなく細胞質で生成したことが示唆されるさらにアセチル基がラベルされた acetyl-coa も生じたがそのラベル化割合は非常に低かったことから pyruvate 以外にアセチル基への two-carbon unit の供給源があることが示唆された (Fig. 1-3a) なおごくわずかながら検出された +2 および C-citrate はアセチル基がラベルされた 13C-acetyl-CoA と非ラベルまたは C-OAA から作られたと考えられる U- 13 C- 15 N-Asp を添加して培養した場合も同様に C malate および fumarate が検出された (Fig. 1-2b) これらの結果からグルコースや Asp 由来の代謝産物はミトコンドリアの TCA 回路に流れていない可能性が示された U- 13 C- 15 N-Gln を添加して培養した場合 TCA 回路の中間産物全てでラベル化が認められた (Fig. 1-1a) 一般的な酸化方向の TCA 回路から予想されるように (Fig. 1-1b) C 2-OG および C succinate, fumarate, malate が検出された一方で citrate は C 型のもののみが検出されたこれは酸化方向の TCA 回路ではなく還元的 TCA 回路により C 2-OG に CO2 が付加して生じたと考えると説明がつく (Fig. 1-1c) 加えて C fumarate と malate および C-acetyl-CoA が検出されたことも還元的 TCA 回路の存在で説明できる 2 acetyl-coa の行方本生物における還元的 TCA 回路の役割を調べるため著者らは acetyl-coa のアセチル基の一般的かつ主な行き先である脂肪酸生合成系タンパク質修飾系および低分子アセチル化について調べた U- 13 C-glucose または U- 13 C- 15 N-Gln を添加して培養した本原虫のからラベル化された脂質は検出されなかったこれは赤血球期に脂肪酸の de novo 生合成は必要ないという知見と一致する一方で真核生物においてアセチル化される主なタンパク質であるヒストンの尾部は U- 13 C- 15 N-Gln 添加培養時のみ 56% もラベル化された (Fig. 1-3b) さらにマラリア発病に関連し小胞体でアセチル化され 2

3 る nucleotide amino sugar である UDP-N-acetyl-glucosamine (UDP-GlcNAc) は U- 13 C-glucose 添加培養時のみラベル化された (Fig. 1-3c) したがってマラリア原虫が 2 つの独立した acetyl-coa 代謝経路を有していることは明白であると著者らは主張している考察以上の 13 C トレーサー実験によりミトコンドリアの炭素代謝は分岐した構造を取っておりそれらの流れはどちらも malate に行きつくことが示唆されたまた malate が老廃物として赤血球外に排出されることも確認された (Fig. 1-4) そこで著者らは赤血球期のマラリア原虫の中心的炭素代謝経路について Fig. 1-5 に示すように新しいモデルを提唱した提唱された代謝経路においてミトコンドリアにおけるカルボン酸への炭素供給源は Gln および Glu でありその炭素フラックスは 2 本の枝からなる 1 本目の枝は還元的 TCA 回路の一部であり 2 本目の枝は酸化的 TCA 回路の一部である Malate および fumarate はどちらの流れからも生じると考えられるこの分岐した TCA 代謝はこれまでに提唱されているものと根本的に異なると著者らは主張しているなぜならこれまでにも真核生物において TCA 回路の一部が還元的に反応することは知られていたがそれらの系では同時に完全な酸化的 TCA 回路が機能しているのに対し本 TCA 代謝は完全に分岐しているからであるこの分岐した TCA 経路は宿主細胞の環境に特化するために代謝経路の柔軟性を失ったという進化的なトレードオフの結果であると考えられるヒトの血流にはグルコースが恒常的かつ豊富に存在するのでマラリア原虫は glucose をエネルギー源として利用する一方で血漿中に高濃度 ( 約 0.5 mm) 存在する Gln は C5 化合物 (Succinyl-CoA や C2 acetyl unit など ) の骨格としてすぐに使用可能である著者らは本代謝系は中心的代謝経路が特別な環境のニッチに適応するため著しい進化を遂げた明白な例だと締めくくっている補足 : Isocitrate dehydrogenase (IDH) の触媒方向ヒトのミトコンドリアには 2 種類の isocitrate dehydrogenase (IDH) が存在するひとつは NAD 依存型で酸化方向に働きもう一つの NADP 依存型が還元方向に働くマラリア原虫のゲノム上には NADP 依存型の IDH しかコードされておらずまた本菌体内には NADPH が豊富に存在することから IDH は還元方向のみに働いていると考えられる ATP-dependent citrate lyase (ACL) の存在について一般的に acetyl-coa OAA と citrate 間の反応は酸化 (=citrate 生成 ) 方向は citrate synthase (CS) が還元 (=acetyl-coa OAA 生成 ) 方向は ATP citrate lyase (ACL) が触媒することが知られている本菌のゲノム上には ACL 遺伝子が存在しないが CS らしき遺伝子は存在するまた赤血球中には宿主由来の ACL が十分に存在するしたがって本原虫の citrate を acetyl-coa に開裂する反応は宿主の ACL または CS らしき遺伝子にコードされているタンパク質によって触媒されている可能性が考えられるしかしマラリア原虫から ACL や CS 活性は検出できず citrate の解裂が起こる場所やその触媒酵素は現在のところ不明である 3

