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1 Title 脂 質 代 謝 の 制 御 を 担 う 転 写 因 子 SREBPに 関 する 研 究 Author(s) 井 上, 順 Citation Issue Date Text Version ETD URL DOI Rights Osaka University

2 ー 圃 ι ω 01: 印 - o a ω R O B ω V n ω 一 田 c一 o O 苫 コ Q S S E - o a ω R n O一 o 0 コ い マ o 一 勺 n弘 y m w m 要 a 脂 質 代 謝 の 制 御 を 担 う 転 写 因 子 SREBP に 関 する 研 究 000 年 井 上 J( 慎

3 脂 質 代 謝 の 制 御 を 担 う 転 写 因 子 SREBP に 関 する 研 究 000 年 井 上 順

4 目 次 緒 論 本 論 第 一 章 SREBP - 2 遺 伝 子 の SREBP による 転 写 調 節 第 一 節 SREBP-2 遺 伝 子 の 細 胞 内 コレステロール 量 に 応 じた 転 写 変 動 第 二 節 コレステロールに 対 する 応 答 に 必 須 なプロモーター 領 域 の 同 定 第 三 節 SREBP-2 遺 伝 子 プロモーター 領 域 における SRE - l および CCAATBox に 結 合 するタンパク 質 の 同 定 第 四 節 考 察 および 小 括 第 二 章 スクアレン 合 成 酵 素 および HMG-CoA 合 成 酵 素 遺 伝 子 の SREBP による 転 写 調 節 第 一 節 コレステロールに 対 する 応 答 に 必 須 なプロモーター 領 域 の 同 定 第 二 節 スクアレン 合 成 酵 素 および HMG-CoA 合 成 酵 素 遺 伝 子 プロモーター 領 域 の CCAAT Box に 結 合 するタンバク 質 の 同 定 第 三 節 SRE-l と CCAATBox の 間 隔 が SREBP による 転 写 活 性 化 におよぼす 影 響 第 四 節 考 察 および 小 括 第 三 章 SREBP が 転 写 を 冗 進 する 新 規 遺 伝 子 の 探 索 第 一 節 SREBP-la 発 現 細 胞 株 の 樹 立 第 二 節 SREBP-la によって 転 写 が 充 進 する 遺 伝 子 のクローニング 第 三 節 細 胞 内 コレステロールレベルに 応 じた 転 写 変 動 第 四 節 考 察 および 小 括 第 四 章 脂 肪 細 胞 分 化 過 程 における SREBP の 発 現 第 一 節 脂 肪 細 胞 分 化 過 程 における SREBP-l SREBP-2 の 転 写 レベルでの 発 現 32 第 二 節 脂 肪 細 胞 分 化 過 程 における SREBP-l SREBP-2 のタンパク 質 レベルでの 発 現 第 一 節 考 察 および 小 括 総 括 1 小 E 士 口 三 ロ 全 附 謝 辞 参 考 文 献

5 常 者 三 δ 再 開 コレステロールは 動 物 界 に 広 く 分 布 し 特 に 脳 神 経 組 織 や 副 腎 に 多 く 含 まれるが そ の 他 の 臓 器 にも 普 遍 的 に 存 在 する 細 胞 膜 オルガネラ 膜 ミエリン 鞘 などの 構 成 成 分 をなすとともに 胆 汁 性 腺 ホルモン 副 腎 皮 質 ホルモン ビタミン D などの 前 駆 体 と なる 重 要 な 脂 質 である 生 体 は アセチル CoA を 基 質 として 20 段 階 以 上 の 酵 素 反 応 を 介 してコレステロールを 産 生 する( )と 同 時 に 細 胞 表 面 の LDL レセプターを 介 した LDL 粒 子 のエンドサイトーシス( )によりコレステロールを 取 り 込 んでいる (Fig. ) 動 脈 硬 化 を 抑 制 する 抗 高 脂 血 症 治 療 薬 として 広 く 用 いられているフラパスタチンは コレステロール 生 合 成 経 路 の 律 速 酵 素 である HMG CoA 還 元 酵 素 の 阻 害 剤 である こ の 薬 は コレステロール 生 合 成 を 阻 害 するととにより 肝 臓 から 血 策 中 に 分 配 されるコ レステロールを 減 らし また LDL レセフターを 誘 導 して 血 中 からのコレステロールの 取 り 込 みを 増 やすことにより 血 中 コレステロール 量 を 抑 制 する( ) 細 胞 内 コレステ ロールの 欠 乏 による LDL レセフターの 誘 導 は 主 に 転 写 レベルで 行 われている LDL レ セプター 遺 伝 子 以 外 にも コレステロール 代 謝 経 路 において 子 HMG-CoA 合 成 酵 素 遺 伝 HMG-CoA 還 元 酵 素 遺 伝 子 の 転 写 が 細 胞 内 コレステロールの 欠 乏 によって 促 進 され ることが 明 らかになっている( ) すなわち 細 胞 内 コレステロール 量 が 過 剰 になると コレステロール 合 成 と LDL の 取 り 込 みが 減 少 し 逆 に 細 胞 内 コレステロール 量 が 欠 乏 すると コレステロール 合 成 と LDL の 取 り 込 みが 増 加 する LDL レセプタ 一 遺 伝 子 のプロモーター 領 域 の 詳 細 な 解 析 の 結 果 ステロールによって 特 異 的 に 調 節 を 受 ける 塩 基 配 列 ( 1 以 下 SRE - 1 と 略 す)が 見 いだ された(, ) さらに SRE-l に 特 異 的 に 結 合 するタンパク 質 が 同 定 および 精 製 され protein) と 名 付 けられた (7)0 SREBP は 少 なくと も 2 種 類 ( SREBP-l と SREBP-2 )が 存 在 しており それらはアミノ 酸 レベルで 約 47 の 相 向 性 をもち いずれも SRE-1 に 結 合 することによって LDL レセフター 遺 伝 子 など の 転 写 を 活 性 化 する (8, 9)0 SREBP はその DNA 結 合 ドメインから bhlh-zip (ベーシッ ク ヘリックス ルーフ ヘリックス ロイシンジッパー)ファミリーに 分 類 される( SREBP-l には mrna の 5' および 3' 末 端 側 スフライシングの 違 いによるものと 思 われる la lb lc が 存 在 する (8)0 SREBP-l の mrna は LDL レセプターが 多 く 発 現 し ている 肝 臓 や 副 腎 において 高 い 発 現 が 見 られる 一 方 SREBP-2 の m 貯 ~A は 肝 臓 や 副 腎 SREBP-l の 発 現 量 の 少 ない 心 臓 脳 肺 においても 大 量 に 発 現 している (8.9) 現 在 のところ SREBP-l は fatty syn 出 ase 11) や acetyl - CoA carbo 均 1lase )など 主 に 脂 肪 酸 代 謝 関 連 遺 伝 子 を SREBP-2 は 主 にコレステロール 代 謝 関 連 遺 伝 子 の 転 写 を 調 節 すると 考 えられている SREBP による 転 写 調 節 の 概 要 を 次 に 示 した( SREBP は 合 成 後 2 ヶ 所 の 膜 貫 通 領 域 を 介 して 核 膜 又 は 小 胞 体 膜 に 約 1150 アミノ 酸 残 基 からなる 前 駆 体 として 局 在 す る( N 末 端 側 の 約 500 アミノ 酸 残 基 はサイトソル 側 に 位 置 し 2 ヶ 所 の 膜 貫 通 領 域 の 問 すなわち 小 胞 体 内 腔 には 約 30 アミノ 酸 残 基 が 位 置 する そして C 末 端 側 の

