Agilent 1100 HPLC, LC/MS による最新ソリューションハイスループット分析と食品分析のアプリケーション October/2005 横河アナリティカルシステムズ食品衛生学会学術講演会 Page 1 なぜ高速分析高分解能分析なのか? 高分解能分析 Key Issue: 分解能の

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れいなやすこ
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1 Agilent 00 HPLC, LC/MS による最新ソリューションハイスループット分析と食品分析のアプリケーション ctober/2005 横河アナリティカルシステムズ食品衛生学会学術講演会 Page なぜ高速分析高分解能分析なのか? 高分解能分析 Key Issue: 分解能の向上最大の分解能分析時間の短縮溶媒消費量の削減高速分析 Key Issue: 大量のサンプル分析最短の分析時間サンプルの氾濫を防ぐベースライン分離の維持場合によっては分解能を犠牲にすることもある (e.g. LC/MS) Page 2

2 高速高分解能分析の実現カラムを短くする分析時間 (+ 再平衡化時間 ) の短縮溶媒消費量の削減 + 充てん剤粒径を小さくする分離度の維持あるいは改善微小粒径ショートカラムがあれば高速高分解能分析が実現できる! Page 3 逆相 HPLC 充てん剤の変遷 Yr of acceptance Particle Size Noal Size Plates / 5cm µm µm (pellicular) µm 2, µm, µm 7, <2 µm 2,000 Page 2

粒径 2 m 以下の充てん剤の特長 van Deemter curves HETP (cm/plate) Higher speed Higher resolution Higher sensitivity 0.005 粒径 0.000 5μm 0.

000 3.5 m 理論段高さ (Min.) 9.3μm 6.0μm 3.8μm 0.0005.8 m 0.0000 26

3 粒径 2 m 以下の充てん剤の特長 van Deemter curves HETP (cm/plate) Higher speed Higher resolution Higher sensitivity 粒径 μm ZRBAX RRHT Eclipse XDB-C8.6 x 50mm (30mm) 3.5μm :5 ACN:Water.8μm.0 L ctanophenone ml/ 20 C 5.0 m m 理論段高さ (Min.) 9.3μm 6.0μm 3.8μm m ,70 2mL/ 5.0 ml/ Interstitial linear velocity (u e - cm/sec) Page 5 充てん剤の構造特性圧損が小さい Rx-SIL ZRABX (Sol type) Xerogel (sil-type) 機械的強度 : 耐アルカリ性 : 不純物金属 : ポア径粒径の分布 : 非常に高い良好少ない狭い高い一般に悪い少ない~ 多い広い Page 6 3

RR カラム RRHT カラムによる分析時間の短縮 2 3 Rs(,2) =.8.6 x 250 mm, 5 m 29.65 2 3 Rs(,2) = 3.5.6 x 00 mm, 3.5 m 2.7 2 3.5 Rs(,2) = 3.3.6 x 30 mm,.8 m ml/ 2.09 Rs(,2) = 3. 2 3 0.5.5 2 2.

4 RR カラム RRHT カラムによる分析時間の短縮 2 3 Rs(,2) =.8.6 x 250 mm, 5 m Rs(,2) = x 00 mm, 3.5 m Rs(,2) = x 30 mm,.8 m ml/ 2.09 Rs(,2) = x 30 mm,.8 m 2 ml/ カラム :ZRBAX SB-C8 移動相 :50% 20 mm NaH 2 P, ph 2.8: 50% ACN 流量 : ml/ カラム温度 :RT 検出 :UV 230 nm Sample:. Estradiol 2. Ethynylestradiol 3. Dienestrol. Norethindrone Page 7 00 UFLC System 00 UFLC の構成 00 バイナリポンプ高精度で低ディレイボリュームの高圧混合ポンプ 00 ウェルプレートサンプラ低ディレイボリューム低キャリーオーバーで高速高精度なオートサンプラ 00 カラム恒温槽室温 -0 から 80 まで高精度に制御可能なカラム恒温 00 DAD SL 80Hz のサンプリングレートにより最高の分離度を保証 Zorbax RRHT.8um カラム高線流量下でも高効率を維持全世界で 50,000 台以上が使用されている 00 がベースコンベンショナル LC, セミミクロ LC としても最適なシステム Page 8