4 Carbon flow of heliobacteria is related more to clostridia than to the green sulfur bacteria. Tang, K.H., Feng, X., Zhuang, W.Q., Alvarez-Cohen, L., Blankenship, R.E., Tang, Y.J J. Biol. Chem.285: 背景目的本研究で用いられている Heliobacterium modesticaldum は培養可能なグラム陽性菌の中で唯一光合成を行う絶対嫌気性菌である暗条件でも増殖可能だが有機酸や糖を用いた光合成従属栄養条件でよく増殖する (Kimble LK et al, 1995; Tang KH et al, 2010) これまでに本菌は ATP citrate lyase (ACL) および citrate synthase (CS) を欠損させた不完全な還元的 TCA 回路を有することが全ゲノム解析および生化学的試験の結果から示唆されてきた (Fig. 2-1) しかしもしそうであれば CO2 が不可欠であるはずであるが本菌の増殖は CO2 を添加しても促進されない一方 13 C トレーサー実験の結果から本菌では酸化的 TCA 回路も機能していることも示唆されているがそうであるならば pyruvate 等を初発物質とする酸化的 TCA 回路が ACL や CS なしにそれが機能する理由が分からないそこで本研究は本菌の TCA 回路の流れを明らかにすることを目的とした結果 1 Fluoroacetate (FAc) を用いた増殖実験 FAc は毒物であり一般的な酸化的 TCA 回路で代謝されると (-)-erythro-(2r,3r)-2-f-citrate (2-FC) となって aconitase を阻害し本回路を停止させる (Fig. 2-2) しかし本菌を 20 mm FAc 添加培地 ( ベースとして 20 mm pyruvate が入っている ) で培養したところ増殖速度および炭素代謝遺伝子の転写レベルは FAc 非添加のコントロールとほとんど差がなかった (Fig. 2-3) したがって本菌では (-)-erythro-(2r,3r)- 2-FC が生じないことが示唆された 2 安定同位体によるトレーサー実験本菌を [1-13 C]pyruvate を用いて培養しタンパク質中のアミノ酸のラベル化パターンを GC-MS を用いて測定したその結果 Asp は主に 2 つの炭素がラベルされ Glu は主に 1 つの炭素がラベルされた (Table 2-1) もし Fig. 2-1 に示す不完全な還元的 TCA 回路のみが機能しているのならば Asp よりも Glu のラベル化割合が高くなるはずであるしたがって酸化的 TCA 回路が機能しているのではないかと考えられたこれは [3-13 C]pyruvate を用いて培養したときの Asp と Glu のラベル化パターンとも矛盾しない 3 Citrate synthase 活性の検出 [1-13 C]pyruvate 培養時に 50% 以上の Asp と 60% 以上の Glu の側鎖のカルボキシル基がラベル化されたことから著者らは本菌において一般的な (Si)-CS ではなくて (Re)-CS が働いているのではないかと考えた (Fig. 2-4) 2 つの CS はどちらも OAA と acetyl-coa から citrate を生成するが acetyl-coa のアセチル基を OAA のどこに付加するかが異なるまた (Re)-CS は酸素感受性および金属 (Mn 2+, Mg 2+ or Co 2+ ) 依存性を示すが既知の (Si)-CS ではこれらの性質が知られていないこれまで著者らは大気金属非添加条件で CS 活性を測定し活性がないとしていたそこで嫌気 Mn 2+ 添加条件で活性測定を行ったところ CS 活性が認められた 4 Anaplrotic-CO2 固定経路詳細は割愛するがアミノ酸のラベル化パターンから本菌の pyruvate:ferredoxin oxidoreductase 4