6 > タ Synthase~ ん 一 入 HMG CoA : 以.~ Reduω"~ Ac 凶 oacetyl ま 一 一 Isopentenyl Geranyl pp Farnesyl PP Transc :::::CMEterol 112 町 四 一 g~ 民 舌 院 o 伽 目 ω 凶 刷 批 1I 山 刷 i 比 ωc 凶 帥 山 ho 山 一 長 号 臼 拘 伽 ωro - 削 町 的 ω i endogenously, acetyト CoA exogenously, up 凶 臼 of 約 500 アミノ 酸 残 基 がサイトソル 側 に 位 置 する( SREBP は 細 胞 内 コレステロー ルレベルの 低 下 に 伴 いフロセッシングを 受 け N 末 端 側 が 核 内 へと 移 行 し 転 写 調 節 因 子 として 機 能 する SREBP のフロセッシングは 2 段 階 の 切 断 により 行 われている 1 段 階 自 の 切 断 がコレステロールによる 制 御 を 受 け 2 段 階 目 の 切 断 は l 段 階 目 の 切 断 が 引 きがねとなり それと 連 続 して 切 断 される 現 在 までにそれぞれの 切 断 を 担 うプロテアー ゼ S )と S2P )がクローニングされている ま た l 段 階 目 の 切 断 のコレステロールによる 制 御 を 担 う 因 子 として SCAP )が 同 定 されている しかしながらコレステロールがどの ようなメカニズムによって SREBP の 切 断 を 制 御 しているのかは 明 らかになっていない ハムスターに 血 中 コレステロール 低 下 薬 物 を 含 む 餌 を 与 え 肝 臓 における 各 種 mrna の 変 動 を 追 跡 した 実 験 によると HMG-CoA 合 成 酵 素 遺 伝 子 mrna は 約 40 倍 に LDL レセプターならびに SREBP-2 遺 伝 子 mrna は 約 3 倍 に 増 加 するが SREBP-l 遺 伝 子 mrna では 変 動 が 見 られないととが 報 告 されている( ) そこで 第 一 章 においては SREBP-2 遺 伝 子 の 転 写 が 細 胞 レベルでコレステロール 量 に 応 じて 調 節 されるかどうか について 調 べ さらに SREBP-2 子 の 5' 遺 伝 子 の 転 写 調 節 機 構 を 明 らかにするために 本 遺 伝 上 流 領 域 の 解 析 を 行 った 次 に スクアレン 合 成 酵 素 と HMG-CoA 合 成 酵 素 は 細 胞 内 コレステロールレベルが 低 下 することによって 転 写 が 冗 進 することが 報 告 され ている そこで 第 二 章 ではその 転 写 活 性 化 機 構 の 詳 細 を 明 らかにすることを 行 った 第 三 章 では SREBP SREBP-l によって 転 写 調 節 を 受 ける 新 規 遺 伝 子 を 探 索 した は 脂 肪 細 胞 分 化 過 程 において 転 写 レベルで 発 現 が 冗 進 することが 報 告 されて いる( ) そこで 第 四 章 ではタンパク 質 レベルの 変 動 を 検 討 し コレステロールを 蓄 積 した 脂 肪 細 胞 内 での SREBP のフロセッシングについて 考 察 した ~ Site-1

7 本 三 ふ 再 開 nt) SREBP-2 では 1955 nt) に 対 応 する 第 一 章 SREBP-2 遺 伝 子 の SREBP による 転 写 調 節 ハムスターに 血 中 コレステロール 低 下 薬 物 を 含 む 餌 を 与 えるととにより SREBP-2 遺 伝 子 の 転 写 レベルは 約 3 倍 に 上 昇 した( ) この 事 実 が 細 胞 内 コレステロール 量 の 減 少 により SREBP-2 遺 伝 子 の 転 写 が 允 進 した 結 果 なのかどうかを 明 らかにする 目 的 で ヒト 子 宮 けいがん 細 胞 由 来 の HeLa 細 胞 ( )を コレステロール 過 剰 または 欠 乏 し た 培 地 で 培 養 した 際 に SREBP-2 遺 伝 子 の 転 写 レベルが 変 動 するかどうかを 検 討 し さらにその 転 写 活 性 化 機 構 の 詳 細 を 解 析 した 第 一 節 SREBP-2 遺 伝 子 の 細 胞 内 コレステロール 量 に 応 じた 転 写 変 動 ) 実 験 材 料 および 実 験 方 法 HeLa 細 胞 からの 総 RNA の 回 収 細 胞 培 養 : ) 細 胞 ヒト 子 宮 けいがん 細 胞 由 来 の HeLa 細 胞 ) 培 地 Dìv 伍 M % 牛 胎 児 血 清 (GIBCO 3) 培 養 条 件 37 0 C CO 2 濃 度 5% で 培 養 した 細 胞 の 調 製 : 細 胞 を 100 dish に 80% コンフレントにまで 培 養 する その 後 PBS で l 回 洗 浄 し )を 含 む DMEM 培 地 に 10μg/ml コレステロール( 半 井 化 学 薬 品 )と l μg -ヒドロキシコレステロール (Sigma) を 加 えた 培 地 ( )または 50μM メバロ ン 酸 ラクトン (Sigma) と 50μM プラパスタチン( 三 共 )を 加 えた 培 地 (I)で 2 日 間 培 養 し た 25 - ヒドロキシコレステロールはコレステロール 自 動 酸 化 の 生 成 物 であり (23 ) オ キシステロールの 中 でも HMG-CoA 還 元 酵 素 抑 制 作 用 が 強 い プラパスタチンは HMG-CoA 還 元 酵 素 阻 害 剤 であり( ) 培 地 に 添 加 するととによりコレステロールの 生 合 成 反 応 を 初 期 の 段 階 で 阻 害 することになる (Fig. 1) これにより HMG-CoA 還 元 酵 素 以 降 の 産 物 からの 枝 分 かれにより 合 成 されるドリコール ヘム A ユビキノンなどの 非 ステロール 産 物 が 欠 乏 し 細 胞 は 致 死 的 になる この 状 況 を 回 避 するためにメバロン 酸 を 加 えた 総 RNA の 回 収 : グアニジンチオシアネート ー フェノールークロロホルム 抽 出 法 ( )により 調 製 した 0 RNase リポプローブの 作 製 : 東 京 大 学 先 端 研 教 授 児 玉 龍 彦 博 士 より 御 供 与 していただいた プローブ 作 製 用 の cdna を 用 いて Riboprobe )および 放 射 性 同 位 元 素 [α- (800Cνmmol) により 作 製 した( ) それぞれのプローブは 翻 訳 開 始 コドン ATG の A を+ 1 としたとき GAPDH では 963 nt) LDL レセプターでは Assay は RP )を 用 いて 行 った( ) またレーン 聞 の RNA 量 を 補 正 する 目 的 で GAPDH を 用 いた 得 られたシグナルは BAS )を 用 いて 定 量 化 した ) 実 験 結 果 HeLa 細 胞 をコレステロール 過 剰 または 欠 乏 培 地 で 培 養 した 際 の LDL レセプター 遺 伝 子 と SREBP-2 遺 伝 子 ならびに GAPDH 遺 伝 子 の 転 写 レベルを RNase Assay に より 解 析 した 結 果 を Fig.3A に 示 した また Fig. 3B には Fig.3A の 結 果 を BAS film) を 用 いて 定 量 化 し GAPDH のシグナルで 補 正 した 結 果 を 示 した その 結 果 細 胞 内 コレステロール 量 に 応 じて 転 写 が 制 御 されるポジティブコントロールとして 用 い た LDL レセプター 遺 伝 子 では コレステロール 欠 乏 により 転 写 レベルが 約 6 倍 に 上 昇 した また SREBP-2 遺 伝 子 では 約 2 倍 に 上 昇 した との 結 果 は 先 に 述 べたハムスター を 用 いた 動 物 実 験 で 得 られた 知 見 と 一 致 している - - > ω - ー ー - 園 田 < ε ω > e~th~r C,S, ~uppre~sing ~ ~ inhibitor, (1, A,. ~μg SREB!-2, ~A ~nd ~μg _a.s~~y: B,. intensity,.of,the (F 吋 i we 陀 norm a1 ized mean 士 SD s 担 ne 第 二 節 コレステロールに 対 する 応 答 に 必 須 なプロモーター 領 域 の 同 定 ) 実 験 材 料 および 実 験 方 法 -ヒト SREBP-2 遺 伝 子 のプロモーター 領 域 のクローニングと 塩 基 配 列 の 決 定