5 00 UFLC UFLC の分析時間は? コンベンショナル LC: Analysis Times = 5 20 高速 LC: Analysis Times = 2 5 UFLC: Analysis Times = Gradient Time = Cycle Times = % Peak Width = 0..0 sec PW = 0.3 sec Page 9 最適な高速高分解能分離を得るためには最適な装置パラメータが必要データサンプリングレートフローセルのボリューム配管 : 内径と長さ = ボリュームミキサーのボリュームグラジエントディレイボリューム Page 0 5

00 DAD SL が切り拓く超高速 LC 分析の世界高速サンプリングレートと高感度高信頼性を兼ね備えた新世代のダイオードアレイ検出器 Agilent 00 シリーズダイオードアレイ検出器 SL Agilent 00シリーズ多波長検出器 SL Page 00 DAD SL の機能と特長 Performance Compatibility Security & Compliance 機能最大

6 00 DAD SL が切り拓く超高速 LC 分析の世界高速サンプリングレートと高感度高信頼性を兼ね備えた新世代のダイオードアレイ検出器 Agilent 00 シリーズダイオードアレイ検出器 SL Agilent 00シリーズ多波長検出器 SL Page 00 DAD SL の機能と特長 Performance Compatibility Security & Compliance 機能最大 8チャンネルのシグナルを80Hz で採取オンラインスペクトル採取も 80Hz 最新のエレクトロニクスを搭載新しいフローセル特長超高速 LC 分析で最高の分解能を保証微量成分の超高速 LC 分析においてもピーク純度の分析やスペクトル分析が可能最小のノイズを実現 ( 典型値 < 6wAU ASTM) 超高速 LC の条件下 ( 高流量温度 ) での RI 効果とピーク拡散を最小限に抑え最高の感度を実現最新の電子温度制御技術を搭載 (ETC) 周囲温度の変動が大きい環境下でもベースラインのうねりを最小に抑えることで高感度を実現 Page 2 6

7 00 DAD SL の機能と特長 Performance Compatibility Security & Compliance 機能特長データリカバリカード (DRC) 内蔵データの脱落ゼロ RFID-tag によるフローセルランプの管理将来の拡張性を保証するエレクトロニクスより確実なデータトレーサビリティの確保オンボードで LAN,USBに対応 USB on board Webサーバー機能を内蔵 PCMCIA スロット (WLAN, Bluetooth, Firewire) 新しいファームウェアアーキテクチャ自動モジュール ( 将来的にはシステムの ) テストによる装置 DQ が可能 Page 3 00 DAD SL の機能と特長 25,000 台以上の実績の継承可視光領域でのノイズを最小化 00 DAD は全世界で 25,000 台以上が稼動しています nm の広範囲な波長範囲で最適な感度が得られます W ランプ長寿命 D2 ランプ 02 素子ホロミウムオキサイドダイオードアレイフィルター 950 nm フロー 90 nm セル最高の波長分解能を実現自動波長校正プログラマブルスリット分解能と感度を迅速に最適化グレーティング Page 7

8 80Hz サンプリングの威力 PW=0.30sec Hz peak 2 PW=0.33sec 3 0Hz 5 6 PW=0.2sec Hz 9 PW=0.67sec 0Hz PW=.2sec 5Hz compound Acetanilide Acetophenone Propiophenone Butyrophenone Benzophenone Valerophenone Hexanophenone Heptanophenone catanophenone 20Hz vs. 80Hz ピーク幅は 0% 増加ピークキャパシティは 0% 減少分離度は 30% 低下カラム効率は 70% 低下 0Hz vs. 80Hz ピーク幅は 20% 増加ピークキャパシティは 20% 減少分離度は 90% 低下カラム効率は 260% 低下サンプル : フェノン類混合物カラム : Zorbax SB-C8,.6x30,.8um グラジェント : 50-00% ACN in 0.3 Page 5 超高速 LC に求められるパフォーマンス 00 DAD-SL を使えば超高速 LC において最大限の分離度を得ることができますでは超高速 LC で様々な規制で要求されている性能を現在使用しているコンベンショナル LC と同様に満足できるのでしょうか? 0.05% レベルの副生成物の定量は? 保持時間再現は < 0.5%? ピーク面積値の再現性は < %? 微量成分のピーク純度分析は? 微量成分のスペクトル確認は? Page 6 8

