Microsoft Word - 101_有機酸.doc

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あきみこやぎ
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ARKY 22 イオンクロマトグラフィーによる有機酸の測定はじめに食品や飲料に含まれる有機酸は味や香りを特徴づける大切な成分のひとつですまた有機酸は広く環境中にも存在するばかりでなく化成品などの原料としても広く用いられていますしたがって食品や製品の品質管理環境水の監視に有機酸の測定は重要な意味を持ちますイオンクロマトグラフィーは無機イオンの測定はもちろん

1 ARKY 22 イオンクロマトグラフィーによる有機酸の測定はじめに食品や飲料に含まれる有機酸は味や香りを特徴づける大切な成分のひとつですまた有機酸は広く環境中にも存在するばかりでなく化成品などの原料としても広く用いられていますしたがって食品や製品の品質管理環境水の監視に有機酸の測定は重要な意味を持ちますイオンクロマトグラフィーは無機イオンの測定はもちろんこのような試料中の有機酸の測定にも広く用いられていますイオン排除カラムを用いる有機酸の測定イオンクロマトグラフィーにおいて有機酸類はイオン交換イオン排除または逆相モードで分離することができます各分離モードによって溶出順序やマトリックスによる影響が全く異なるため適したモードを選択することが必要ですイオン排除分離カラムには水素型強酸性陽イオン交換樹脂が充填されています一般に官能基はスルホン酸とカルボン酸型で水溶液中では完全に解離しています強酸性の溶離液を流すと固定相と移動相にわずかな酸性度の違いが生じますこの層の境界部分は選択性を有する膜として考えると都合がよくドナン膜と呼ばれています分離はドナン膜を介する分配作用によりおこなわれます例えば塩化物イオンや硫酸イオンのように水溶液中で完全にイオン化している陰イオンは固定相のスルホン酸基の負電荷と反発し保持されません固定相 COO COO COO (COOH) 2 CH COOH ドナン膜 Cl 2 (COO ) 2 図イオン排除分離のメカニズム CH COO 移動相一方酸性水溶液中でほとんど解離せず分子の状態で存在している弱酸はドナン膜内に分配されますつまり解離定数 (pka) の高い成分ほど樹脂に強く保持され溶出が遅くなりますその保持の強弱によって溶出時間が異なることを利用して分離がおこなわれます図にイオン排除のメカニズムを示しますシュウ酸のようなジカルボン酸は表に示すように二段階に解離します pkaは. とイオン性が高いことを示しており実際に分析するとウォーターディップ付近に溶出します pka の他にも側鎖型異性体は直鎖型異性体よりも早く溶出する二重結合を有する酸は遅く溶出する傾向があるなど有機酸の構造も溶出順序に作用します表有機酸類の解離定数 ( 化学便覧第版より ) <モノカルボン酸 > 和名 pka pka2 pka ギ酸. 酢酸.6 プロピオン酸.67 酪酸.6 イソ酪酸.6 吉草酸.6 イソ吉草酸.8 ヘキサン酸.6 オクタン酸.89 グリコール酸.6 乳酸.66 ピルビン酸 2.26 <ジカルボン酸 > 和名 pka pka2 pka シュウ酸..82 マロン酸コハク酸..2 グルタル酸.. アジピン酸.26. ピメリン酸..8 リンゴ酸.2.7 d 酒石酸アクリル酸.26 マレイン酸.7.8 フマル酸 2.8. フタル酸 2.7.9

2 <トリカルボン酸 > 和名 pka pka2 pka クエン酸図 2 は 2 種類のイオン排除カラムを用いた代表的な有機酸の測定例ですギ酸酢酸プロピオン酸の解離定数 (pka) はぞれぞれであり pka の低い順に溶出していることがわかります IonPac ICEAS は pka の大きい有機酸でも比較的早く溶出します IonPac ICEAS6 は pka の小さい有機酸類の分離に適したカラムです図 2 の分析条件カラム (A) IonPac ICEAS (B) IonPac ICEAS6 溶離液 (A). mmol/l オクタンスルホン酸 (B). mmol/l ヘプタフルオロ酪酸サプレッサー AMMSICE II 再生液 mmol/l 水酸化テトラブチルアンモニウム再生液流量 2. ml/min 恒温槽温度試料導入量 (A) 2μL, (B) μl ピーク (mg/l) 成分名 A B 成分名 A B シュウ酸 7 乳酸 2 酒石酸 8 ヒドロキシイソ酪酸クエン酸 9 酢酸 2 リンゴ酸 2 コハク酸グリコール酸プロピオン酸 6 ギ酸 2 酪酸図に雨水中の有機酸の測定例を示します雨水中にもわずかですが有機酸が含まれています図の分析条件カラム IonPac ICEAS6 溶離液. mmol/l ヘプタフルオロ酪酸サプレッサー AMMSICE II 再生液 mmol/l 水酸化テトラブチルアンモニウム再生液流量 2. ml/min 恒温槽温度試料導入量 μl.7 (A) IonPac ICEAS μs/ cm 図雨水中の有機酸の測定例 (B) IonPac ICEAS 図 2 イオン排除モードによる有機酸の測定例ピーククエン酸 9 酢酸 6 ギ酸炭酸 7 乳酸イオン交換モードでは溶離液の濃度を上げると測定成分の溶出時間は早くなりますがイオン排除モードでは溶離液の濃度を上げると溶出時間が遅くなる傾向がありますイオン排除モードで測定する際にはイオン排除専用のサプレッサー (AMMSICE II) が必要です強酸中の有機酸の測定イオン排除モードは試料中の強酸の影響を受けないという利点があります