5 (PFOR)は非常に可逆的かつ活発活発に働いていることが分かったまた Asp は主主に酸化的 TCA 回路ではなく PEP への炭酸付加によりにより生ずることが示唆された考察以上の結果から H. modesticaldum では不完全な還元的 TCA 回路に加えて部分的部分的に酸化的 TCA 回路も機能しているこが示唆されたされた(Fig. 2-5) 加えて本酸化的 TCA 回路は本菌本菌の主な炭素フラックスであり 2-OG の生成に寄与していることがしていることが示唆されたこの酸化的 TCA 回路でで CO2 が生じるために本菌の増殖は CO2 の添加により促進促進されないと考えられる加えて ① ③の結果から本菌本菌の増殖が FAc によって阻害されないのは本菌本菌の CS が(Si)-CS ではないからであることが示唆された Aconitse を阻害するのは 2-FC の 4 つの異性体のうち (-)-erythro-2-fc のみであり (+)--erythro-2-fc 生成型の(Re)-CS のみを有するする Desulfovibrio vulgaris Hildenborough の増殖は FAc の添加添加により阻害されない(Fig. 2-3c) したがって H. modesticaldum も (Re)-CS を有すると考えられる 5

6 Both forward and reverse TCA cycles operate in green sulfur bacteria. Tang, K.H., Blankenship, R.E J. Biol. Chem. 285: 背景背景目的 hlorobaculum tepidum は酸素非発生型の光合成光合成を行う絶対嫌気性細菌本研究で扱う緑色硫黄細菌 Chlorobaculum である Fig. 3-1A に示すように本菌本菌は RTCA 回路を用いて CO2 を固定する光合成による増殖時光合成 acetate や pyruvate 等の有機酸を培地に添加添加することで本菌の増殖は促進されるがこれら有機酸のみでは増殖これらできないすなわち CO2 も必要なな混合栄養である本研究ではなぜ有機酸がが本菌の増殖を促進するのかまたなぜこれら有機酸の同化時同化時に CO2 が必要なのかを明らかにすることをことを目的とした結果の比較 ① 独立栄養増殖と混合栄養増殖の嫌気 Low intensity light 照射 0.34% ~40mM HCO3- 添加条件での独立栄養培養時独立栄養培養時をコントロールとしこれに 10 mm の acetate または pyruvate を添加した混合栄養増殖時との違違いを確認したその結果それぞれ最終菌体量がそれぞれがそれぞれ 50 20% 増加した(Fig. 3-2A) また独立栄養培養独立栄養培養と比べて混合栄養培養では炭素代謝に関関わるほとんどの遺伝子の転写レベルが 2 4 倍上昇倍上昇した ② 有機酸が同化されていることのされていることの確認 13C ラベルした acetate または pyruvate を添加して培養した菌体からバクテリオクロロフィルからバクテリオクロロフィル c [BChl c; 8 分子の 2-OG (=α-kg) KG)といくつかの acetyl-coa から作られる ] を抽出して MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption/ Ionization)-TOF TOF (Time of Flight) Flight)を用いて測定した [13C] puruvate 添加時より[[13C] acetaete 添加時の方が BChl c 中には多くのくの 13C が取り込まれていた(Table 3-1) ③ FAc 添加時の増殖生理無機培地に 1 mm の FAc を加加えた場合および 20 ｍm pyruvate と 2 mm の FAc をを加えたところ本菌は増殖しなかった (Fig. 3-2C)) 一方で acetate 存在下では 2 mm FAc を加えてもえても十分な増殖を示し FIGURE Effect of FAc on the growth of C. tepidum. 0.34% (40 mm) HCO3 is included in all of the growth media. The growth curve (A) The cell growth (recorded as A625) during growth conditions with various concentration concen of acetate, pyruvate, and FAc is shown (C). F, fluoro. た(Fig. 3-2c) ④ TCA 回路の方向決定に寄与するとすると考えられる ACL CS について acetyl-coa OAA と citrate 間間の反応は一般的に還元的 TCA 回路では ACL が酸化的 TCA 回路では CS が担っている C. tepidum のゲノム上には ACL 遺伝子(aclAB) に加えてえて CS 遺伝子(gltA)が 6