8 一 般 的 な 遺 伝 子 操 作 は M o l ecu lar Manual, Ed. に 従 った PCR ゲ ノ ムウォー キング( )によりクローニングを 行 なった ヒト 胃 粘 膜 の ゲノム DN A を PstI で 切 断 し 合 成 した Ps ti カセットを ligation したものをテンプレー トとして 用 いた PCR には LA )および CeneAm p )を 用 い た 5 0 μ l の 反 応 液 中 で 熱 変 性 (94 'c 0. 5 分 ) アニーリング( oc または 57 'c l 分 ) ポ リメラーゼ 反 応 (72 0 C 4 分 )を 30 サイクル 繰 り 返 した(, PCR はカセ ッ トの 5 ' 側 半 分 に 対 応 した C 1 プライマーと ヒト SREBP-2 cdna の 11 番 目 のコ ドン から 始 まるアンチセンスプライマーである S 1 プライマーを 用 い アニー リ ン グ 温 度 を 55 L で 行 った 次 に この 反 応 液 から 1μl を 取 り これをテ ン フレ ー トにして 2 PCR を 行 った 2 PCR はカセットの 3' 側 半 分 に 対 応 した C2 フ ラ イマ ーと ヒト SREBP - 2 cdna の 5 番 目 のコドンから 始 まるアンチセンスプライマー で ある S 2 プ ライマ ー を 用 い アニーリング 温 度 を 57 0 C で 行 った 反 応 液 を 0. 5 %の ア ガロ ー スゲルで 電 気 泳 動 し 増 幅 の 有 無 を 調 べた 2 PCR により 生 じた 約 1. 6 の PCR 産 物 を 刀 l e )を 用 いて 回 収 し TA ベクター( に DNA (Takara) を 用 いてライゲーションした( oc 1 時 間 ) そしてこの フ ラ グメ ン トの 塩 基 配 列 を Si1ver Promega) を 用 いて 決 定 した -ヒト SREBP - 2 遺 伝 子 の 転 写 開 始 点 の 決 定 )を 用 いた ヒト 肝 ガン 細 胞 由 来 の HepC2 細 胞 よりグア ニジン チオシアネート ー フェノールークロロホルム 抽 出 法 ( )により 総 RNA を 調 製 した SREBP - 2 遺 伝 子 の 200 から 205 番 目 のコドンに 対 応 するアンチセンスプ ラ イマ ー である S3 フライマーを 用 いて 1 cdna を 作 製 した さらに TdT を 用 い て 3 ' 端 にオリゴ dc テールを 付 加 し これをテンプレートにして S 1 プライマーとオリ ゴ dc テールをもっフライマーを 用 いて PCR を 行 った この 後 反 応 液 を1. 0 %のアガ ロースゲルで 電 気 泳 動 し 増 幅 の 有 無 を 調 べた その 結 果 最 も 長 く 増 幅 した 約 240 の PCR 産 物 を TA ベクター( )にサブクローニングし それらの 塩 基 配 列 を 決 定 した SREBP - 2 遺 伝 子 フロモーター 領 域 のコレステロール 応 答 に 必 須 な 領 域 の 同 定 細 胞 培 養 : ) 細 胞 ヒト 腎 臓 由 来 の HEK293 細 胞 ( 2) 培 地 と 培 養 条 件 第 一 章 第 一 節 に 準 じた 遺 伝 子 導 入 ルシフエラーゼアッセイ: 培 養 細 胞 への 遺 伝 子 導 入 は リン 酸 カルシウム 法 ( )により 行 った 1μgのレポーター プラスミドと 2 μ g のサケ 精 子 DNA または 0. 3μg の pme -SREBP2 )または pme - 18S と1. 7 μ gのサケ 精 子 DNA を 導 入 した トランスフェクション 後 の 培 地 は 第 一 章 第 一 節 で 用 いたコレステロール 過 剰 条 件 の( ) 培 地 またはコレステロールが 欠 乏 した(1) 培 地 を 使 用 し 2 日 間 培 養 した pme - SREBP2 )または pme-18s をレポー ター プ ラスミドと 同 時 に 導 入 したものは 7 FCS を 含 む D 恥 1EM 培 地 を 使 用 し 2 日 間 培 養 した 定 した ルシフエラーゼの 活 性 はピッカジーン( 東 洋 インキ 製 造 株 式 会 社 )を 用 いて 測 またトランスフェクションの 際 に 細 胞 数 の 違 いにより 生 じるルシフエラーゼ 活 性 の 差 を タンパ ク 量 で 補 正 した タ ンパク 定 量 は B CA ) に よ り 測 定 した プラス ミド 構 築 : pcv - B の Bgl III 部 位 にヒト SREBP - 2 遺 伝 子 の 翻 訳 開 始 コドンである+ から を 挿 入 した フラ ス ミ ド p Lu c p624 - Lu c p140 - Lu c p91 - Lu c を PCR 法 を 用 いて 構 築 した さ ら に PCR 法 を 用 い て p140 -L u c の SRE - 1 に 変 異 を 加 えた プ ラスミド psreko - Lu c と CCAATBox の 逆 配 列 に 変 異 を 加 えた プ ラスミド pnf -YKO - Luc を 構 築 した 30) より 切 り 出 した LDL レセプタ ー 遺 伝 子 上 流 配 列 [ ( 翻 訳 開 始 コドンのアデニン 塩 基 が+ ] を pcv - B の Hind III 部 位 に 挿 入 したフラ スミド pldlr を 構 築 した ) 実 験 結 果 PstI 切 断 したゲノムライブラリーを 用 いて PCR ゲノムウォーキングを 行 った 結 果 PCR では 特 異 的 な 増 幅 産 物 は 見 られなかったが 2 PCR によって 約 1. 6 Kb の DNA 断 片 が 増 幅 した この 約 1. 6 Kb の DNA 断 片 の 塩 基 配 列 を 決 定 した 結 果 5 ' 側 に はカセットプライマー C2 3 ' 側 には S2 プライマーの 配 列 が 見 られた また S2 プラ イマーに 続 く cdna の 5' 末 端 までの 配 列 も 確 認 された (S 2 プライマーの 5 ' 末 端 から cdna の 5' 末 端 の 聞 には 114 塩 基 が 存 在 する) この 結 果 からここで 増 幅 した 約 1. 6 Kb の DNA 断 片 は ヒト SREBP-2 遺 伝 子 の 5' 上 流 領 域 であると 結 論 した 翻 訳 開 始 コ ドンから 上 流 の 塩 基 配 列 を Fig. 4A に 示 した 主 な 転 写 因 子 のコンセンサス 配 列 を 二 重 下 線 で 示 した 次 に 5 ' 孔 久 CE 法 を 用 いて 転 写 開 始 点 の 決 定 を 行 った 得 られた 20 クローンの 始 ま る 位 置 を Fig.4B に 示 した で 示 した 位 置 がそれぞれのクロ ー ンの 始 まる 位 置 である この 解 析 法 では cdna の 3' 末 端 にオリゴ dc テールをつけるため C/C, C/T, C/C の 3 ヶ 所 は 正 確 に 決 定 するととができない これらのクロ ー ンのうちで 最 も 5' 上 流 の 翻 訳 開 始 コドンから 上 流 172 bp のシトシン 塩 基 ( C) を+ 1 とし 転 写 開 始 点 とした またこれらのクローンの 始 まる 位 置 がまたがる+ 1 から+ 32 の 領 域 を 転 写 開 始 領 域 とし て 下 線 で 示 した (Fig. 4A) Fig.5A に 示 したように SRE-1 と CCAAT Box の 逆 配 列 を 含 むレポータージーンフラ スミドである p1400-luc p624-luc p140 -Luc ではコレステロールが 欠 乏 するととによ り 約 2 倍 の 転 写 活 性 化 が 見 られた しかし SRE - 1 と CCAATBox を 欠 如 した p91 - Luc では 細 胞 内 コレステロールの 欠 乏 による 転 写 活 性 化 は 見 られなくな っ た さらに Fig.5B に 示 したように SRE-1 と CCAATBox を 含 む p Luc p624 - Luc p140 - Luc で は SREBP-2 を 発 現 する 条 件 下 ( )において 数 倍 から 約 10 倍 の 転 写 活 性 化 が 起 こった しかし SRE-1 と CCAAT Box を 欠 如 した p91-luc では SREBP - 2 を 発 現 させることによ る 転 写 活 性 化 は 起 こらなかった また ポジティブコントロールで 用 いた LDL ター 遺 伝 子 のプロモーターでは 約 10 倍 の 転 写 活 性 化 が 見 られた レセフ