9 00 DAD SL のダイナミックレンジ mau 2000 検出器には主成分と不純物を正確に精度よく同時分析できるだけのダイナミックレンジが必要です 500 主成分 = 2000 mau 不純物 = mau 不純物 0 DMS Page 7 00 DAD SL のノイズレベル 0.05% レベルの不純物分析 mau mau mau 0 スリット幅 :nm Noise < +/ 3.7 µau スリット幅 :6nm Noise < +/ 2.0 µau スリット幅 :8nm Noise < +/ 2.7 µau mau のピークの定量 (0.05% レベル ) 必要とされる S/N = 0 20 ノイズ = µau 80 Hz 0 Hz 20 Hz 0 Hz 2.5 Hz nm Slit nm Slit nm Slit ASTM 法によるノイズ : 20 µau Peak-to-Peak (+/- 0 µau) Page 8 9

10 00 UFLC の感度と再現性微量成分の分析例 (mau 0.5% レベル ) mau nm グラジェント : 50 70% B in 0.85 カラム :.6 x 50,.8um 試料 : 5ul of 550 µg/ml Nimodipin 流量 : ml/ フローセル : 3ul サンプリングレート : 80Hz スリット : 8nm Nifedipin 吸光度 ;2.5mAU (0.% level) 保持時間再現性 = 0.092% RSD Nifedipin degradation product 吸光度 0.5mAU (0.03% level) 保持時間再現性 = 0.23% RSD Page 9 00 UFLC の感度微量成分のピーク純度検定とスペクトル確認 mau Hz のサンプリングでピーク純度検定スペクトル確認が可能でしょうか? Page 20 0

00 UFLC の感度微量成分のピーク純度検定スペクトル確認 mau 2 0 8 000 mau のピークから抽出したスペクトルとの比較 6.6.7.8.9 2 80 Hz のサンプリングレートでも Nifedipin (.

7 Column RT/ injection 2000 injection 0.2 0. 0.6 0.8 Column 2 injection 000 injection 2000 0.6 W /2 /sec 0.5 0.

11 00 UFLC の感度微量成分のピーク純度検定スペクトル確認 mau mau のピークから抽出したスペクトルとの比較 Hz のサンプリングレートでも Nifedipin (.8mAU) のピーク純度検定とスペクト確認が可能 Page 2 00 UFLC の安定性 7 日間 (8000 回注入 ) の連続分析 Column injection 000 P=300bar Column RT/ injection 2000 injection Column 2 injection 000 injection W /2 /sec Column 2 RT/ W /2 /sec injection Injection Number 自動カラム再平衡化機能を持つシステムでの安定性 : システムカラムとも長期にわたって安定 2 時間 x 7 日間以上の自動連続分析に最適 Page 22

12 Conventional から UFLC 分析へのアプローチ ( 内径.6mm カラム ) コンベンショナル LC で分析中のデータをデータをいかに迅速に高速化するか? 確認 RRHT-00 Modification Kit for Diode Array Detector を 00 シリーズに組み込みそのカラムを用いてデータを取る同じ程度の理論段数のカラムを用意するグラジエントカーブはカラム長さに比例させる Page 23 清涼飲料中に含まれる含まれるカテキン類 H.C H H H H H 6.EC H H H H H H 3.EGC H H H H H H H H 2.GC H H 7.EGCg 8.GCg H H C H H H H H H H H H H H C H H H H CH H H.Gallic acid H H H 9.ECg H H 3 C C H N N H N H CH 3 N 5.Caffeine H H H 0.Cg C H CH 3 H H H Page 2 2

