取扱説明書

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あいりいいはた
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20-05 新型コロナウイルス検出キット (SARS-CoV-2 Detection Kit) - N set- Code: NCV-101 - N2

1 20-05 新型コロナウイルス検出キット (SARS-CoV-2 Detection Kit) - N set- Code: NCV N2 set- Code: NCV-102 取扱説明書 TOYOBO CO., LTD. Biotech support Department OSAKA JAPAN -0-

2 目次 [1] はじめに 2 [2] 製品内容 3 [3] 保存温度 4 [4] 製品のほかに用意するもの 4 [5] プロトコール 5 (1) 前処理 5 (2) RT-PCR 反応液の調製添加 5 (3) RT-PCR サイクル条件 6 [6] 判定例 7 [7] 陽性コントロールの検出例 8 [8] トラブルシューティング 10 ご注意本製品に含まれる試薬はすべて研究用試薬です診断および臨床検査には使用しないでください本製品は臨床診断薬ではありません本製品の使用にあたっては実験室での一般の注意事項を厳守し安全に留意してください本製品に含まれる前処理液は消防法上の危険物第四類第三石油類危険等級 Ⅲ 水溶性に該当します周囲に火気および高温物がない事を確認し使用してくださいまた SDS を参考に適切な廃棄方法にて廃棄を行ってください試料および使用器具は感染性を有するものとして各施設の安全規定に従って使用および廃棄を行ってください -1-

3 [1] はじめに本製品は新型コロナウイルス (SARS-CoV-2) 検出のためのリアルタイム 1-step RT-PCR キットです試料を前処理液と混合後 RNA 抽出精製作業を行うことなく 1-step RT-PCR 反応に供しウイルス RNA を検出します検出のためのプライマープローブは国立感染症研究所発行の病原体検出マニュアル 2019-nCoV Ver に記載されている N セット (Code:NCV-101) N2 セット (Code: NCV-102) を採用しています本製品の特長核酸の抽出精製は必要ありません作業途中でチューブの開閉をする必要がなくサンプルの飛散リスクを低減できます逆転写反応から PCR までをワンステップで行います反応途中で試薬を添加する必要はありません蛍光プローブを用いた測定を行います電気泳動の必要はありませんキャリーオーバー汚染防止のため Uracil-DNA Glycosylase (UNG) による増幅産物の分解を行います蛍光プローブを用いた測定により高い特異性で高感度を達成しています 1 反応当たり 50 コピーの検出を確認しています * 対象とする試料によっては検出に影響する可能性がありますご使用になる試料を添加した反応液に対し陽性コントロール RNA のスパイク試験を行い事前に検出感度を確認くださいスパイク試験は前処理液で処理したサンプルに陽性コントロール RNA を添加して行います陽性コントロールとしては ( 株 ) 日本遺伝子研究所製新型コロナウイルス (ncov) 陽性コントロール RNA などがご使用になれます -2-

4 [2] 製品内容本製品には以下の試薬が含まれており 100 回用としてご使用になれます試薬名容量 1 前処理液 1,000μL 2 反応液 1,100μL x 3 3 酵素液 550μL 4 プライマープローブ液 (N セットまたは N2 セット ) *1, 550μL N セット検出用 Code : NCV-101 N2 セット検出用 Code:NCV-102 *1 プライマープローブは国立感染症研究所発行病原体検出マニュアル 2019-nCoV Ver (2020 年 3 月 19 日現在 ) 記載の配列を使用しています N セット (Code: NCV-101) N2 セット (Code: NCV-102) Name Sequence (5 to 3 ) プライマー N_Sarbeco_F1 CACATTGGCACCCGCAATC N_Sarbeco_R1 GAGGAACGAGAAGAGGCTTG プローブ *2 N_Sarbeco_P1 ACTTCCTCAAGGAACAACATTGCCA プライマー NIID_2019-nCOV_N_F2 AAATTTTGGGGACCAGGAAC NIID_2019-nCOV_N_R2 TGGCAGCTGTGTAGGTCAAC プローブ *2 NIID_2019-nCOV_N_P2 ATGTCGCGCATTGGCATGGA *2 本プローブは FAM チャネルで検出します 3 酵素液は転倒混和により撹拌しスピンダウンしてからチューブのふたを開けてください 3 酵素液以外は使用する直前に解凍しボルテックスミキサーでよく攪拌してくださいその後スピンダウンしてからチューブのふたを開けてください使用後は速やかに-20 で保存してください 1 前処理液は室温でも保存可能です * 本製品には陽性コントロール RNA は付属しておりません ( 株 ) 日本遺伝子研究所製新型コロナウイルス (ncov) 陽性コントロール RNA などがご使用になれます -3-