9 CTGGCGTGGTTTTCAGGTCCTCAGTGGTTCCGAGGTGCCAGAGATTGAGGACCACTGGAG 601 AATCTGCAACCTTGTCAAGCCTCCGTGCCCGCCTTTGTAAGGAGGCTGGGAGAAGCGGGA 毛 α3-3 1 CTTGGATGACCCGGACTCCCGTCCCGAGCGCTGGGGTCCAGGTTTGACTCCGCTGGCTTT 421 CTCAGGCGGGCAGGGCGGGGGTAGGCAGCTGGGAAGATGACGTAATGTGCTCCCAGCCAG 361 CCAGTGGACGGACTTGCGTGTGGCGCAGATCCAACGGAGAAGGCAGCGGCTCCTTTAAAC 241 SRE 1 主 謡 ~GCACCGCTTCGCTCGCCC~ 喝 -- 1 ドーー 陣 1400 司 624 h z z o d 可 ω 偲 ω 一 ω コ ω z e - z ~ 易 -0 酬 司 忌 -0 H 忌 -Q 140 ~ EEZZ 司 +172 p14 件 Luc 回 ïi 一 一 - 一 一 目 一 一 一 寸 1 伺 1 田 200 3() よー" 司 ~ ~ p91-ιuc ま 佃 1 個 1 曲 2 同 25G ザ~- ~. 2 嗣 ま 曲 A, sites 訂 e regul 剖 ory 1), E-box, SRE-1] 訂 e B, RACE 加 alysis 1". this 如 alysis Therefore, sites, G/C, G 汀 and SREBP 2 A, elements 訂 e (S, me 釦 土 SD B, ~~transfected 1,000 2,500 units/μg