7 レベルは aclab よりも 6 10 倍低かったまた本菌本菌の CS はタンパクレベ存在するが glta の転写レベルはルでの存在が確認されており ACL が活性化する条件で非活性化されることが示唆示唆されている実際独立栄養培養および混合栄養培養混合栄養培養した菌体すべてから ACL 活性はされたが CS CS 活性は検出されなかった考察 ③の結果から本菌の独立栄養混合栄養増殖時の主な炭素フラックスはどちらもフラックスはどちらも還元的 TCA 回路であることが示唆されたしかし以下以下に示す理由により部分的に酸化的 TCA 回路が機能している可能回路性もあると著者らは考察しているしている Fig. 3-3B に示すようにもし[2-13C] acetate や[3-13C] pyruvate が還元的 TCA 回路のみで取り込まれるのであればまれるのであれば両者で Glu と acetyl-coa が同じようにラベル化さがれるので BChl c のラベル化割合もも同じになるはずであるしかし実際のラベル化割合化割合は[2-13C] acetate で 16 [3-13C] pyruvate で 10%とと異なった(TABLE 3-1) これは pyruvate はほぼ還元的はほぼ TCA 回路のみで同化されるのに対し acetate acetate は酸化的 TCA 回路でも同化されるため Glu Glu のラベル化割合が高くなるからではないかと著者らは述述べている(Fig. 3-4) この仮説は FAc による増殖阻害実験増殖阻害実験の結果とも矛盾しないと著者らは主張しているしているすなわち培地に添加された pyruvate はほとんどすべて PEP 方向に流れるため FAc から生じたじた F-acetyl-CoA は競合相手がいないので ACL(またはまたは CS)の働きすぐに F-citrate となって aconitase を阻害する一方で acetate を添加した場合には FAc よりも acetate の方が acetyl-coa synthase に触媒触媒されやすいため注２ F-acetyl-CoA が生じにくく aconitase aconitase の阻害が起こりにくいのではないかと著者著者らは述べている注 2 著者らは FAc が acetyl-coa CoA synthase に対する acetate の競合阻害剤でありその触媒効率触媒効率は[(kcat/ Km)acetate + (kcat/ Km) FAc]/ (kcat/ Km) FAc > 400 であることを示しているこれにより FAc は acetate 存在時に少しだけ F-acetyl-CoA に変換されることが示唆示唆されたただし本菌の酸化的 TCA 回路回路は不完全で 2-OG で止まると考えられるなぜならなぜなら本菌は酸化的 TCA 回路に必要な pyruvate dehydrogenase および 2-OG dehydrogenase 遺伝子を有さないし CS 遺伝子や succinata dehydrogenase 遺伝子はは光合成増殖時に down-regulate されているからであるされているからであるまた本菌が従属栄養生物と異なりなり増殖するのに有機酸に加えて CO2 を必要必要とするのは本菌の炭素代謝系を機能させるためには PFOR および PEPCK による CO2 付加反応が不可欠不可欠だからだと考えられる 7

