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1 C 型肝炎の予防 治療薬 Drug to prevent and treat hepatitis C いわき明星大学客員教授田中晴雄 広域多摩地域の大学発新技術説明会 7/2/2013 JST 東京別館 1

2 いわきのニュース 提供元 : いわき民報社明星大の研究グループアクチノヒビン C 型肝炎への効果も発見 2012 年 12 月 21 日エイズを引き起こすウイルスHIV 1に結合して 感染を阻止できるタンパク質 アクチノヒビン の立体構造について研究してきた いわき明星大薬学部の田中晴雄教授 ( 副学長 ) と竹中章郎教授らのグループは アクチノヒビンがエイズウイルスだけではなく C 型肝炎ウイルスの肝細胞への感染を低濃度で阻止することができることを発見し 今月 8 日 特許庁に特許出願した 田中教授らが20 日 記者会見して明らかにした C 型肝炎は国内感染者が約 200 万人いるとされる 治療には週 1 回のインターフェロン注射と1 日 2 回の錠剤服用などを行うものの ウイルス除去率は約 70% で副作用も伴う 今回発見されたアクチノヒビンは副作用が尐なく 早期にウイルス除去可能な薬剤の開発が期待されている 田中 竹中教授らはアクチノヒビンがエイズウイルスの高マンノース糖鎖とよばれる部位と結合し 抗 HIV 活性を示すことを突き止めていたが 研究の中で C 型肝炎ウイルスにも高マンノース糖鎖が存在するとみられることが分かったという 田中教授らは今後小動物での実験を実施しながら安全性を高めていきたいと述べた エイズ新薬 C 型肝炎新薬については 5 年ほどかかるのではないか としている 広域多摩地域の大学発新技術説明会 7/2/2013 2

3 C 型肝炎とは.. 病原体 :C 型肝炎ウイルス (HCV) 感染経路 : 注射器の回し打ち 長期の血液透析 入れ墨 消毒不十分な器具でのボディピアス等による血液感染 症状 : 自覚症状はあまりない まれに 全身倦怠感 食欲不振 悪心 嘔吐 黄疸 進行すると 肝硬変 肝癌 広域多摩地域の大学発新技術説明会 7/2/2013 3

4 現在の C 型肝炎の治療 1. ペグインターフェロン (PEG-IFN)+ リバビリン (RB) の併用 2. PEG-IFN+RB+ テラプレビルの 3 剤併用 問題点 インターフェロン テラプレビルによる副作用 著効率 ( 三剤併用でも SVR 率は 70%) テラプレビルは IFN RB 併用が前提 治療効果の向上副作用の軽減が必要 新規薬剤の開発が望まれている 広域多摩地域の大学発新技術説明会 7/2/2013 テラプレビル 4

5 HCV ゲノムと産生されるウイルスタンパク質 プロテアーゼ ポリメラーゼ 5

6 HCV の増殖様式 uncoating entry binding Golji apparatus release ER Nuc. assembly replication transcription/translation Lipid Droplet 広域多摩地域の大学発新技術説明会 7/2/2013 6

7 HCV receptors and infection (model) LDLR GAG SR-BI CD81 CLDN1 OCLN CLDN1 OCLN Ploss A et al, EMBO Rep. 2009;10(11): HCV のエンベロープは CD81, CLDN1 と会合することから 感染時の重要性が指摘されている広域多摩地域の大学発新技術説明会 7/2/2013 7

8 HCV Envelope protein (E2) の糖鎖付加部位 (N-linked) HCV-2a HCV-1b N-linked 糖鎖付加部位はウイルスの型に関わらず保存されている 広域多摩地域の大学発新技術説明会 7/2/2013 8

9 アクチノヒビン (AH) 放線菌が産生する高マンノース型糖鎖を認識するレクチン HIV の細胞への感染を阻止 :HIV 外套糖タンパク質 gp120 の糖鎖に結合する 114 アミノ酸を含み 38 アミノ酸からなる 3 つのセグメント gp120 のマンノース (Man) を多く含む糖鎖 ( 高マンノース型糖鎖 ) に結合することにより抗 HIV 活性を示す HCV を阻害するかどうかはわからない 広域多摩地域の大学発新技術説明会 7/2/2013 9

10 Infectivity (%) RESULT AH はウイルス感染を阻害する AH 二量体 (HisTEV-AH Dimer) は阻害効果が強い nm 広域多摩地域の大学発新技術説明会 7/2/

11 感染の仕方 4 o C 細胞内 37 o C 細胞内 広域多摩地域の大学発新技術説明会 7/2/

12 まとめ (1) HCV エンベロープは高マンノース糖鎖の存在が考えられる ( 複合体型糖鎖の存在を無視する物ではない ) (2) AH HisTEV-AH Dimer は HCV 感染の初期に働いて抗ウイルス作用を示す (3) AH および AH Dimer の IC50 AH : 300 nm HisTEV-AH Dimer : nm (cf: IC50 of AH for HIV-1/HIV-2 is nm) (PNAS USA, 106: , 2009) HIV に対する IC50 に比較すると高めである ( 理由不明 ) AHとその誘導体は抗 HCV 剤になる可能性が考えられる特に IFN 治療失敗症例分離株への抗 HCV 活性に興味が持たれる 広域多摩地域の大学発新技術説明会 7/2/

13 HCV 糖鎖 高マンノース型糖鎖 複合型糖鎖 mannose sialic acid N N galactose fucose N-acetylglucosamine 以上の結果は HCV には 3 本以上の高マンノース型糖鎖が存在し 細胞への感染に重要な役割を果たしていることを示す AH は HCV の糖タンパク質 ( 恐らく E2) に結合することにより 抗 HCV 活性を示す 広域多摩地域の大学発新技術説明会 7/2/