10 次 に SRE-l に 変 異 を 導 入 した psreko-luc と CCAAT Box に 変 異 を 導 入 した pcatko-luc を 用 いてレポーターアッセイを 行 った( にもコレステロールおよび SREBP-2 ) その 結 果 いずれの 場 合 による 応 答 が 消 失 した これらの 結 果 より SREBP - 2 遺 伝 子 の 細 胞 内 コレステロールレベルに 応 じた 転 写 調 節 には SREBP が 関 与 し ており さらにフロモーター 領 域 に 存 在 する SRE-l ととが 明 らかになった と CCAATBox の 双 方 が 必 要 である 一 P p140 Luc 恒 2c 国 > トー 1.51 L 圃 圃 I 1, 0.5 ' お 国 ~ SRE 1 Left, psreko-luc, (ATCACCCCAC pcatko-luc, (ATTGGC Right, 出 e of 出 ree 1,000 4,000 unitslμg 第 三 節 SREBP-2 遺 伝 子 フロモーター 領 域 における SRE-l および CCAATBox に 結 合 するタンパク 質 の 同 定 ) 実 験 材 料 および 実 験 方 法 SRE - l に 結 合 するタンパク 質 の 同 定 大 腸 菌 における SREBP - 2 の 発 現 と 精 製 : SREBP - 2 の 発 現 は pet )を 用 いた S REBP -2 タンパク 質 の 1 アミノ 酸 をコードする DNA 断 片 が pbluescript )の Not 1 部 位 に 挿 入 され たプラスミド pbsk - SEP - 2 )を 使 用 した こ のプラスミドの Not 1 断 片 を )の Not SalI 部 位 に 組 み 込 んだ このフラスミドを 導 入 した 大 腸 菌 3) 株 をカナマイシン( 25μg ml) を 含 む 50 ml の LB 培 地 に 植 菌 し 37 0 C で 一 夜 振 とう 培 養 した この 培 養 液 をカナマイシン( 25μg ml) を 含 む 450 ml の LB 培 地 に 加 え 街 が 0.6 程 度 になるまで 約 1 時 間 37 'cで 振 とう 培 養 した 最 終 濃 度 が rnmになるように IPTG を 加 え さらに 37 'cで 5 時 間 培 養 して 融 合 タンパク 質 を 誘 導 した 4, 分 間 遠 心 をおとない 集 菌 したのち 15 ml のバッファ- hydrochloride 0.1 MNaHl Tris ph を NaOH で 8. 0 に 調 節 )で 懸 濁 し (5 / 菌 体 の 乾 燥 重 量 ) 室 温 で 1 時 間 回 転 撹 持 した 10, 分 間 遠 心 をお こない その 上 清 を 回 収 した 8ml の 50 resin と 混 合 し 室 温 で 45 分 間 回 転 撹 持 した 10 倍 容 バッファー A で 5 回 5 倍 容 バッファ- urea 0. 1 NaHl Tris ph を NaOH で 8.0 に 調 節 )で 2 回 5 倍 容 バッファー C urea 0.1 MNaHl Tris ph を HCl で 6.3 に 調 節 )で 3 回 洗 浄 した 最 終 的 に バッファ- urea 0.1 MNaHl Tris 250 ph を HCl で 6.3 に 調 節 )によって 目 的 タンパク 質 を 溶 出 した プローブの 作 製 : DIG ゲルシフトキット( )を 用 いた フローブとしては SREBP - 2 遺 伝 子 のプロモーターの -138 から- 115 の 領 域 ( SRE - l を 含 む)の 2 本 鎖 DNA を 合 成 し た( strand のみを 以 下 に 示 した 下 線 は SRE - l 配 列 ) 0 DIG ゲルシフトキットのプロ トコールに 従 い 3' 末 端 を DIG-l1-ddUTP で 標 識 した これをプローブとして 用 い SRE24 と 名 付 けた 5 〆 -ATGACGCGCCATCACCCCACGCAC-3 ゲルシフト 反 応 : 精 製 した His tag 融 合 タンパク 質 10 ng とフローブ 30 fmol を 20 ) 1 rnm EDTA 10 )2S04 1 DTT を 含 み 液 量 が 20μl になるように 氷 上 で 混 合 し 室 温 で 20 分 間 放 置 した その 後 スー パーシフトを 行 うものは 抗 血 清 ( SREBP-2 の N 末 を 認 識 する 第 四 章 第 二 節 参 照 )を 0.1μl 加 え 氷 上 で 30 分 開 放 置 した その 後 サンプルバッファー[ TBEバッファー Tris 0. 6 EDTA 2Na 11 rnmほう 酸 ) :グ リセロール =6 : 4(v/v)] を 5 μl 加 え 6% (w/v) アクリルアミドゲル 上 80V で 約 45 分 泳 動 した そ の 後 の 化 学 発 光 の 検 出 は DIG ゲルシフトキットのフロトコールに 従 った

11 Box に 結 合 するタンパク 質 の 同 定 核 抽 出 液 の 調 製 : HepG2 細 胞 を 枚 に 第 一 章 第 一 節 に 準 じた 条 件 でコンフレントになる まで 培 養 した PBS で 洗 浄 し ラバーポリスマンを 用 いて 1 PBS 中 に 細 胞 を 回 収 し た 中 m4 3 分 間 遠 心 [ 卓 上 遠 心 機 MC Tomy)] した 後 lnù の 試 薬 A Hepes - rく OH ) 1 mm EDTA 1.5 MgCl z 10 mm KCl) で 懸 濁 し 25 G 針 で 10"-' 15 回 シェアリングする g で 10 分 間 遠 心 し 沈 殿 を 300μlの 試 薬 B( ) 1 mm EDTA 1 mm EGTA 1.5 MgC mm NaCl )グリセロール)で 再 懸 濁 後 4 0 C で 30 分 間 回 転 撹 持 した 1, 500 rpm で 10 分 間 遠 心 後 の 上 清 を 核 抽 出 液 とした - 一 + -ー 惨 事 SREBP 2 SRE 1 SREBP 2 coπesponding promoほr, プローブ. の 作 製 : p140 - Luc をテンプレートにして PCR 法 をおこない CCAAT Box を 含 む 約 300 bp の DNA 断 片 を 増 幅 した これを BssH II 処 理 し 約 80 bp の DNA 断 片 ( ) を 切 り 出 した DIG ゲルシフトキットのプロトコールに 従 い 3' 末 端 を DIG-l1 - ddutp で 標 識 したものをプローブとして 用 い SRE80 と 名 付 けた また 競 合 DNA は pl40 - Luc と pnf - YIく O-Luc をテンプレートにして PCR 法 をおこない 増 幅 した 約 300 bp の DNA フ ラグメン 卜 を 用 いた 前 者 を wr 後 者 を NFYKO と 名 付 けた -ー 惨 ゲルシフト 反 応 : 核 抽 出 液 6μg とプローブ 30 fmol さらにすべての 群 に 競 合 DNA(NFYKO) を 30 加 えた 競 合 DNA (NFYKO) を 加 えることによって CAATTBox に 結 合 する 因 子 だけ を 検 出 することができる コンペティターとして 未 標 識 の DNA 断 片 を 加 える 群 には 競 合 DNA(WT) を 30 pmol 加 えた スーパーシフトをおこなうものは 抗 NF-YB 抗 体 (Mantovani 博 士 より 供 与 )を 500 ng 加 えた ゲルシフト 反 応 は 第 二 章 第 三 節 に 準 じた ) 実 験 結 果 ゲルシフトアッセイにおいて (Fig. ) SRE24 に 結 合 する 因 子 によるシフトしたバン ドが 確 認 された さらにそのバンドは SREBP-2 の N 末 を 認 識 する 抗 血 清 を 0.1μl 加 えるととによってスーパーシフトしたが 免 疫 前 の 血 清 を 加 えてもスーパーシフトしな かった が 明 らかになった これらの 結 果 より プローブの 領 域 に SREBP が 結 合 する 配 列 が 存 在 すること ゲルシフトアッセイにおいて (Fig. 8) CCAATBox の 逆 配 列 に 結 合 する 因 子 によるシ フトしたバンドが 確 認 された このバンドは 競 合 DNA である 1000 倍 過 剰 の 日 汀 によ り 消 失 した 一 方 シフトしたバンドは 抗 LDL レセプター 抗 体 ではスーパーシフト しなかったが NF - Y の B サブユニットに 対 する 抗 体 である 抗 NF-YB 抗 体 によってスー パーシフトした これによりこの CCAAT Box には NF-Yが 結 合 するととが 示 された 55 B F. 除 も NF Y SREBP 2 11 ddutp 6μg 2, 1, 000 fold 0.5μg and 出 e receptor, 釦 d (B) 加 d indicated. 百 le