8 感想これまで TCA 回路に対してほとんどの生物では教科書的な酸化方向に回っていて一部の生物では還元的方向に回転しているという認識でいたしかし今回の雑誌会に向けて勉強したところ一部両方向に機能していたり回転せずに分岐した流れになっていたりと例外が多い ( むしろ今までに記されていた教科書的な TCA 回路を典型と考えること自体に問題がある可能性もある?) ことが分かった 1 報目の論文の著者らも考察で述べていが既知の代謝マップにゲノム情報を乗せる形である生物の代謝を予測すると誤った代謝系が予測される恐れがある ( 例えば 1 報目の例だと還元方向に流れている 2-OG から malate までの反応は ACL/CS 以外可逆的なので ACL/CS が特定されていない本菌では流れの方向を特定できない ) 代謝系の解明にはゲノム情報だけではなくトレーサー実験や生化学的解析による直接的な証拠が必要であることを再確認した参考文献 Krebs, H.A The citric acid cycle: A reply to the criticisms of F. L. Breusch and of J. Thomas. Biochem. J. 34: Krebs, H.A The citric acid cycle and the Szent-Gyorgyi cycle in pigeon breast muscle. Biochem. J. 34: Kimble, L.K., Mandelco, L., Woese, C.R., Madigan, M. T Heliobacterium modesticaldum, sp. nov., a thermophilic heliobacterium of hot springs and volcanic soils. Arch. Microbiol. 163: Tang, K.H., Yue, H., Blankenship, R.E Energy metabolism of Heliobacterium modesticaldum during phototrophic and chemotrophic growth. BMC. Microbiol. 10:150 8

ラベル化された炭素数 Figure 1-1: Glutamine drives reverse flux through the TCA cycle. a, Concentrations of different isotope-labelled carboxylic acids in extracts of P. falciparum-infected red blood cells.

9 ラベル化された炭素数 Figure 1-1: Glutamine drives reverse flux through the TCA cycle. a, Concentrations of different isotope-labelled carboxylic acids in extracts of P. falciparum-infected red blood cells. We cultured synchronized parasites in medium supplemented with either U- 13 C-glucose or U- 13 C- 15 N-glutamine 2 h before invasion, then extracted them every 8 hours after invasion for high-performance LC MS (HPLC MS) analysis. The plots to the right of the grey triangles zoom in on the profiles of the labelled metabolites. The +3 and +4 malate arises from the reductive and oxidative pathways, respectively, whereas +3 fumarate probably derives from interconversion of fumarate and malate by fumarate hydratase (PFI1340w). Error bars show the s.d. of n = 3 biological replicates. b, Schematic of the oxidative pathway from 2-oxoglutarate to malate. Red dots denote 13 C atoms arising from U- 13 C- 15 N-glutamine. GDP, guanosine diphosphate; GTP, guanosine triphosphate; P i, inorganic phosphate. c, Schematic of the reductive carboxylation pathway from 2- oxoglutarate to malate. Ac-R represents either acetyl-coa or acetate. 還元的酸化的 (UDP-GlcNAc etc ) Figure 1-5: An integrated model for central carbon metabolism in P. falciparum. Arrows show the direction of net flux; multiple arrows depict pathways not shown in their entirety and are labelled as such. Metabolites in red are those found to flow out into the medium as waste products. Red arrows indicate the reductive pathway of TCA metabolism; blue arrows show the oxidative pathway. Asterisk (*), the specific enzyme responsible for the citrate cleavage step and its localization are unclear (see Supplementary Discussion). Double asterisk (**), there are two predicted enzymes capable of catalysing this reaction, the cytosolic malate dehydrogenase (PFF0895w) and the putative mitochondrial malate:quinone oxidoreductase (MAL6P1.258). Abbreviations: Gln, glutamine; Glu, glutamate; OG, 2-oxoglutarate; ICT, isocitrate; Cit, citrate; Ac-R, acetate/acetyl-coa; Ac-CoA, acetyl-coa; OA, oxaloacetate; Mal, malate; Suc, succinyl; Suc-CoA, succinyl-coa; Fum, fumarate; Glc, glucose; Asp, aspartate; PEP, phosphoenolpyruvate; Pyr, pyruvate; Lac, lactate.