5 [3] 保存温度本製品に含まれる試薬はすべて -20 保存です 1 前処理液は解凍後室温保存も可能です [4] 製品のほかに用意するものリアルタイム PCR 装置 (FAM チャネル対応 ) ボルテックスミキサーピペットなどチップチューブなど消耗品スピンダウン用遠心機 -4-

6 [5] プロトコール (1) 前処理 1 前処理液は消防法上の危険物第四類第三石油類に該当しますので周囲に火気および高温物がない事を確認し使用してください 1 前処理液を使用する直前に解凍し室温まで戻してボルテックスミキサーでよく攪拌してくださいその後スピンダウンしてからチューブのふたを開けてください 1 前処理液は氷上において凝固しますので室温にてご使用ください 1 下記の量を PCR チューブに調製してください調製する際は 1 前処理液が PCR チューブの底に完全に落ちきったことを確認し試料を PCR チューブの底に添加してください試料は 1~3 μl まで添加可能です滅菌水等による添加する試料の量に応じた反応液量の調整は必要ありません 1 反応あたりの調製量 1 前処理液 3 μl 試料 1~3 μl / 陽性または陰性コントロール合計 4~6 μl * 前処理液 9 μl 試料 3~9 μl を混合しこの処理液の 1/3 量 (4~6μL) を次工程の PCR に使用いただくことも可能ですこの場合次工程の反応液に持ち込む1 前処理液量は 3μL 分になるようにしてください * 陽性または陰性コントロールを検出する際も必ず前処理液を添加してください 2 直ちに次の工程にはいります ( 前処理後の液は保存できません ) (2) RT-PCR 反応液の調製添加 1 反応あたり下記の量をマスターミックスとして必要反応数分調製します 2 反応液 4プライマープローブ液は使用する直前に解凍しボルテックスミキサーでよく攪拌してくださいその後スピンダウンしてからチューブのふたを開けてください 3 酵素液は氷上に置いて使用するかまたは使用する直前に-20 から取り出し使用後は直ぐに-20 に戻してください -5-

7 1 反応あたりの調製量 2 反応液 30 μl 3 酵素液 5 μl 4プライマープローブ液 5 μl (N セットまたは N2 セット ) 合計 40 μl * 複数の試料の反応を行う場合は反応数 +10% 程度を目安に反応液を調製してください 1 反応あたり 40 μl を (1) の前処理済み懸濁液に添加しますチューブキャップでふたをしますチューブキャップでふたをした後タッピングまたはボルテックスミキサーを用いて反応液を混合した後スピンダウンして下さい直ちに次の温度サイクルで反応を行います (3) RT-PCR サイクル条件下記の温度サイクルで反応します LightCycler 96, LightCycler480 Instrument II, CFX96 Touch Deep Well 逆転写反応 42 5 分プレ変性秒変性 95 1 秒会合 50 3 秒伸長秒検出 X45~50サイクル * 反応終了後反応液が白濁しておりますが検査結果には影響しませんその他の機種については弊社テクニカルラインまでお問い合わせください -6-

8 [6] 判定例 (1) N セット (Code : NCV-101) と N2 セット (Code : NCV-102) をご使用の場合 N セット N2 セット判定陽性 40 >40 または検出されず陽性 >40 または検出されず 40 陽性 >40 または検出されず >40 または検出されず陰性 ( 検出感度以下 ) * 陽性コントロールで Ct 40 の立ち上がりが認められない場合や陰性コントロールで立ち上がりが認められる場合は再測定とします * 検体測定において Ct>40 の立ち上がりが認められる場合は再測定することを推奨します (2) N2 セット (Code : NCV-102) をご使用の場合国立感染症研究所病原体検出マニュアルの検査法の運用について ( 第 3 版 ) に記載の通り NCV-102 のみを使用する場合は以下のように判定します N2 セット判定 40 陽性 >40 または検出されず陰性 ( 検出感度以下 ) * 陽性コントロールで Ct 40 の立ち上がりが認められない場合や陰性コントロールで立ち上がりが認められる場合は再測定とします * 検体測定において Ct>40 の立ち上がりが認められる場合は再測定することを推奨します -7-