13 Conventional HPLC の分析結果 SB-C8 (.6 250mm, 5μm) 5 LC conditions System: Agilent 00 Series (Conventional, equipped with 500 µl mixer) Column: ZRBAX SB-C8 (.6 mm i.d. x 250 mm, 5.0μm) Mobile phase: A; 0. % phosphoric acid in 5% Acetonitrile(MeCN) B; MeCN Gradient elution: 0 (B 0%)-5(B 8%)-25(B 20%) Flow rate :.0 ml/ (00bar) Injection volume : 0 µl Sample treatment : times dilution of drink tea UV conditions Detection : 20nm, scan range ; nm, 20Hz Flow cell : 0mm path length Tube : 0.7 mm ID Page 25 UFLC 分析条件 SB-C8 (.6 50mm,.8μm) LC conditions System: Agilent 00 Series (equipped with.6mm RRTH Fast LC Kit, 80µL mixer) Column: ZRBAX SB-C8 (.6 mm i.d. x 50 mm,.8μm) Mobile phase: A; 0. % phosphoric acid in 5% Acetonitrile(MeCN) B; MeCN 2 Gradient elution: 0 (B 0%)-(B 8%)-5(B 20%) Flow rate :.0 ml/ (6bar) Injection volume : 0 µl Sample treatment : times dilution of drink tea UV conditions Detection : 20nm, scan range ; nm, 80Hz Flow cell : 6mm path length (micro cell, 6uL) Tube : 0.7 mm ID Page 26 3

14 UFLC 分析条件 SB-C8 (.6 50mm,.8μm) LC conditions System: Agilent 00 Series (equipped with.6mm RRTH Fast LC Kit, 80µL mixer) Column: ZRBAX SB-C8 (.6 mm i.d. x 50 mm,.8μm) Mobile phase: A; 0. % phosphoric acid in 5% Acetonitrile(MeCN) B; MeCN Gradient elution: 0 (B 0%)-0.(B 8%)-.7(B 20%) Flow rate : 3.0 ml/ (390bar) 2 Injection volume : 0 µl 分析時間 Sample treatment : times dilution of drink tea UV conditions Detection : 20nm, scan range ; nm, 80Hz Flow cell : 6mm path length (micro cell, 6uL) Tube : 0.7 mm ID 分析時間 /5! 5 倍短縮! Page 27 Conventional から UFLC 分析結果 (.6mm 内径カラム ) mm, 5μm 9 0 ml/, 00bar.6 75mm, 3.5μm ml/, 60bar.6 50mm, 5μm ml/, 83bar 分析時間 /5! 5 倍短縮!.6 50mm,.8μm ml/, 5bar mm, 3mL/, 390bar Page 28

15 Rapid Resolution HT の分析におけるクロマトグラムの再現性 (n=6) Detection; 20nm, 80Hz Flow rate : 3.0 ml/ ZRBAX SB-C8 (.6 mm i.d. x 50 mm,.8μm) Page 29 内径 2.mm カラムを用いた Rapid Resolution HT 分析へのアプローチ LC conditions Column: ZRBAX SB-C8 (.6x 50 mm,.8μm) Flow rate :.0 ml/ LC conditions Column: ZRBAX SB-C8 (2.x 50 mm,.8μm) Flow rate : 0.2 ml/ Page 30 5