10 Figure 1-2: Cytosolic pathways generating malate and fumarate. a, Schematic of the pathway in which U-13C-glucose is metabolized to +3 13C-malate and +3 13Cfumarate in the parasite cytosol. PEP carboxylase (PEPC, PF14_0246) converts glycolytic PEP into oxaloacetate, which is then reduced to malate by the parasite s cytosolic malate dehydrogenase (MDH, PFF0895w) or transaminated to aspartate by the aspartate aminotransferase (AAT, PFB0200c). The aspartate carbon skeleton can then be converted to fumarate in the cytosol by the concerted reactions of adenylosuccinate synthase (ADSS, PF13_0287) and adenylosuccinate lyase (ADSL, PFB0295w) in the parasite s essential purine salvage pathway. Red dots denote carbon-13 atoms. Arrows show the direction of net flux; multiple arrows depict pathways that not shown in their entirety. b, Schematic of the pathway in which U-13C-15Naspartate is metabolized to +4 13C-malate and +4 13C-fumarate. 黒 : ラベルされていないもの濃灰 :CoAのリボース部位のみがラベルされているもの赤 : アセチル基がラベルされているもの白 : 糖部分はラベルされているがアセチル基はラベルされていないもの薄灰 :NはラベルされているがCはラベルされていないもの Figure 1-3:Acetyl groups deriving from glucose and glutamine are functionally distinct. a, Labelling of acetyl-coa in extracts of P. falciparum-infected red blood cells at t = 40 hours after invasion as determined by HPLC MS. b, Labelling of a singly acetylated peptide derived from the N-terminal tail of histone H4, determined by proteomic mass spectrometry. c, Labelling of UDP-GlcNAc at t = 40 hours after invasion. Black bars, unlabelled molecule; red bars, the molecule labelled at both carbons of the acetyl group, regardless of any other labelling; dark grey bars, acetyl- CoA labelled at all five carbons of the ribose moiety of CoA, but not the acetyl group; white bars, UDP-GlcNAc labelled at some combination of the glucose, ribose or pyrimidine ring, but not the acetyl group; light grey bars, UDP-GlcNAc labelled at 0 3 nitrogens, but at no carbons. Error bars show the s.d. of n = 3 biological replicates. Figure 1-4: Malate excretion by P. falciparuminfected red blood cell cultures. We grew and cultured parasites as described above, collected samples of the culture medium and analysed them by HPLC MS. The data are given as molar concentrations in the medium samples. The plot at the right, indicated by grey triangle, is a close up of the profiles of the labelled metabolites. All error bars show the s.d. of n = 3 biological replicates.

11 Asp Glu FIGURE 2-2. Reaction of F-acetyl-CoA and OAA catalyzed by (Re)- versus(si)-citrate synthase, and interactions of ( )-erythro-2-fc versus(+)-erythro-2-fc with aconitase. FIGURE 2-1. Previously proposed carbon flow in H. modesticaldumfrom genomic information and enzymatic activity assays. 一般的な CS 酸化的 TCA 回路を有する酸素感受性金属依存性をあり FIGURE 2-4. Reactions catalyzed by the (Re)-versus(Si)-citrate synthase, aconitase, and isocitrate dehydrogenase. 13 C labeling distributions in citrate, α-ketoglutarate, and glutamate using [1-13 C] pyruvate are shown. (Re)-CS を有する FIGURE 2-3. Effect of FAcfor the growth of R. denitrificans, H. modesticaldum, and D. vulgaris Hildenborough(DvH). A, growth curve of R. denitrificans grown on pyruvate, FAc, or pyruvate and FAc as the carbon source; B, growth curve of H. modesticaldum during photoheterotrophic growth on pyruvate with or without FAc; C, growth curve of DvH grown on lactate with or without FAc FIGURE 2-5. New view for carbon flow in H. modesticaldum. The proposed carbon flow is through the OTCA cycle (red) and the RTCA cycle (blue) with a stronger flux through the OTCA cycle (acetyl-coa α-kg, shown in bold). The proposed role of the putative (Re)-citrate synthase is shown.

12 PFOR PFOR FIGURE 3-1. Schematic representation of the RTCA cycle (A) and how FAcinhibition occurs in carbon flow via the OTCA cycle (B). FIGURE 3-4. The proposed carbon flux in C. tepidum. The proposed carbon flux during mixotrophic growth with pyruvate (A) and acetate (B) FIGURE 3-3.

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PowerPoint プレゼンテーション酵素 : タンパク質の触媒タンパク質 Protein 酵素 Enzyme 触媒 Catalyst 触媒 Cataylst: 特定の化学反応の反応速度を速める物質自身は反応の前後で変化しない酵素 Enzyme: タンパク質の触媒触媒作用を持つタンパク質第 3 回 : タンパク質はアミノ酸からなるポリペプチドである第 4 回 : タンパク質は様々な立体構造を持つ第 5 回 : タンパク質の立体構造と酵素活性の関係