研究成果報告書

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あおいつなかわ
4 years ago
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2 QT LQT LQT1 KCNQ1 KCNQ1 I Ks K + KCNE1 I Ks GqPCRGq KCNQ1 GqPCR AT 1 R α 1 α 1 AR α 1 AR KCNQ1 GqPCR KCNQ1 KCNQ1 KCNQ1 HaloTag KCNQ1-Halo Halo KCNQ1-Halo KCNQ1 KCNQ1 GFP ph uorin KCNQ1 KCNQ1 KCNQ1 KCNQ1 KCNQ1-β 2 AR KCNQ1 12 KCNQ1- β 2 β 2 AR PCR KCNQ1- α 1 AR Fugene6 HEK293 KCNQ1- α 1 AR HEK 293 β 2 AR HEK 293 KCNQ1- β 2 AR KCNQ1- in vitro crna KCNQ1- KCNQ1-2 ph Halo KCNQ1-Halo HEK293 ph Halo KCNQ1-Halo pet22b ph KCNQ1- KCNQ1- KCNQ1 KCNQ1- KCNQ1-1 KCNQ1-

A B たがネガティブな結果であったネガティブな結果であった以上のデータから以上のデータから現存する方法では現存する方法では現存する方法では目的とする変化を検出できないものと考え的とする変化を検出できないものとられた電流 (µa) 2.0 1.5 1.

KCNQ1- の電流の電流 A と電流と電流電圧関係電圧関係 B (2)細胞を用いた細胞を用いた細胞を用いたイメージングイメージング ① KCNQ1 KCNQ1- を発現させた細胞において α1ar 刺激によによるエンドサイトーシスでるエンドサイトーシスでの蛍光強度の蛍光強度が低下するか

の変化に応じてペリプペリプラズムに発現している蛋白周囲の ph 環境も変化すると考えられるためもと考えられるためと考えられるため大腸菌ペリプラズムに発現させたの蛍光を観察した後図 3A 3A ph を変化させ蛍光強を変化させ蛍光強度への影響を検討度への影響を検討した図図 3B

5 8 に変化させた際には蛍光のに変化させた際には蛍光の増強が観察されたが観察されたこれらの結果はほぼ報告さこれらの結果は報告されているの性質を反映している反映しているベクターのみを発現 A 現 ② β2ar- を発現させた細胞において同様の検討を行なったが ①とほぼ同様の

GFP 変異体を得ることが必要と考えられたそのため大腸菌のペリプラズムに導入蛋白を発現させる系を使用し検討を行ったを発 5 mm B ph 5.5 ph 7.0 ph 8.5 2 mm 図 3.

. A, B KCNQ1-- および α1aar を発現させた HEK 293 細胞においてフェニレフリン投与により受容体を活性化し性化しの蛍光を観察の蛍光を観察 C, D β2ar- を発現させた HEK293 細胞においてイソプロテレノール投与により受容体を活性化し受容体を活性化しの蛍光を観察

蛍光の明らかな減弱は認められなかった ④また AcidiFluor ORANGE 市販の ph 感受性 Halo リガンドを使用してエンドサイトーシスを検出できるかどうか検討し ② これまで ① これまで ①で検討したで検討したような性質を有ような性質を有するとの融合体を用いても目的とす