16 Rapid Resolution HT の分析条件 SB-C8 (2. 50mm,.8μm) LC conditions System: Agilent 00 Series (equipped with 2.mm RRTH Fast LC Kit) Column: ZRBAX SB-C8 (2. mm i.d. x 50 mm,.8μm) Mobile phase: A; 0. % phosphoric acid in 5% Acetonitrile(MeCN) B; MeCN Gradient elution: 0 (B 0%)-0.68(B 8%)-.68(B 20%) 2 Flow rate : 0.2 ml/ (96bar) Injection volume : 2 µl, (Delay volume reduction) Sample treatment : times dilution of drink tea UV conditions Detection : 20nm, scan range ; nm, 80Hz Flow cell : 6mm path length (micro cell,.7ul) Tube : 0.2 mm ID Page 3 Rapid Resolution HT の分析条件 SB-C8 (2. 50mm,.8μm) LC conditions System: Agilent 00 Series (equipped with 2.mm RRTH Fast LC Kit) Column: ZRBAX SB-C8 (2. mm i.d. x 50 mm,.8μm) Mobile phase: A; 0. % phosphoric acid in 5% Acetonitrile(MeCN) B; MeCN Gradient elution: 0 (B 0%)-0.5(B 8%)-.5(B 20%) Flow rate : 0.3 ml/ (38bar) Injection volume : 2 µl(delay volume reduction) Sample treatment : times dilution of drink tea UV conditions Detection : 20nm, scan range ; nm, 80Hz Flow cell : 6mm path length (micro cell,.7ul) Tube : 0.2 mm ID Page 32 6

17 Agilent Rapid Resolution HT / MS システム High speed!! High capacity!! High performance!! Well-plate LC system: Binary pump, WPS, TCC, HT columns and DAD Mass-selective detector: Quadruple or Ion Trap Integrated controller: ChemStation software, Analyst or Ion Trap SW High capacity: Agilent sample capacity extension Valves: Selection, regeneration, Preparation or separation Page UFLC 00 DAD SL を利用した 00 UFLC は. データ品質を維持向上させながら最大で 0 倍の生産性向上が得られます超高速 LC 分析に完全に適合します. 感度と精度を維持しながら最大限の分離度が得られます. 微量分析においても正確かつ精密な定量とスペクトル分析が行えます. 厳しい ( 規制対応の ) 性能要求に対応できます. あらゆる産業ラボのアプリケーションに対応できます - ハイスループットスクリーニングから QA/QC 分析まで. 2. 現在のメソッドと完全な互換性がありますコンベンショナル LC のメソッドを 00 UFLC で実行できます. 現在の要求だけでなく将来の要求にも対応可能です. 3. データのセキュリティが向上しています新しいレベルのデータのセキュリティ確保トレーサビリティコンプライアンス対応. Page 3 7

18 LC/MS 用 Mix モードマルチイオン源 Page 35 Agilent マルチイオン源の開発コンセプト ESI, APCI, 及び ESI+APCI ミックスモードが単一同時測定が可能な単一ネブライザーイオン源イオン源交換なしに ESI, APCI 測定が可能 ESI 単独,APCI 単独及び ESI+APCI ミックスモードでの測定が可能高流量 (2ml/) での測定が可能全モードで高感度化の実現 ESI モードでの乾燥ガス消費量の低減多彩な性能を有する新たなイオン化法 :ESI+APCI ミックスモードよりユニバーサルな測定モード高速分析に対応高流量での測定が可能低流量での感度低下がない Page 36 8

Agilent マルチイオン源カラム溶出液入り口 ESI 領域 APCI 領域コロナニードル IR

サーマルコンテナ APCIカウンター電極キャピラリー乾燥ガスガス温度センサカラム溶出液入り口

セパレーター IR エミッタ ( ランプ ) Page 37 Agilent マルチイオン源ネブライザー

19 Agilent マルチイオン源カラム溶出液入り口 ESI 領域 APCI 領域コロナニードル IR エミッタ ( ランプ ) ネブライザーチャージングエレクトロードリバーシングエレクトロードサーマルコンテナ APCIカウンター電極キャピラリー乾燥ガスガス温度センサカラム溶出液入り口チャージングエレクトロードコロナニードルネブライザーリバーシングエレクトロードサーマルコンテナセパレーター IR エミッタ ( ランプ ) Page 37 Agilent マルチイオン源ネブライザー APCI 対向電極 ESI ケーブル IR ランプ APCI コロナニードル温度センサー Field-shaping 電極 Page 38 9

