3_差替え版_ 修正→ JST新技術説明会（北見工大_小西）

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えりかえいさか
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1 新規酢酸耐性菌を用いたリグノセルロース系バイオマスからのエタノール生産北見工業大学工学部バイオ環境化学科准教授小西正朗 1

発酵に用いられる宿主はこれらの物質への耐性が低い除去操作が必要 ( 活性炭処理等 ) 製造コスト増加前処理の複雑化

2 研究背景バイオリファイナリー (Biorefinery): バイオマス等を原料としバイオプロセス物質生産の次世代基盤技術スイートコーンコーンコブ ( 穂軸 ) 酵素糖化発酵基質としての問題点糖化効率が悪い発酵阻害の問題発酵に用いられる宿主はこれらの物質への耐性が低い除去操作が必要 ( 活性炭処理等 ) 製造コスト増加前処理の複雑化コーンコブ酵素糖化液バイオプロセス有用物質生産エタノール乳酸糖アルコールポリマー原料高機能性物質 ( アスタキサンチン ) 様々な物質へ変換発酵阻害を受けない菌の探索 2

3 発酵阻害物質の生成 3

4 任意の代謝遺伝子糖化液 + 発酵阻害物質発酵阻害耐性菌を宿主とした微生物工場の開発発酵阻害耐性菌合成生物学による代謝導入発酵阻害耐性菌有用菌課題 : 発酵阻害に対する特性遺伝子導入技術の開発課題 : ゲノム情報遺伝導入法乳酸 ( ポリマー原料 ) バイオアルコールバイオマスプラスチック有機酸酵素製剤グルコースピルビン酸 TCA 回路解糖系乳酸 ( ポリマー原料 ) 検討項目 : 発酵阻害耐性菌の探索乳酸菌由来乳酸脱水素酵素 (LDH) 培養特性評価ドラフトゲノム解析遺伝子導入法 4

先行研究例 ( 糖脂質 [ ソホロリピッド,SL] 生産 ) 硫酸処理酵素処理 ph 5 1.0~5.

: Efficient production of sophorolipids by

5 先行研究例 ( 糖脂質 [ ソホロリピッド,SL] 生産 ) 硫酸処理酵素処理 ph 5 1.0~5.0% 硫酸メイセラーゼフィルター滅菌 121, 60min ソホロリピッド生産菌による糖化液からのソホロリピッド生産 3% 以上の硫酸前処理で増殖糖脂質生産を阻害 Konishi M.*, Yoshida Y., Horiuchi J.: Efficient production of sophorolipids by Starmerella bombicola using a corncob hydrolysate medium. J. Biosci. Bioeng. 119, (2015) 5

6 スクリーニング方法 ( 耐性菌の探索 ) 北見工業大学屈斜路研修所概観 6

7 発酵阻害耐性菌の分類ー系統分類ー子嚢胞子形態観察生化学試験でも P. membranifaciens と一致 NBRC へ寄託寄託番号 :NITE P

8 糖化液中での増殖挙動増殖特性評価使用菌株 : Pichia menbranifaciens KS47-1 株, Pichia menbranifaciens NBRC 10125, Pichia manshurica NBRC 10726, Pichia deserticola NBRC 70716, Pichia kluyveri NBRC 1165, Kregervanrija fluxuum NBRC 0773, Saccaromyces cerevisiae BY4742 培地 : YM 培地, コーンコブ糖化液培地 20 ml 培養方法 : 振とうフラスコ培養 (28 C, 200 rpm) 8

9 糖化液の分析例 Intensity (-) HMF(2.23) Frufural (3.58) コーンコブ糖化液 (10 倍希釈 ) Vaniline (7.10) Retention time (min) Column: μboundasphere 5μ 100Å ( mm) Mobile phase: 0.1% H3PO4/CH3CN = 85/15 Flow rate: 1 ml / min Sample Volume: 10 μl Detector: UV (275 nm) HMF: 5-hydroxymethyl furfural 阻害物質 : 酢酸フルフラールヒドロキシメチルフルフラール (HMF) などを含む 9