14 アクチノヒビンの阻害作用 for HCV infection(model) AH AH AH LDLR GAG SR-BI CD81 CLDN1 OCLN CLDN1 Ploss A et al, EMBO Rep. 2009;10(11): OCLN HCV のエンベロープの糖鎖にアクチノヒビン (AH) が結合して CD81, CLDN1 との会合を阻止することにより感染を阻止 広域多摩地域の大学発新技術説明会 7/2/

15 今後の計画 高活性 AH 誘導体の調製 すでに得られた Peg 修飾体 :AH-5kPeg-AH の抗 HCV 活性の測定 HCV が感染できるキメラマウスを用いる感染治療試験 特に IFN 治療失敗患者から分離された HCV 株に対する抗 HCV 活性の有無 小動物を用いる安全性試験と体内動態 広域多摩地域の大学発新技術説明会 7/2/

16 HIV の接着 侵入のための安全な評価系 組換え細胞を用いる合胞体形成系 - Cell expressing HIV env and tat Syncytium formed expresses b -galactosidase env Tat Cell expressing CD4, co-receptor and HIV-1 LTR linked to the lacz coreceptor 融合 + X-gal CD4 LTR Lac Z 広域多摩地域の大学発新技術説明会 7/2/2013 Chiba, H., J. Antibiot. 54: ,

17 抗 HIV タンパク質アクチノヒビン (AH) の発見 合胞体形成を阻害する抗 HIV 抗生物質のスクリーニング Number of strains tested Active strains Actinomycetes Bacteria Fungi Total Strain having anti-hiv activity K (Actinohivin) 0 FO-8017* 0 1 *Mycophenolic acid was isolated from the culture. It inhibits syncytium formation by reducing gp120 expression (J.Antibiot. 58: 514-8, 2005). AH 生産菌 Longispora albida K T (Scale: 1 µm) AH のアミノ酸配列 Chiba, H., et al: J. Antibiot.54: , Chiba, H., et al: Biochem. Biophys. Res. Commun. 282: , Inokoshi, J., et al: Biochem. Biophys. Res. Commun. 282:1261-5, Chiba H., et al: Biochem. Biophys. Res. Commun. 316: , Takahashi, A., et al: Arch. Biochem. Biophys. 437: , 広域多摩地域の大学発新技術説明会 7/2/

18 AH の結晶構造 hydrophobic core (1)AH は 3 つのセグメントのからなり それぞれに LD-QXW モチーフからなる糖鎖結合ポケットが存在する (2) この糖鎖結合ポケットは α (1, 2)mannobiose を含む高マンノース型糖鎖のみに結合する (3) 全ての糖鎖結合ポケットに高マンノース型糖鎖が結合したときのみ強い親和性を示す Tsunoda, M. et al., Acta Cryst. A64, C237, 2008, Tanaka, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106, 広域多摩地域の大学発新技術説明会 7/2/ , 2009

19 Protein: Actinohivin Impact factor

20 (a) 上から見た図 (b) 横から見た図 高マンノース型糖鎖と AH の結合モデル 1 分子の AH に 3 分子の高マンノース型糖鎖が結合した場合にのみ強い親和性を示す ( レクチンのクラスター効果による ) 広域多摩地域の大学発新技術説明会 7/2/

21 糖鎖と糖タンパク質に対する結合における AH と CV-N との比較 Tanaka et al. PNAS, 2009 AH は多くの高マンノース型糖鎖を持つ糖たんぱく質にしか結合しない 結果として 安全性が高い 細胞毒性 マイトジェン活性 細胞刺激性などを示さない Matoba N et al, PLoS ONE, 2010, 5 (6) e11143 Hoorelbeke B et al, Antimicrob Agents Chemother, 2010, 54: 広域多摩地域の大学発新技術説明会 7/2/

22 AH の polyethylene glycol (PEG) 修飾体の構築 反応液 : 1.2 mm AH, 2.4 mm 5k/10k PEG-Aldehyde, 20 mm NaBH 3 CN, 20 mm 酢酸緩衝液 (ph 5)/30% CH 3 CN 広域多摩地域の大学発新技術説明会 7/2/

23 AH 及び誘導体の溶解度と生物活性 * HeLa/T-env/Tat と Hela/CD4/LacZ の組み換え細胞を用いた合胞体形成阻害活性を測定 ** SHIV : HIV と SIV の組み換えウイルス (( 独 ) 国立病院機構名古屋医療センター臨床研究センター感染 免疫研究部杉浦亙らとの共同研究 ) AH-5kPEG-AH は AH より 6 倍強い抗 SHIV 活性を示す 広域多摩地域の大学発新技術説明会 7/2/

24 実用化に向けた課題 HCV 外套糖タンパク質の構造解明 細胞から細胞への HCV 感染阻止 ウイルスを除去できる可能性の確認 毒性がないことの確認 企業への期待 実用化に向けた課題に関する共同研究 C 型肝炎予防 治療薬としての事業化 広域多摩地域の大学発新技術説明会 7/2/

25 本技術に関する知的財産権 発明の名称 :C 型肝炎治療剤 出願番号 : 特願 (2012/12/08) 発明者 : 田中晴雄 出願人 : 学校法人明星学苑 広域多摩地域の大学発新技術説明会 7/2/

26 問い合わせ先 (1) いわき明星大学薬学部田中晴雄 TEL & FAX: (2) いわき明星大学産学連携研究センター TEL & FAX: (3) タマティーエルオー株式会社 研究成果移転事業部松永義則 TEL: FAX: 広域多摩地域の大学発新技術説明会 7/2/

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