12 第 四 節 考 察 および 小 括 ) 考 察 ヒト 培 養 細 胞 においても 細 胞 内 コレステロール 量 が 欠 乏 するととにより SREBP-2 遺 伝 子 の 転 写 が 活 性 化 することを 明 らかにした さらにフロモーター 領 域 の 解 析 を 行 った ところ その 活 性 化 には SREBP および NF-Y の 協 調 的 な 作 用 が 必 須 であることを 明 ら かにした またデータには 示 していないが SREBP-1 遺 伝 子 は 細 胞 内 コレステロール 量 に 応 じた 転 写 変 動 は 見 られなかった SREBP - 1 と - 2 は 共 に 細 胞 内 コレステロール 量 に 応 じたフロセッシング 調 節 を 受 けて 成 熟 体 になり 核 内 に 移 行 して 転 写 調 節 因 子 としての 機 能 を 発 揮 する しかしそれぞれ の 遺 伝 子 の 転 写 レベルは 細 胞 内 コレステロール 量 の 欠 乏 により SREBP-2 遺 伝 子 では 約 2 倍 に 上 昇 したが SREBP - 1 遺 伝 子 では 変 動 しなかった この 結 果 より 細 胞 内 コレステ ロール 量 が 欠 乏 した 際 には SREBP のプロセッシングが 促 進 されるだけでなく SREBP - 2 遺 伝 子 の 転 写 が 上 昇 することにより 前 駆 体 SREBP-2 の 発 現 が 上 昇 すること が 明 らかになった ると 考 えられる この 2 つの 相 乗 的 な 作 用 により 核 内 の 成 熟 体 SREBP の 量 が 増 加 す SREBP - l 遺 伝 子 の mrna はラット 脂 肪 細 胞 において 高 発 現 していることが 報 告 され ている( 20) また SREBP を 介 して 転 写 活 性 化 を 受 ける 遺 伝 子 として 脂 肪 酸 代 謝 関 連 遺 伝 子 である FAS, )と ACC )が 報 告 されている さらに SREBP-1 と SREBP - 2 で 転 写 活 性 化 能 を 比 較 したところ SREBP - 1 が 脂 肪 酸 代 謝 関 連 遺 伝 子 SREBP - 2 がコレステロール 代 謝 関 連 遺 伝 子 の 転 写 を 効 率 良 く 活 性 化 することも 報 告 され ている (31, 32) 以 上 のことを 考 え 合 わせると SREBP-1 と -2 は 共 にコレステロール 代 謝 関 連 遺 伝 子 の 転 写 を 促 進 し 得 るが SREBP - 1 は 特 に 脂 肪 酸 代 謝 関 連 遺 伝 子 の 転 写 の 制 御 を SREBP - 2 は 特 にコレステロール 代 謝 関 連 遺 伝 子 の 転 写 の 制 御 を 担 っていると 推 察 することができる ) 小 括 HeLa 細 胞 においてコレステロールを 枯 渇 させることにより SREBP-2 の 発 現 が 転 写 レベルで 上 昇 することを 明 らかにした SREBP - 2 遺 伝 子 5 上 流 領 域 約 1.6 Kb をクローニングし 塩 基 配 列 を 決 定 した レポーターアッセイの 結 果 プロモーター 領 域 に 存 在 する SRE-1 がコレステロールに 応 じた 転 写 変 動 には 必 須 であることを 明 らかにした と CCMTBox ゲルシフトにより SRE - 1 配 列 に SREBP が CCMTBox には NF-Y が 結 合 する ことを 明 らかにした 第 二 章 スクアレン 合 成 酵 素 および HMG - CoA 合 成 酵 素 遺 伝 子 の SREBP による 転 写 調 節 SREBP - 2 遺 伝 子 の 転 写 は SREBP と NF - Y の 協 調 的 な 作 用 によって 活 性 化 されるとと を 明 らかにした スクアレン 合 成 酵 素 および HMG - CoA 合 成 酵 素 遺 伝 子 はコレステロー ル 量 の 欠 乏 により 転 写 レベルで 活 性 化 されるととが 報 告 されているが (33, 34) プロモー ター 領 域 の 詳 細 な 解 析 は 十 分 に 進 んでいない この 2 つの 遺 伝 子 のプロモ ー ター 領 域 に は SRE 様 配 列 の 近 傍 に CCAATBox が 存 在 し SREBP と NF - Y が 協 調 的 に 転 写 を 活 性 化 している 可 能 性 が 考 えられる この 点 に 注 目 し スクアレン 合 成 酵 素 および HMG-CoA 合 成 酵 素 遺 伝 子 のコレステロール 量 に 応 じた 転 写 変 動 について 解 析 した さらに SREBP 明 らかにした 第 一 節 と NF -Y の 結 合 領 域 の 間 隔 が その 協 調 的 な 転 写 活 性 化 に 影 響 を 及 ぼすことを コレステロールに 対 する 応 答 に 必 須 なフロモーター 領 域 の 同 定 ) 実 験 材 料 および 実 験 方 法 -スクアレン 合 成 酵 素 および HMG-CoA 合 成 酵 素 遺 伝 子 のフロモーター 領 域 のクロー ニング スクアレン 合 成 酵 素 遺 伝 子 のプロモーター 領 域 は すでに 報 告 されている 配 列 ( )を もとにプライマーを 作 成 し ヒト 胃 粘 膜 のゲノム DNA をテンフレートとして PCR 法 を 用 いてクローニングした HMG-CoA 合 成 酵 素 遺 伝 子 のフロモーター 領 域 はハムスター の 配 列 ( )をもとにプライマーを 作 成 し ヒト 胃 粘 膜 のゲノム DNA して PCR 法 を 用 いてホモロジークローニングを 行 った -コレステロールに 対 する 応 答 に 必 須 なプロモーター 領 域 の 同 定 をテンプレートと 細 胞 培 養 遺 伝 子 導 入 ルシフエラーゼアッセイ: 方 法 は 第 一 章 第 二 節 に 準 じた 0.2μg のレポータープラスミドと 2.8μg のサケ 精 子 DNA または 0.03μg の pme-srebp2 )または pme-18s DNA を 導 入 した トランスフェクション 後 の 培 地 は 第 一 章 と 2.77μg のサケ 精 子 第 二 節 に 準 じた プラスミド 構 築 : pgv-b2 の Bgl III 部 位 にスクアレン 合 成 酵 素 遺 伝 子 のフロモーター 領 域 の+ 67 から を 挿 入 したプラスミド pss200 pss90 を PCR 法 を 用 いて 構 築 した さらに PCR 法 を 用 いて pss200 の SRE-1 2 または CBl に 変 異 を 加 えたプラスミド pss-sre1ko pss-sre2ko pss-sre.2ko pss-cb1ko pss - CB1. SRE2KO を 構 築 した 同 様 に pgv-b2 の BgJl I III 部 位 に HMG-CoA 合 成 酵 素 遺 伝 子 のプロモーター 領 域 の -87 から- 497 を 挿 入 したプラスミド phmg S -WT を PCR 法 を 用 いて 構 築 した さらに PCR 法 を 用 いて phmgs-wt の SRE-l 2 CB1 または Sp1 に 変 異 を 加 えたプラ スミド phmg S-CBIKO phmg S-SRE1KO phmg S - SRE2KO phmg KO を 構 築 した ) 実 験 結 果 ヒトスクアレン 合 成 酵 素 遺 伝 子 のプロモーター 領 域 の 塩 基 配 列 を Fig.9 に 示 した 報

