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1 DAPI のフローサイトメトリにより維管束植物の乾燥組織を確実な DNA 倍数性を推定 近年フローサイトメトリによる DNA 倍数性の推定には生葉しか使われていない これは生物系統学 集団生物学 生態学において FCM の研究を制限している 乾燥法は植物学における試料保存技術を進めた 本研究では FCM の研究をするため 乾燥させた維管束植物を利用する可能を検討した 標準 DAPI 法で風乾した60の種の検討をし DNA 含量も100 倍を測った Vaccinium の Oxycoccus 亜属について倍数性のモデル分類学として詳細な調査およびサイトタイプの比較をするため 選ばれた 数ヶ月後に常温での貯蔵した試料はそれほど高くない CV を検出した 乾燥させた試料から蛍光強度の高い細胞核を抽出し 生葉より確実な推定をした DNA の倍数性を求めた 冷凍保存法では Vaccinium(3 年間まで ) の存続期間が長くなり 高い蛍光強度を検出した 多くの維管束植物における生葉が不要になる方法を紹介し FCM 用において新しく技術を明らかにした 現場研究における簡単なサイトタイプの研究を利用する 倍数性の推定するため 乾燥させた試料を利用できる

2 スペインの北西地方の石灰質がれ場から採取した Ranunculus parnassifolius 集団におけるゲノムサイズ変化および形態学的分 化 R.parnassifolius は山岳性植物として中央から南西ヨーロッパ ( アルプス ピレネ カンタバリアン ) の領域にわたって分布している 進化歴史および分類学的まだ明らかではない 本論文ではスペインの北西地方から石灰質がれ場で形態学の R. parnassifolius におけるサイトタイプの分布パターンを区別するため 多変量形態計測解析および FCM の研究を行予定 フローサイトメトリ (112 個体 ) および多変量解析 (152 個体 ) において R. parnassifolius の倍数性レベルおよび形態計測解析によって決定する イベリアン半島の北西地方で試料は8ヶ所から収集した 様々なバッファーおよび標準対照により異なる保存条件 ( 生葉 冷凍 乾燥 ) における FCM を行った 本研究では三つの倍数性レベル ( 二倍体 四倍体 五倍体 ) を明らかに 混合倍数性も発見した R. parnassifolius の DNA 含量 (pg/2c) は二倍体が 7.42 ±0.185 から 7.63±0.339 であり 四倍体が 15.09± から 15.85±0.587 pg/2c である 1 倍数性のゲノムサイズはサイトタイプがまだ区別出来ない 本研究では個体群の中での内種の変異が低かった さらに 様々な DNA 標準対照に対して行った 本研究では新しい値の鶏ゲノムサイズ (2C= pg) を確認し 動物および植物からの DNA 標準対照と同じ結果を出た 乾燥および冷凍の試料は DNA 倍数性レベルを推定する可能である 本研究では フローサイトメトリによりはじめての R. parnassifolius の C 値を報告した それから スペインの北西地方で薄弱な形態学的区別もはじめて報告し 異なる分布図の2つサイトタイプは論議している

3 生葉 植物標本 花弁 花粉からのフローサイトメトリの細胞核を用意するためのビーズビーティングの利用 ビーズビーティングはゲノムの研究のために細胞から DNA を抽出する1つの方法としてよく使われている だが 本研究ではフローサイトメトリにより DNA 含量を推定するため細胞核を用意する方法を開発する 植物試料とバッファーはビーズの Zirconia/Silica( 直径 :2.5mm) およびガラス ( 直径 : mm) と一緒に2ml チュブに入れること チューブは機械 (FP120 FastPrep Cell Distruper) で組織から核細胞を抽出ために震とうした 細胞核は PI で染色し フローサイトメトリにより解析する 本研究では Rosa canina の生葉 生花片 乾燥葉および R. rugosa の葉 花粉および Petroselinum crispum, Nicotiana tabacum, Allium cepa の葉を収集した 12サンプルの生試料を用意し 機械のうえでビーズビーティングを45 秒ほど行う FCM ヒストグラムは生葉から G1 G0ピークの CV が3% 以下に検出し R. canina の生花片および乾燥葉および R.rugosa の花粉からピークの CV が4.0% 以下検出した P. crispum の植物対照として24ヶ月保存した乾燥葉から DNA 含量を推定した 乾燥葉は生葉より DNA 含量が低く 細胞核が非常に多い 核細胞はビーズビーティングにより様々な組織から早さ 便利な作業を行う さらに バッファーの中に危険性物も使われていない