20 Agilent マルチイオン源 ESI Negative Mode S H Hexanesulfonic Acid APCI Positive Mode H N Indole APCI Negative Mode N F F - N Dinitrobenzotrifluoride F ESI Positive Mode N N N + Crystal violet Page 39 正負単独イオンモード正イオン Indole APCI 負イオン Dinitrobenzotrifluoride APCI Crystal Violet ESI Hexanesulfonic acid ESI ESI-APCIミックスモード Crystal Violet Indole ESI-APCIミックスモード Hexanesulfonic acid Dinitrobenzotrifluoride Page 0 20

21 ミックスモードによる正 / 負切り替え測定負イオンモード Hexanesulfonic acid Dinitrobenzotrifluoride 正イオンモード Indole Crystal Violet Page ミックスモードによる duty cycle time mau Taxol scans Mixed mode ESI+APCI, one signal 0 scans across the peak DAD scans Simulated ESI/APCI switching using two signals 5 scans Progesterone Page 2 2

22 従来のイオン源とマルチイオン源との比較様々な化合物に対する応答質量数 >300 での ESI + での感度質量数 <200 での ESI + での感度流量 >0.ml/ での感度 pen Access Lab 乾燥比較 MM イオン源 Best Best Good Best Best Best ESI Better Good Best Good Good K APCI/ APPI Good N.A. N.A. N.A. Good Best Comment Mixed モードによる測定 = 各モード毎での測定に対してスループットのロス無しにより多くの情報が得られる IR エミッタ - により乾燥効率が向上 Mixed モード ( あるいは S/W によるイオン化モードの切替え ) の利用 : サンプル分析のスケジューリング装置運用の効率化 IR エミッタ - により乾燥効率が向上 Page 3 マルチイオン源によるカビ毒の分析条件 HPLC : Agilent 00 Column : Zorbax Eclipse XDB C8 (50mm,2.mm,3.5um) Mobile phase : A:MeH B:0mMCH 3 CNH 0%A/B---(30)---00%A Column temp : 0C Sample volume : 20ul Flow rate : 0.2ml/ MS : Agilent00MSD SL Ionization : Multi source Mixモード Scan range : m/z SIM ion : Base peak ion Drying gas : 6 L/ at 350 Nebulizer gas : 50psi Fragmentor : 00V Vcap : 000V Charging voltage : 2000V Vaporizer temp : 20 Page 22

23 マルチイオン源によるかび毒の TIC Nivalenol 8.Aflatoxin B2 2.Deoxynivalenol 9.Aflatoxin B 0 3.Fusarenon -X 0.Diacetoxyscirpenol.3-Acetyl-DN.HT-2 toxin 5.5-Acetyl-DN 2.T-2 toxin 6.Aflatoxin G2 3.Zearalenone 7.Aflatoxin G ,5 2 3 正イオンモード 3 負イオンモード Page 5 マルチイオン源によるかび毒の SIM クロマトグラム (APCI モードとミックスモードの比較 ) ESI+APCI(MM) APCI Page 6 23

Agilent LC/MSD ロードマップ LC のための質量分析検出器 LC/MSD QMS - 997 構造解析のための MS/MS LC/MSD IonTrap - 2000 定量のための MS/MS

24 Agilent LC/MSD ロードマップ LC のための質量分析検出器 LC/MSD QMS 構造解析のための MS/MS LC/MSD IonTrap 定量のための MS/MS LC/MSD QQQ 精密質量測定による組成解析および構造解析のための MS/MS 精密質量測定による組成解析のための MS LC/MSD TF LC/MSD QqTF Page 7 2

Microsoft PowerPoint - 5_Comprehensive_MethDev_Solution.ppt [互換モード]

Microsoft PowerPoint - 5_Comprehensive_MethDev_Solution.ppt [互換モード] 1 自動メソッド開発 Method Development solution 問題 : よりよい分離を得るには? セッション 1 HPLCメソッド開発の基本 from John Palmer www.separationnow.com/agilentwebinars 7.00 6.00 R s = N α 1 α k ' k 4 2 ' 2 + 1 選択性 5.00 Resolution 4.00