3 図はイオン排除分離カラムを使用した醤油中に含まれる有機酸の測定例です醤油には多量の塩化物イオンが含まれているため陰イオン交換モードで測定をおこなうと塩化物イオンの付近に溶出してくる有機酸の定量ができませんしかしイオン排除モードでは塩化物イオンなどの強酸イオンはほとんど保持されないためウォーターディップ付近に溶出し有機酸のピークに影響を与えません図では 6 分付近に溶出しているピークが塩化物イオンですこのように強酸を多く含む試料中の有機酸の測定についてはイオン排除モードが適しています図の分析条件カラム IonPac ICEAS6 溶離液. mmol/l ヘプタフルオロ酪酸サプレッサー AMMSICE II 再生液 mmol/l 水酸化テトラブチルアンモニウム (TBAOH) 再生液流量 2. ml/min 恒温槽温度検出器電気伝導度検出器試料導入量 μl 試料前処理試料を超純水で倍希釈後ろ過図の分析条件カラム IonPac ICEAS 溶離液. mmol/l オクタンスルホン酸サプレッサー AMMS ICEII 再生液 mmol/l 水酸化テトラブチルアンモニウム / mmol/l ホウ酸試料導入量 μl 図イオン排除モードによる炭酸の測定例ピーク (mg/l) 2 炭酸図イオン排除モードによる醤油中の有機酸の測定ピーク塩化物イオン 7 乳酸クエン酸 9 酢酸リンゴ酸コハク酸 6 ギ酸イオン排除モードによる炭酸の測定イオン排除モードで炭酸を測定することができます再生液にホウ酸を加えるとピーク終了点付近のマイナス側への落ち込みを防ぐことができますなおこの条件では炭酸イオン (CO 2 ) は炭酸水素イオン (HCO ) として分離検出されるため炭酸イオンと炭酸水素イオンの分離はできません陰イオン交換モードによる有機酸の測定陰イオン交換モードは無機陰イオンと有機酸の同時測定が可能であり分離の調節も容易ですまた濃縮法も適用できるという利点があります高濃度の無機陰イオン中の有機酸を測定するためにはグラジエントシステム ( グラジエントポンプまたは溶離液ジェネレーター ) が必要な場合があります一般に陰イオン交換モードにおいてグリコール酸乳酸プロピオン酸酢酸ギ酸はフッ化物イオンから塩化物イオンの間に溶出しますまたリンゴ酸コハク酸酒石酸は硫酸イオン付近にシュウ酸は硫酸イオンより少し遅れて溶出しますクエン酸は陰イオン交換カラムの標準条件ではかなり遅くに溶出するかカラムの種類によっては溶出しない場合もあります陰イオン交換モードで測定する場合は無機陰イオンとの分離に注意する必要があります図 2 の (B) における成分のうちプロピオン酸とクエン酸を除いた成分を陰イオン交換モードで測定したクロマトグラムを図 6 に示します上図は有機酸類下図には無機陰イオンのクロマトグラムです