10 個別成分に対する耐性 10

11 高濃度酢酸存在下でのエタノール発酵 200 ml 容量バッフル付フラスコ酢酸添加 YPD 培地 20 ml(100 g/l glucose, 20 g/l peptone, 10 g/l yeast extract, 250 mm acetate (ph 5.0) 温度 : 28 C, 攪拌 : 200 rpm (0~24h), 70 rpm (24h~) KS47-1 NBRC10125 NBRC10125 BY4742 KS47-1 好気条件 (~24h) Acetate Biomass Glucose BY4742 スイッチング BY4742 NBRC10125 KS47-1 嫌気 [ 微好気 ] 条件 (24 h~) Acetate Biomass KS47-1 Glucose Ethanol 11

12 ドラフトゲノム解析北海道ライフサイエンステクノロジー社に委託し KS47-1 株の Genome 解析を行った Table. Velvet(Ver ) によるアセンブルの結果 k-value 61 Contig 379 Total contig size Max. contig size Minimum contig size 121 N50 contig size Table. MiGAP によるアノテーションの結果 CDS trna rrna KS47-1Genome ゲノム解析 ( 方法 ) ゲノム DNA 抽出 : アルカリ SDS 法シーケンス : HiSeq 2000 (Illumina), 2 Gb, ペアエンドアセンブル : DDBJ Read Annotation Pipeline (Velvet V ) アノテーション : MiGap (Microbial Genome Annotation Pipeline Ver 2.18) ORF, RNA 予測 : AUGSUTUS 2.5.5, trnascan-se 1.23, NCBI BLAST , RNAmmer 1.2 Annotation: NCBI BLAST Reference Databese set: RefSeq release 67, TrEMBL release 2014_04, NR [ ] Table.3 NCBI BLAST(2.2.18) 解析の結果 Software RefSeq 39 TrEMBL 935 NR 932 Total 1906 特許出願 : 発酵阻害物質への耐性を有する新規ピキア属酵母特願 ( 基礎出願特願 ) 論文投稿 :Konishi M*, Arakawa T., Kato Y., Ishida M., Horiuchi J: Genome Announc. [in press] DOI: /genomeA

既知の酵母との遺伝的類似性 Pichia membranifaciens KS47-1 1606 本菌株特異的遺伝子 2893 16 56 175 2439

The overlap was described by thresholds of 60% identities and 70% coverages using

13 既知の酵母との遺伝的類似性 Pichia membranifaciens KS 本菌株特異的遺伝子 Saccharomyces cerevisiae S288C Venn diagram based on the similarity of CDSs among P. membranifaciens KS47-1, P. membranifaciens NRRL Y2026, and Saccharomyces cerevisiae S288C. The overlap was described by thresholds of 60% identities and 70% coverages using in silico MolecularCloning Genomic Edition version D. Diagram was draw by R version Pichia membranifaciens NRRL Y-2026* *) Riley, R., Haridas, S., Wolfe, K.H., Lopes, M.R., et al Comparative genomics of biotechnologically important yeasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 113:

14 酢酸耐性関連遺伝子出芽酵母 (S. cerevisiae) で知られている酢酸耐性遺伝子と類似性の高い遺伝子を探索 Table. Estimated inhibitory compounds-tolerance associated genes of KS47-1. Query (S. cerevisiae S288c) Results Pichia membranifaciens KS47-1 Pichia membranifaciens NRRL Y-2026 Name Accession No. Length Accession Length Q_cov Identity Accession Length Q_cov Identity (a.a) (Locus_tag) (a.a) (%) (%) (Locus_tag) (a.a) (%) (%) Acetate tolerant-associated genes FPS1 CAA GAV No Hit (PMKS ) HOG1 NP_ GAV XP_ (PMKS ) (PICMEDRAFT_17479) PMA1 NP_ GAV XP_ (PMKS ) (PICMEDRAFT_73562) PDR12 NP_ GAV XP_ (PMKS ) (PICMEDRAFT_31991) HAA1 NP_ No Hit No Hit TPO2 NP_ GAV XP_ (PMKS_001402) (PICMEDRAFT_31287) TPO3 NP_ GAV XP_ (PMKS ) (PICMEDRAFT_31287) Abbreviation: Q_cov, Query coverage. 14

