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やすはるこびき
4 years ago
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1 バイオインフォマティクス配列データ解析 2 藤博幸

2 データベース検索 (1) ブラウザで NCBI を検索 (2)NCBI で配列データの取得 (3)NCBI で BLAST 検索

3 ブラウザで NCBI を検索

4 ブラウザで NCBI を検索クリック

5 ブラウザで NCBI を検索 NCBI トップページ National Center for Biotechnology Information 分物学やバイオインフォマティクスの研究にいられるデータベースの構築及び運営や研究にいられるソフトウェアの開発をっているこの機関では配列データベースである GenBank を始めとして塩基多型 (SNP) のデータベースである dbsnp EST のデータベースである dbest 献データベース MEDLINE などのデータベース PubMed などを運営しているまた各研究者が発表したゲノムデータのリアノテーションを NCBI で独にっておりその結果を Refseq として公開しているまた BLAST による相同性検索サービスの提供もっている公開されているデータは基本的に無償で利できる国物学情報センターより

6 NCBI で配列データの取得検索したい遺伝 or タンパク質のキーワードを今回は前回説明した PGD 合成酵素について検索する prostaglandin D synthase Homo sapiens とテキストフィールドにキーワードをして右横の search ボタンをクリック

7 NCBI で配列データの取得クリック

8 NCBI で配列データの取得 1 希望するデータが選択されていることを確認 2 スクロールしたページの下部をる

9 NCBI で配列データの取得 NCBI の様々なデータベースとそれぞれのヒット数がされている今回は Proteins の中の Protein からアミノ酸配列を取得するクリック

10 NCBI で配列データの取得クリック

11 NCBI で配列データの取得 GenPept format で表

12 NCBI で配列データの取得 GenBank Format ß--- p.10 遺伝の塩基配列とそれに関連する情報 GenPept Format タンパク質のアミノ酸配列とそれに関連する情報どちらの format も構成はほぼ同じ下部にスクロールしながら内容を確認

13 NCBI で配列データの取得 LOCUS 遺伝座 ACCESSION と同じことが多いアミノ酸残基数 GenBak format の場合は塩基数 DEFINITION タンパク質名などの説明括弧内は種名 ACCESSION データベースの ID VERSION 遺伝を特定する ID 同じ遺伝座からの複数の転写物に対応 SOURCE, ORGANISM 種名と階層的分類の情報 REFERENCE この配列データに関連する論

14 NCBI で配列データの取得 FEATURES Source: 種名 Protein: タンパク質名 Region: ドメインの位置情報マルチドメインの場合複数の記述がある CDD: 保存ドメインデータベースへのリンク GenPept format の説明は尾形善之先の植物バイオサイエンス情報処理演習を参考にしました

15 NCBI で配列データの取得 1 スクロールしてページ上部を表 2 Send to 横のをクリックしてプルダウンメニューを表

16 NCBI で配列データの取得 1 File をチェック 2 GenPept を FASTA に変更

17 NCBI で配列データの取得 Create File をクリックするとダウンロードフォルダに sequence.fasta の名前で FASTA 形式のファイルが作られる

18 NCBI で配列データの取得 FASTA 形式 ß-- p.9, p.163 >AAB prostaglandin D2 synthase [Homo sapiens] MATHHTLWMGLALLGVLGDLQAAPEAQVSVQPNFQQDKFLGRWFSAGLASNSSWLREKKAALSMCKSVVA PATDGGLNLTSTFLRKNQCETRTMLLQPAGSLGSYSYRSPHWGSTYSVSVVETDYDQYALLYSQGSKGPG EDFRMATLYSRTQTPRAELKEKFTAFCKAQGFTEDTIVFLPQTDKCMTEQ

19 NCBI で BLAST 検索 BLAST を使って相同配列を収集 Run BLAST をクリックしても実できるが今回は BLAST のサイトから検索

20 NCBI で BLAST 検索 NCBI のロゴをクリックして NCBI のトップに戻る

21 NCBI で BLAST 検索 BLAST をクリック

22 NCBI で BLAST 検索 Basic Local Alignment Search Tool 4 つの代表的な BLAST 違いは書かれているので使い分けを理解しておくこと今回は Protein BLAST を使う Protein BLASR をクリック