4 図 6 の分析条件カラム IonPac AGA, ASA 溶離液 8 mmol/l Na2CO, mmol/l NaHCO サプレッサー ASRSULTRA 恒温槽温度試料導入量 2μL 図 7 の分析条件カラム IonPac AG7, AS7 溶離液 KOH ( 溶離液ジェネレーター EG 使用 ) グラジエント 2 mmol/l (~8 min), 2~ mmol/l (8 ~2 min), ~ mmol/l (2~ min) 溶離液流量. ml/min サプレッサー ASRSULTRA 試料導入量 2μL 7,9 6 8, 図 6 イオン交換モードによる測定例ピーク (mg/l) グリコール酸シュウ酸 7 乳酸 F 9 酢酸 2 Cl 6 6 ギ酸 6 NO2 8 ヒドロキシイソ酪酸 7 Br 2 リンゴ酸 2 8 NO 2 コハク酸 9 HPO 2 2 酒石酸 2 SO 図 7 イオン交換モードにおけるグラジエント例ピーク (mg/l) 7 乳酸 F 2 9 酢酸 Cl 6 ギ酸 6 NO2 炭酸 7 Br コハク酸 8 NO リンゴ酸 2 SO 2 シュウ酸 9 HPO 2 クエン酸陰イオン交換モードではフッ化物イオンと塩化物イオンの間に溶出する乳酸グリコール酸酢酸ギ酸プロピオン酸などを十分に分離できないことがあります陰イオン交換カラムの種類および溶離液の種類や濃度を最適化すればある程度分離することもできますが硫酸イオンなどのように保持の強いイオンとの同時測定は困難ですこのような場合はイオン交換モードでグラジエントをおこなう必要があります図 7 に陰イオン交換カラムを用いた無機陰イオンと有機酸の一斉分析例を示します低濃度有機酸の測定イオン排除モードでは濃縮導入法 ( 濃縮カラムにイオンをトラップして感度を上げる操作 ) を適用できないため低濃度の有機酸は試料を大容量 (.~2 ml) 導入して測定する必要がありますしかしこの方法ではウォーターディップが大きくなるためフッ化物イオン付近に溶出する有機酸の定量が困難である場合や極低濃度の有機酸を検出することができない場合がありますイオン交換モードでは濃縮導入法を用いることで μg/l レベルの有機酸の測定が可能です図 8 は濃縮導入法を利用したμg/Lレベルの有機酸と無機陰イオンの同時測定例ですなお乳酸や酢酸などフッ化物イオン付近に溶出する有機酸類はコンタミネーションしやすい成分自体の安定性が低い濃縮カラムに保持されにくいなどの理由で極微量を再現性

5 よく濃縮することは難しいので注意してください ( 濃縮導入法については技術資料 TR78 をご覧ください ) 図 8 の分析条件カラム IonPac AG7, AS7 溶離液 KOH ( 溶離液ジェネレーター EG 使用 ) グラジエント mmol/l (~8 min), ~8 mmol/l (8 ~ min), 8 mmol/l ( min ~) 溶離液流量. ml/min サプレッサー ASRSULTRA 試料濃縮量 ml 図 8 有機酸と無機陰イオンの濃縮法によるクロマトグラムピーク (μg/l) F 8 NO 9 酢酸炭酸 6 ギ酸 2 SO 2 2 メタクリル酸シュウ酸 Cl 2 9 PO 6 NO2 22 o フタル酸 7 Br UV 検出器による有機酸の測定有機酸はカルボニル基 (COO) やベンゼン環などの紫外部に吸収を持つ官能基を有しているため紫外吸光光度 (UV) 検出器を用いて検出をおこなうことができますカルボニル基の吸光度はあまり大きくありませんが 2 nm 付近に極大吸収を持ちます表 2 に電気伝導度と UV 検出器 ( 2 nm) の検出感度の比較を示します表 2 より安息香酸や oフタル酸フマル酸は電気伝導度よりも UV の方がはるかに感度がよいことがわかります逆にギ酸やグリコール酸は電気伝導度の感度の方が良好です電気伝導度検出器と UV 検出器を直列に接続し同時に検出をおこなうこともできます溶離液に UV 吸収を持つ成分が含まれている場合 UV 検出器は使えません例えばイオン排除モードの溶離液のつであるオクタンスルホン酸は UV 吸収があるため UV 検出器による検出は不可能です表 2 電気伝導度と UV 検出器 ( 2 nm) の検出感度比較電気伝導度 UV 電気伝導度ピーク高さ * ピーク高さ * とUVの検出 (μs) (mau) 感度比 * 2 安息香酸イソ吉草酸イソ酪酸..6.7 ギ酸吉草酸... クエン酸..2. グリコール酸.2.9. グルコン酸コハク酸酢酸..6. 酒石酸.6.7. シュウ酸乳酸..2. oフタル酸フマル酸マレイン酸マロン酸酪酸.2.. Lリンゴ酸 *; mg/l の標準を 2 μl 導入したときの値 *2; それぞれの検出法においてベースラインノイズをとしたときのピーク強度を計算し UV に対する電気伝導度の値で示した有機酸測定時の注意事項有機酸は無機イオンと比べて分解が早いため標準液やサンプルは室温で保存せず冷蔵庫で保存するようにしてください mg/l レベルの有機酸は室温で晩放置しただけで分解してしまうことがあります低濃度の標準液は毎日調製し直すことをお勧めしますイオン排除モードの溶離液に使用するオクタンスルホン酸と再生液に使用する水酸化テトラブチルアンモニウムは市販されている試薬ではバックグラウンド電気伝導度が下がらないなどの問題が生じる恐れがあるため必ずダイオネクス社製の純正試薬をご使用ください

Microsoft Word - re92_Q&A5_2004年12月.doc

Microsoft Word - re92_Q&A5_2004年12月.doc TR17YS92 イオンクロマトグラフ Q & A その 5 イオンクロマトグラフィーにおける検出器について 213 235R はじめにイオンクロマトグラフィーではイオンが電気伝導度を有する性質を利用して電気伝導度検出器を用いますしかし電気伝導度検出器はイオンに対する選択性が低いため測定目的イオンだけを検出することはできないといった欠点がありまたイオンによっては十分な測定感度を得られない場合があります