15 酢酸耐性機構既知の酢酸の取り込みやストレス応答に関与する遺伝子はヒットしない高毒性 ph 低下 15

16 酢酸代謝遺伝子その他耐性関連遺伝子 Table. Estimated acetate assimilation associated gene and inhibitory compounds-tolerance associated genes of KS47-1. Query (S. cerevisiae S288c) Results Pichia membranifaciens KS47-1 Pichia membranifaciens NRRL Y-2026 Name Accession No. Length Accession Length Q_cov Identity Accession Length Q_cov Identity (a.a) (Locus_tag) (a.a) (%) (%) (Locus_tag) (a.a) (%) (%) Acetate assimilation ACH1 NP_ GAV XP_ (PMKS ) (PICMEDRAFT_17688) ACS1 NP_ GAV XP_ (PMKS_001829) (PICMEDRAFT_14799) GAV (PMKS_002148) ACS2 NP_ GAV XP_ (PMKS_001829) (PICMEDRAFT_71027) GAV (PMKS_002148) ALD4 NP_ GAV XP_ (PMKS_000546) (PICMEDRAFT_74876) Furfural and 5-HMF tolerant associated genes ADH6 NP_ GAV XP_ (PMKS_001933) (PICMEDRAFT_74876) NP_ GAV (PMKS ) ADH7 NP_ GAV XP_ (PMKS_001933) (PICMEDRAFT_74876) NP_ GAV (PMKS ) ZWF1 NP_ GAV XP_ (PMKS_003967) (PICMEDRAFT_17573) ARI1 CUA GAV XP_ (PMSK_000370) (PICMEDRAFT_16083) Abbreviation: Q_cov, Query coverage. 16

17 酢酸代謝 ACS1 Acetate CoA ligase 17

18 酢酸同化経路 Acetate CoA ligase (ACS1) Acetate CoA Acetyl CoA TCA cycle ATP AMP + PPi 好気的で ATP リッチな条件で活性化している可能性酢酸同化による解毒作用が強力か? 18

19 まとめコーンコブ糖化液中で増殖阻害を受けない酵母 Pichia membranifaciens KS47-1 株を分離した好気培養で酢酸を優先的に利用できる好気培養と嫌気培養を組み合わせた 2 段階培養で 250mM 酢酸存在下でエタノールを生産できる (6 g/l) ドラフトゲノム解析により酢酸耐性ならびに代謝遺伝子について解析を進めている酢酸取り込みについては未知の遺伝子を持っている可能性が高い酢酸以外の増殖阻害物質に対しても高い耐性を持つフルフラール類の耐性に関与する遺伝子を保持している 19

20 展望コーンコブ以外のバイオマスでの有効性遺伝子組換え系の構築 (Pichia pastoris の宿主ベクター系をベースに検討中 ) 遺伝子組換え系を利用した異種タンパク生産合成代謝遺伝子を組み込んだ種々の物質生産バイオマス由来発酵阻害物質に対しロバストなバイオプロセス構築副生成酢酸の有効利用特異な耐性関連遺伝子の利用既存の微生物に酢酸耐性付与 20

21 問い合わせ先北見工業大学社会連携推進センター内島典子 TEL 北見工業大学工学部バイオ環境化学科小西正朗 TEL

Microsoft PowerPoint - 4_河邊先生_改.ppt

Microsoft PowerPoint - 4_河邊先生_改.ppt 組換え酵素を用いた配列部位特異的逐次遺伝子導入方法 Accumulative gene integration system using recombinase 工学研究院化学工学部門河邉佳典 2009 年 2 月 27 日 < 研究背景 > 1 染色体上での遺伝子増幅の有用性動物細胞での場合新鮮培地空気 + 炭酸ガス使用済み培地医薬品タンパク質を生産する遺伝子を導入目的遺伝子の多重化