13 告 されていた 配 列 と 比 較 すると 110 番 目 の 1 塩 基 がが 一 致 しなかったが (C T) SREBP による 転 写 調 節 には 影 響 がないと 思 われる gaa ヒヒ TCTAGAGTGTTATCACGCCAGTCTCCTTCCGCGACTG 主 旦 望 ~CGGGGTC TTCCTAGT 笠 型 連.GCGGCCCTGG 包 さ 笠 CAGCGCCCGTCAGCCCACCCCAC -101 し 'pss90 ( ) (35), (5'-cCCACCCCAC-3', ヒト HMG -CoA 合 成 酵 素 遺 伝 子 のプロモーター 領 域 をクローニングし すでに 報 告 さ れているハムスター HMG - CoA 合 成 酵 素 遺 伝 子 のプロモーター 領 域 (34 )と 比 較 した 結 果 を Fig. lo に 示 した CBl およびグ 側 の Spl は 完 全 に 保 存 されており SRE1 は 8/10 SRE2 は 9/10 が 保 存 されていた 3' 側 の Spl はハムスターでは 見 られず ヒトにおい てのみ 見 られた レポーターアッセイの 結 果 スクアレン 合 成 酵 素 では Fig.1 1 に 示 したように 3 ケ 所 の SRE 様 配 列 と 2 ヶ 所 の CCAAT Box すべて 含 む pss200 では コレステロールを 欠 乏 さ せることによ って 約 6 倍 の 活 性 化 が 見 られたが 5 つのエレメントすべてを 欠 失 した pss90 ではそのような 活 性 化 は 見 られなくなった また SREl に 変 異 を 導 入 した pss200-sreiko では 約 2 倍 SRE2 に 変 異 を 導 入 した pss200-sre2ko では 約 3 倍 の 活 性 化 が 見 られた 一 方 C Bl または SREl と SRE2 の 両 方 に 変 異 を 導 入 した 場 合 は 活 性 化 が 見 られなくなった このことから 細 胞 内 コレステロール 量 に 応 じた 転 写 調 節 には SREl SRE2 と CBl が 必 要 であり SREl と CBl さらに SRE2 と CBl が 協 調 的 に 作 用 することにより pss200 で 見 られる 約 6 倍 という 高 いレベルの 活 性 化 が 起 こると 考 え ることができる CACτ'1'AGTCC--CAAτ 可 GTCGGAGAACCTCTCACτ'CCGCTCC 台 女 *** 合 ***** ****************** 脊 ** -511:TGGTCCCGATCTCCTCTCAC-T-GACCτ 可 'CAAτ'1'GGTCAGAGAACCTCTCACTCCGCTCC -453:CGττ'GGC τ'ctcgccgtctcτ'cgccgtc-ccgc 吃 ttaa -343:C 'Iて1ごCCGCdc 'I'1'CCAGCCACGAGGGAAAATCCTAGCGAGTCATCGCCTCTAG'I 可 'TCC T'I'1' * 安 奏 会 吾 長 女 ******* 合 会 会 合 合 ****** * 食 合 ** 女 合 *** 合 * 合 合 会 * 安 * 合 -3 40: C 一 CCCCACCC 'I'1'CCAGCCGCGAGGGAAAACCCTAGCGAGTCACCGCCTCTCC T'I'1'CC 'I'1'C -283:TGA'I'1'GGTAG-AAGCCGG-ACTGGGGGGCGGGCGCτ'GCCGGGCAACτ'CT-ACCGGC-C-G *** 安 安 ** * 安 * 食 合 安 安 食 会 責 * 女 ** ** 台 女 合 合 ** ** 女 -281:CCAT'I'GGCAGAAAG-CGGTA-τ'GAGGGGCGGGAGCτ~ACGAGCGAGTCTGA---GCTCτロー :CGATτ'GGCTGτ'GGGAGCCACCGτ'CCCGCCTCCCAG-CGACτ'CTCGGCGGτ'GC CGGAGTCG 会 合 *** 女 *** *** 女 ** ** 台 育 ** ********* 食 ****** - 226:GGA~GGCAGCCGCCATCCCGCC-CCCTGCCGCCTCCCGGCGGτ'GCGGGAGTCG -169:GG~Tτ'GGCGGαrATA.AAGCτロGτロー GCGAAG -GGGAGGCGCCGCGG- ー 一 一 -A~TC **~***** 女 ~*** 甲 骨 女 -167:GGTGGGTCGGτ'GGαrATA.AAGCτ'GCτ~AG-G 一 一 GCGGGA-G-G-CAC--AG'I'GCA~τ ーユ 16:C T'I'1'CG'I'GGCTCACTCCCT'I'1'CCTCTCGτ'GCCGCτ'CGGTCACGC' 了 r-g * 安 *** * 女 **** C-TCCGTGGA'τせ~ 一 CCTτマCτ 寸 TGCCCCGGGTCCGGTCGTGτTTGG Co~ s~~tha~e q~) d~~~t~~id~~ti~;} ~osition a~sig!l ed methi~ci~~ 5 に!lt:l trans1ated dots( L dash,ed_box Po tenti 剖 regul 瓜 ory elements 紅 e a 町 o '_V~ in?-i ca~e_~e,primers repo 口 ~r &en~ ~o~structs