3 A B たがネガティブな結果であったネガティブな結果であった以上のデータから以上のデータから現存する方法では現存する方法では現存する方法では目的とする変化を検出できないものと考え的とする変化を検出できないものとられた電流 (µa) (3)大腸菌の蛋白発現系を用いた検討大腸菌の蛋白発現系を用いた検討 0.5 µ A 0.5 2s 電位位 (mv) 図 1. KCNQ1- の電流の電流 A と電流と電流電圧関係電圧関係 B (2)細胞を用いた細胞を用いた細胞を用いたイメージングイメージング ① KCNQ1 KCNQ1- を発現させた細胞において α1ar 刺激によによるエンドサイトーシスでるエンドサイトーシスでの蛍光強度の蛍光強度が低下するかするかどうかを検どうかを検討した図 2B B に示すように細胞膜上の蛍光は減少しているが細胞全体で見た時に時に明らかに蛍光が暗くなることは明らかに蛍光が暗くなることは明らかに蛍光が暗くなることは観察でき察できなかったなかった図 2A ①細胞外細胞外の ph 環境環境の変化に応じての変化に応じてペリプペリプラズムに発現している蛋白周囲の ph 環境も変化すると考えられるためもと考えられるためと考えられるため大腸菌ペリプラズムに発現させたの蛍光を観察した後図 3A 3A ph を変化させ蛍光強を変化させ蛍光強度への影響を検討度への影響を検討した図図 3B ph ph = 7.4 から ph から = に変化させたところ明らかな蛍光の減弱が観察されたまた逆に ph = に変化させた際には蛍光のに変化させた際には蛍光の増強が観察されたが観察されたこれらの結果はほぼ報告さこれらの結果は報告されているの性質を反映している反映しているベクターのみを発現 A 現 ② β2ar- を発現させた細胞において同様の検討を行なったが ①とほぼ同様の結果であった結果であった図 2C, D β 2AR は刺激によってエンドサイトーシスを起こす代表的な受容体であるため今回の目的を達成するためにを使用することは難しいものと考えられた本研究の目的を達成するためには中性環境と酸性環境における蛍光強度の差がよりもかなりかなり大きな大きな GFP 変異体を得ることが必要と考えられたそのため大腸菌のペリプラズムに導入蛋白を発現させる系を使用し検討を行ったを発 5 mm B ph 5.5 ph 7.0 ph mm 図 3. A 大腸菌のペリプラズムにベクターのみ左側大腸菌のペリプラズムにベクターのみ左側および右側を発現させ中性環境で蛍光を観察右側を発現させ中性環境で蛍光を観察 B をペリプラズムに発現させた大腸菌において細胞外 ph を変化させた際の蛍光を観察図 2.. A, B KCNQ1-- および α1aar を発現させた HEK 293 細胞においてフェニレフリン投与により受容体を活性化し性化しの蛍光を観察の蛍光を観察 C, D β2ar- を発現させた HEK293 細胞においてイソプロテレノール投与により受容体を活性化し受容体を活性化しの蛍光を観察 ③培養細胞を用いた検討の結果からすると培養細胞を用いた検討の結果からすると否定的であったが否定的であったがツメガエル卵母細胞ツメガエル卵母細胞に KCNQ1- を発現させ細胞表面を発現させ細胞表面の蛍光強度を α1ar 刺激前後で観察した結果として結果として蛍光の明らかな減弱は認め蛍光の明らかな減弱は認められなかった ④また AcidiFluor ORANGE 市販の ph 感受性 Halo リガンドを使用してエンドサイトーシスを検出できるかどうか検討し ② これまで ① これまで ①で検討したで検討したような性質を有ような性質を有するとの融合体を用いても目的とすとの融合体を用いても目的とする KCNQ1 のエンドサイトーシスを検出できなかったそのためきなかったそのため ph ph 感受性がより高い変異体が必要である高い変異体が必要であるがが残念ながら残念ながら研究期間内にそのような変異体を得るこ研究期間内にそのような変異体を得とはできなかったとはなかった本研究は挑戦的萌芽研究として刺激伝導本研究は挑戦的萌芽研究として刺激伝導系が維持された状態のランゲンドルフ灌流心臓を用いて器官レベルで KCNQ1 の発現量変化を検出する系を確立することを目的として計画した我々が明らかにしてきた受我々が明らかにしてきた容体刺激による KCNQ1 のエンドサイトーシスが生理的病態生理的意義を有することを明らかにするためには培養細胞だけではなく器官レベルの検討く器官レベルの検討が必要であるが必要であるで期待する結果が得られなかった場合に

4 GFP ph GFP 6 Obara Y, Nagasawa R, Nemoto W, Pellegrino MJ, Takahashi M, Habecker BA, Stork PJ, Ichiyanagi O, Ito H, Tomita Y, Ishii K, Nakahata N. ERK5 induces ankrd1 for catecholamine biosynthesis and homeostasis in adrenal medullary cells. Cell Signal Mar;28(3): Honda T, Obara Y, Yamauchi A, Couvillon AD, Mason JJ, Ishii K, Nakahata N. Phosphorylation of ERK5 on Thr732 is associated with ERK5 nuclear localization and ERK5-dependent transcription. Wu M, Obara Y, Norota I, Nagasawa Y, Ishii K. Insulin suppresses I Ks (KCNQ1/ KCNE1) currents, which require β-subunit KCNE1. Pflügers Archiv - Eur J Physiol. 2014; 466: Susuki H, Kanemaru K, Ishii K, Ohkura M, Ohkubo Y, Iino M. Imaging intraorganellar Ca2+ at subcellular resolution using CEPIA. Nat. Commun. 2014; 5: Ishii K, Wu M, Obara Y. Is PIP2 involved in the insulin effect? Channels. 2014; 8: Ca v PIP Kv1.5 Kir Cl Cav Nasu F Ishii K Azelnidipine reduces cell-surface expression of Cav1.2 channel Cav Cav Cav Internalization of KCNQ1 by activation of the 1 adrenergic receptor α 1 KCNQ

5 Q1/E1 PIP

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研修コーナー l l l l l l l l l l l α α β l µ l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l