[7] 陽性コントロールの検出例 (1) LightCycler480 Instrument II 陽性コントロール RNA 50,000~50 コピー (10 倍希釈系列 ) を n=2 5 コピーを n=5 陰性コントロールを n=2 で検出し Abs Quant/2nd Derivative Max for All Samples で解析しましたコピー数 N セット Cq 値 N2

9 [7] 陽性コントロールの検出例 (1) LightCycler480 Instrument II 陽性コントロール RNA 50,000~50 コピー (10 倍希釈系列 ) を n=2 5 コピーを n=5 陰性コントロールを n=2 で検出し Abs Quant/2nd Derivative Max for All Samples で解析しましたコピー数 N セット Cq 値 N2 セット Cq 値 N/A N/A N/A 38.1 N/A 5 N/A N/A 陰性コントロール N/A N/A N/A N/A N セット N2 セット (2) LightCycler 96 陽性コントロール RNA 50,000~50 コピー (10 倍希釈系列 ) を n=2 5 コピーを n=4 陰性コントロールを n=2 で検出しましたコピー数 N セット Cq 値 N2 セット Cq 値 N/A N/A N/A N/A N/A N/A 陰性コントロール N/A N/A N/A N/A -8-

10 N セット N2 セット (3) CFX96 Touch Deep Well 陽性コントロール RNA 50,000~5 コピー (10 倍希釈系列 ) を n=2 陰性コントロールを n=2 で検出しましたコピー数 N セット Cq 値 N2 セット Cq 値陰性コントロール N/A N/A N/A N/A N セット N2 セット -9-

11 [8] トラブルシューティング現象原因対策試料が多すぎる試料を少なくして再検査する前処理液と懸濁液上清が混前処理液および懸濁液上清が PCR チ合されていないューブの底にて混合されていることを確陽性試料が検出認してくださいできないキャリーオーバー汚染が試薬水を廃棄後汚染除去作業 ( 拭き発生している取り UV 照射等 ) を実施してください試薬が劣化している試薬を新しいものに交換する陰性コントロールが陽性になるすべての試料が陽性になるキャリーオーバー汚染が発生している試薬水を廃棄後汚染除去作業 ( 拭き取り UV 照射等 ) を実施してくださいより詳細な情報は弊社ウェブサイトをご覧ください東洋紡バイオテクサポート事業部ウェブサイト

製造販売元 - 価格在庫に関するお問い合わせ - 東洋紡株式会社バイオテクサポート事業部 ( 大阪 ) 530-8230 大阪市北区堂島浜二丁目 2 番 8 号 TEL 06-6348-3786 FAX 06-6348-3833 E-mail : order_lifescience@toyobo.

12 製造販売元 - 価格在庫に関するお問い合わせ - 東洋紡株式会社バイオテクサポート事業部 ( 大阪 ) 大阪市北区堂島浜二丁目 2 番 8 号 TEL FAX order_lifescience@toyobo.jp 東洋紡株式会社バイオテクサポート事業部 ( 東京 ) 東京都中央区京橋一丁目 17 番 10 号住友商事京橋ビル TEL FAX order_lifescience@toyobo.jp - 製品の内容技術に関するお問い合わせ - テクニカルライン TEL FAX 開設時間 9:00~12:00, 13:00~17:00 ( 土日祝日休日を除く ) tech_osaka@toyobo.jp [URL]

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取扱説明書 Realtime PCR Master Mix Realtime PCR Master Mix トラブルシューティング SYBR Green Realtime PCR Master Mix トラブルシューティングは p3 へ 1. 増幅がみられない乱れる原因対策検出機器の設定などが蛍光色標識に用いられている蛍光色素の種類によって検素に適合していない出機器の設定を変更する必要があります設定を適正化して再解析してください