23 NCBI で BLAST 検索テキストエリアに直接配列をペーストして実できる今回はファイルチューザを使う選択ボタンをクリック

24 NCBIでBLAST検索ファイルを選択して開くボタンをクリック

25 NCBI で BLAST 検索選択ボタンの横に選択したファイル名前が出てくる今回設定はデフォルトで実する. BLAST ボタンをクリックパラメータ ( 検索条件 ) を変更する時はココをクリック

26 NCBI で BLAST 検索実中の待機画

27 NCBI で BLAST 検索検出されたデータベース中の類似配列のリスト類似性のいものが上部にあるようにソートされているチェックボックス配列の選択に利デフォルトは全て選択されている

NCBI で BLAST 検索 Query Cover = データベース中の配列とアラインされている領域のさ問い合わせ配列の全問い合わせ配列 E-value = 検出された類似度 (Score) 以上の類似度をす配列の断がデータベース中から偶然出される本数の期待値さいほど偶然

28 NCBI で BLAST 検索 Query Cover = データベース中の配列とアラインされている領域のさ問い合わせ配列の全問い合わせ配列 E-value = 検出された類似度 (Score) 以上の類似度をす配列の断がデータベース中から偶然出される本数の期待値さいほど偶然じたとは考えにくい統計的有意性の指標 Per. Identity = 配列致度 (%) データベース中の配列 Max Score = 類似断中の最の BLAST スコア Total Score = 個々の類似断の合計の BLAST スコア Accession = 検出配列のデータベース中の ID データベースへのリンクがある

29 NCBI で BLAST 検索タブをクリックすると表が変わるデフォルトは Descriptions

30 NCBI で BLAST 検索クリック

31 NCBI で BLAST 検索アラインメントのページが表

32 NCBI で BLAST 検索 Graphic Summary タブをクリック

33 NCBI で BLAST 検索問い合わせ配列に対してデータベース中に各配列のアラインされている部分をグラフィカルに表類似度のさはで表

34 NCBI で BLAST 検索 Alignment タブをクリック

35 NCBI で BLAST 検索 Description のページで配列名をクリックした時と同じアラインメントのページが表される Taxonomy タブをクリック

36 NCBI で BLAST 検索物の分類群ごとの検出数の要約ページ Description タブをクリックして最初の出ページに戻る

37 NCBI で BLAST 検索 Filter 機能を使うテキストフィールドに Homo sapiens として Filter をクリック

38 NCBI で BLAST 検索種名をると Homo sapiens 由来の配列だけが選択されていることを確認チェックボックスをクリックして必要のない配列のチェックを外す

39 NCBI で BLAST 検索

40 NCBI で BLAST 検索

41 NCBI で BLAST 検索上にスクロールして Download をクリック FASTA 形式でダウンロード選択した配列を FASTA 形式で取得する FASTA(complete sequence) を選択 seqdump.txt の名前のファイルがダウンロードフォルダに作られる

42 NCBI で BLAST 検索 seqdump.txt は multi-fasta 形式 (FASTA 形式のデータがつのファイルに複数ある )

43 NCBI で BLAST 検索取得した配列は Homo sapiens でフィルタリングしたのでヒトゲノムにコードされている相同配列であるこれらは同じ遺伝からよって出てきたsplicing variantやによって形成されたparalogであるまた検出配列のリスト中名前がChainではじまっているものはが決定されているものである収集された相同配列のマルチプルアラインメントを作成しそこから配列の持つ様々な情報を得ることができる ( 次回以降 )

44 相同配列の較解析の順第ステップ : 相同配列の収集第ステップ : 相同配列のマルチプルアラインメント第三ステップ : アラインメントからの機能構造進化的情報の抽出

45 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)

47 (1) 問い合わせ配列の word への分割

48 (2) 生成された word の有限オートマトンによる表現

49 (3) word のヒットの部分からのギャップなしの拡張

50 E-value, P-value の計算 0-1 S Y V T G P M N R T W Q T S K I I Y BLAST random walk 0 から出発し ungapped alignemnt の各サイトのアミノ酸対に対応するスコアを考えそれを加算していく加算した結果が -1 以下になったら random walk は停するものとするこの時各サイトのアミノ酸対の出現頻度は較する 2 本の配列におけるアミノ酸の出現頻度の積で表されるものとする (BLAST の帰無仮説 ) (1) BLAST random walk の停するまでに表れる最値 Y( ) が y 以上である確率は geometric-like distribution となる Prob(Y > y) ~ C exp(- λy) (2) 問い合わせ配列のさをN 1, データベースから取り出した配列のさをN 2 BLAST random walkが停するまでの平均のステップ数をAとするするとつの配列を較する際 n = (N 1 N 2 )/A 個程度のrandom walkがじる n 個のrandom walkのいづれにおいても得られた最スコアがy 以上である確率は順位統計に従い以下のように計算される Prob(Y >.. y) = 1 - (1 - Cexp(-λ (y-1))) n = 1 - (1 - Cnexp(-λ (y -1))/n) n = 1 - exp(-cnexp(-λ (y -1))) = 1 - exp(-n 1 N 2 Kexp (-λy ))