4 Selaginella における核細胞のゲノムサイズ フローサイトメトリによって9つの Selaginella のゲノムサイズを推定し 7つについてはじめての報告である ゲノムサイズは holoploid 当たり から pg (84-110Mb) 研究の前に対して推定した S. moellendorffii とほぼ同じである 9 種内の染色体数は 2n=16 から 2n=27 である 染色体数とゲノムサイズは非常に関連がある (Spearmans rank correlation; p= ) S. Moellendorffii 栽培種は有性生殖体ではなく 不成功の大胞子嚢である 乾燥試料の S. moellendorffii から FCM データを行い 生試料に対して DNA 含量を違うことが明らかにした (0.088 vs pg/1c). さらに 不正な染色体数は繁殖力とおそらく関係なかった

5 MATRA, Deden Derajat 12am111s DNA 含量および倍数性レベルに及ぼす様々なサンプルの保存条件を推定 緒言フローサイトメトリ (FCM) は倍数性レベルおよびゲノムサイズを推定するため最近植物または動物の材料によく使われている 植物の場合は細胞から機械的に核を抽出し DNA と蛍光色素 (DAPI など ) で染色し FCM 機械 (Partec PA など ) で蛍光発光分析を行う 様々な各研究室では異なる方法としてサンプル対照 染色液 バッファーを開発している 在来法には FCM を分析するため 生葉がよく使われている フィールドから距離 時間などがかかる状態およびすぐ機械でサンプルを解析できない場合は保存方法を開発している 動物の核ではホルマリンまたはアルコール : 酢酸など固定剤使っている (Hulgenhoft et al, 1988) 蛍光色素染色 細胞集合などに及ぼす固定剤を行う Hopping (1993) により冷蔵庫で9ヶ月以上の保存した Actinidia deliciosa は細胞核を壊れてない だが Propidium Idodie(PI) の蛍光強度は5 7% に減少した 固定細胞は CV が大きくならないが 細胞集合はよく行った おし葉標本は植物分類学 生物体系学 生態学などにおける在来法によりよく使われている (Suda and Travnicek, 2006) この方法は簡単 便利 難しくない技術である FCM を使えるため 乾燥葉から細胞核を抽出する方法を開発している 材料および方法 別紙 結果 別紙 ( 各論文 ) 結論フローサイトメトリにより生葉以外の試料から DNA 含量および倍数性レベルを正常に推定することが可能である Suda and Travnicek (2006) は多くの維管束植物の乾燥組織からの FCM データが正常に検出することをはじめて報告した 乾燥条件または標準条件の下でフローサイトメトリにより維管束植物の乾燥組織を検討した 20ヶ月後の保存サンプルはまだ FCM のシグナルを検出することが出来る だが あるサンプルは11% のシグナルを減少したと見られる Damon ら (2007) は採取後 173ヶ月 ( 乾燥方法および保存条件を気にせず ) の生葉に対して FCM のデータ ( ピークおよび CV) は正常な外観であった R. canina の乾燥葉からの核細胞の数は生葉より減少が見られ CV の平均は FCM を確実に推定することが出来る (Andy V. Roberts, 2007) 乾燥させた R. canina(2.86pg) は生葉 (2.91) より DNA 含量が低く 差異がなかった DNA 含量が低下するのは時間によって DNA を分解する可能性がある Ranunculus の葉は 80 0 C の冷凍で保存したサンプルが5% 以下の CV が見られ 四倍体の乾燥サンプルは四倍体の生葉より確実な FCM のデータに非常に小さい変異がある (Cires et al, 2009) Sugiyama(2008) は四倍体の個体も二倍体の個体より耐寒性が低い 耐寒性が低い四倍体は細胞膜の流動性 たんぱく質 DNA 代謝産物濃度が変更するかもしれない さらに 細胞残屑とともに核の集塊をする可能性があるため 蛍光色素染色を妨げると報告した 冷凍または乾燥のサンプルから FCM のデータを検出するとき ヒストグラムの解像度を低下させ バックアップノイズが高まる (Dolozel et al, 2007). さらに CV のピークは5% 以上が確実な推定を出来ない (Greilhuber et al, 2007) 両方の保存条件ではしばらくサンプルを保存することが出来る 長期保存サンプルおよび十分な保存を行わなかったことの影響は CV が高くなり 蛍光強度が低くなり DNA シグナルも欠落する

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