51 ここで K = (C/A) exp(-λ) である (3) (2) で 2 本の配列を比較した時に y 以上のスコアが得られる確率が計算された次にデータベース中で y 以上のスコアを有する配列の本数の期待値を求めるデータベース中の配列のトータルの残基数を D とすると長さの N 2 配列が D / N 2 本含まれていると見なす事ができるそのそれぞれが確率 1 - exp(-n 1 N 2 Kexp (-λy )) で y 以上のスコアを有するので二項分布を考え E-value = ((1 - exp(-n 1 N 2 Kexp (-λy )) D) / N 2 となる (4) 上記の y 以上のスコアを有する配列の本数に関する二項分布は E-value を平均と分散としたポアソン分布で近似できるものとするすると y 以上のスコアが得られる確率はそのようなスコアを有する配列の本数が 0 本である確率を 1 から引くことで得られるので P-value = 1 - exp(-e-value) として計算される実際は edge effect に関する補正など種々の補正が行われるので必ずしも上の通りの計算ではないまた複数のアラインメントについては Karlin-Altschul の sum statistic が利用される

52 Gapped BLAST への拡張オリジナルの BLAST はギャップを許さないのでアラインメントが断化されてしまい結果がづらかった

53 1)gapped-BLAST の手続き Step 1: 有限オートマトン生成までは BLAST に同じ Step 2: データベース中の各配列に次の操作を行う 2-1) 有限オートマトンによる hit を検出 ( これも BLAST に同じ ) 2-2) 同じ対角線上で十分近接した 2 個の hit から ungapped extension により HSP を求めそこから seed を決定して両側に gapped extension を行う 2-3) 有意性評価 (E-value) をして出力

54 Two-Hits Strategy と Gapped Extension (1) Two-hit induced ungapped extension による HSP の検出 (1-1) hit 検出 (1-2) second hit (C 末側で距離が A 残基以内の同じ対角線上 ) 検出 (1-3) second hit から ungapped extension により HSP 検出 (2) seed となる残基対の同定 (2-1) HSP が 11 残基対以上の時 : HSP にそって 11 残基のセグメントのスコアを計算し最大値を示すセグメントの中間を seed とする (2-2) HSP が 11 残基より短い時 : 中間の残基対を seed とする (3) gapped extension seed より両側に動的計画法により gapped extension を実行ただしこの時の動的計画法は現在見ている残基対のスコアがそれ以前に達成された最高スコアから Xg 以下にならないように実行されるこれは ungapped extension がそれ以前に達成された最高スコアから X 以下にならないように実行されることに対応している

55 Two-Hits Strategy 1 BLAST の各 hit ごとの ungapped extension は時間を要するのでその部分を短縮同じ対角線上にある二つの hit とは FASTA でいう所の同じオフセット値を有するタプルに相当する

56 Two-Hits Strategy 2 Second hit から BLAST 同様に ungapped extension を行い HSP を求める HSP が 11 残基以下の長さの時その中点の残基対を seed とする HSP が 11 残基対より長い時 11 残基対のウィンドウでスキャンし最大スコアを示す領域を見つけその中点の残基対を seed とする

57 Two-Hits Strategy 3 Seed となる残基対ここを出発点として両側に gapped extension してアラインメントを構築する

58 gapped externsion Seed となる残基対 seed より両側に動的計画法により gapped extension を実行ただしこの時の動的計画法は Smith & Waterman 法ではない現在見ている残基対のスコアがそれ以前に達成された最高スコアから Xg 以下にならないように実行されるこれは ungapped extension がそれ以前に達成された最高スコアから X 以下にならないように実行されることに対応している動的計画法については次回以降に説明

国際塩基配列データベース n DNA のデータベース GenBank ( アメリカ :Na,onal Center for Biotechnology Informa,on, NCBI が運営 ) EMBL ( ヨーロッパ : 欧州生命情報学研究所が運営 ) DDBJ ( 日本 : 国立遺伝研内の日

生物情報工学 BioInforma*cs 3 遺伝子データベース 16/06/09 1 国際塩基配列データベース n DNA のデータベース GenBank ( アメリカ :Na,onal Center for Biotechnology Informa,on, NCBI が運営 ) EMBL ( ヨーロッパ : 欧州生命情報学研究所が運営 ) DDBJ ( 日本 : 国立遺伝研内の日本 DNA データバンクが運営