14 HMG-CoA 合 成 酵 素 遺 伝 子 では Fig.12 に 示 したように CB1 SRE1 SRE2 Sp1 をす べて 含 む phmgs-wt では コレステロールを 欠 乏 させるととにより 約 3. 5 倍 の 転 写 活 性 化 がみられたが CB1 または SRE1 のいずれか 1 つを 変 異 させた phmg 1KO S-SRE1KO では 活 性 化 は 消 失 した また SRE2 または Spl のいずれかを 変 異 させ ても CB1 SREl が 保 存 される 限 り 約 2 倍 の 転 写 活 性 化 が 見 られた とのことから 細 胞 内 コレステロール 量 に 応 じた 転 写 調 節 には CB1 と SRE1 が 必 須 であり さらにこれら 2 つの 配 列 による 転 写 活 性 化 を 補 助 する 形 で SRE2 と Sp1 が 作 用 していると 考 えられた bymamw.a, HEK293cells ~ith-; ~~p~rt~~r ind~c.ing ~~ndi:ions fold 白 activation supp 陀 SSing Th~ l~~iferase extrac_~s. th~ me~ 土 ind 今 endent B, 1! 削 除 ted 批 cons 廿 ucts _S~~P-2~.or arc 出 c g~;~~ ~s~d su_pp!es~in~ ê?n?itio~s ~d ~jthout 7,000 24,000 rel 幼 児 light units/ 同 protein. ~onst~cts. on 出 e elemen~ ãr~ ~~~icat~? b~oxes: Th~ an 訂 row. A, mean 士 S.D. B, _~i~h_~~ i!1 dica~ed ~ene ~on~truc~s e~pression SRE~P-2 th~ _v~c~or wi~hout ln~~rt, ~.inde J?C nd~nt transfec~on ~~~pre~si.ng COMitionsmd(B)without 出 e ~were 2,000 4,000 units/μg

15 第 二 節 スクアレン 合 成 酵 素 および HMG-CoA 合 成 酵 素 遺 伝 子 フo ロモーター 領 域 の Box に 結 合 するタンパク 質 の 同 定 ) 実 験 材 料 および 実 験 方 法 CCAATBox に 結 合 するタンパク 質 の 同 定 核 抽 出 液 の 調 製 およびプローブの 作 製 : 核 抽 出 液 の 調 製 は 第 一 章 第 一 章 第 三 節 で 作 製 した SRE24 を 用 いた ゲルシフト 反 応 : 方 法 は 第 一 章 第 三 節 に 準 じた 第 三 節 に 準 じ 細 胞 は HEK293 細 胞 を 用 いた プローブは コンペティターとしてそれぞれの 遺 伝 子 の CB1 を 含 む 24 塩 基 の 2 本 鎖 DNA および CB1 に 変 異 を 導 入 ( GAATI ATIGG) した 24 塩 基 の 2 本 鎖 DNA を 合 成 し (upper s 甘 and のみを 以 下 に 示 した) ー レーンにつき 30 pmol 加 えた 一 CCGCGACTG 主 主 主 GGCCGGGGTCTT-3' 一 CCGCGACTG_G 主 盟 主 CCGGGGTCTT-3 -AGCTCCGTC 己 主 主 主 主 CAACTGGGCT-3' Competitor 一 一 京 高 t 広 石 ;t Anti-NF-YB Supershifted ー+ ー+ 一 一 一 一 Bound ー+ 4. 白 区... WT: ) 実 験 結 果 それぞれの 遺 伝 子 のプロモーター 領 域 に 存 在 する CB1 に NF-Y が 結 合 するかどうかを コンペティションアッセイによって 調 べた フローブは SRE24 を 用 いた Fig.13 に 示 し たように SRE24 に 結 合 する 因 子 によるシフ 卜 したバンド(l ane )が 抗 NF-YB 抗 体 によっ てスーパーシフトした( ) 次 に この NF-Y によりシフトしたバンドにスクアレ ン 合 成 酵 素 遺 伝 子 および HMG-CoA 合 成 酵 素 遺 伝 子 のプロモーター 領 域 の CB1 を 含 む 1000 倍 過 剰 の DNA 断 片 ( WT) を 加 えることでバンドは 消 失 したが CB1 に 変 異 を 導 入 した DNA 断 片 ( Mut) を 加 えても 変 化 しなかった( ) これらのことから スクア レン 合 成 酵 素 遺 伝 子 および HMG-CoA 合 成 酵 素 遺 伝 子 のフロモーター 領 域 の CB1 NF - Y が 結 合 することが 示 唆 される に co 汀 esponding Digo x! gen~.1.1-dd!1!~ 6μg th~_ a~di?on ~f μg a~tibody YB, r~action ~~e ~or 3~ (l~e ~L!n lan~, ~-.6, 1,OOO-fold excess 紅 nount (WT, tぅφe Mut, mutant 仕 agment 第 三 節 SRE-l と CCAATBox の 間 隔 が SREBP による 転 写 活 性 化 におよぼす 影 響 ) 実 験 材 料 および 実 験 方 法 細 胞 培 養 遺 伝 子 導 入 ルシフエラーゼアッセイ: 方 法 は 第 一 章 第 二 節 に 準 じた 0.2μg のレポーターフラスミドと 0.3μg の )または pme-18s と 2.5μg のサケ 精 子 DNA を 導 入 した トランス フェクション 後 の 培 地 は 7 FCS を 含 む D 恥 伍 M 培 地 を 使 用 した プラスミド 構 築 : ヒト SREBP-2 遺 伝 子 のプロモーター 領 域 の+ 172 から の 領 域 を pgv-b2 の Bgl III 部 位 に 挿 入 したプラスミドを 構 築 した さらに PCR 法 を 用 いて SRE-1 と Box の 距 離 を 8 から 32 まで 2 塩 基 ずつ 変 化 させたプラスミドを 構 築 した また その 距 離 が 15 塩 基 のものも 作 成 した ここで 作 成 したプラスミドの SRE-1 と CCAAT Box の 問 の 塩 基 配 列 を 次 に 示 した

16 8 塩 基 )GAT- 一 一 一 一 一 一 一 ー 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 CCTCC 10 塩 基 : )GATA- 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 AC 一 一 一 一 CTCC 12 塩 基 : )GATA- 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 - ユ 4 塩 基 : )GATA- 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 - 15 塩 基 : )GATA- 一 一 一 一 一 ーー 一 一 一 一 TCGTTAAC- 一 一 一 一 TCC 16 塩 基 : )GATA- 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 -TCGTTAAC- 一 一 一 CTCC 18 塩 基 : )GATA- 一 一 一 一 一 一 一 ー 一 一 一 TCGTTAAC 20 塩 基 : )GATA- 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 TCGTTAACAGGCCTCC 22 塩 基 : )GATA- 一 一 一 一 -AAGATATCGTTAAC 一 一 一 一 CTCC 24 塩 基 : )GATA- 一 一 一 一 -AAGATATCGTTAAC- 26 塩 基 : )GATA 一 一 一 一 一 一 AAGATATCGTTAACAGGCCTCC 28 塩 基 : )GATACTTTTAAAGATATCGTTAAC- 一 一 一 CTCC 30 塩 基 : 32 塩 基 : ) 実 験 結 果 本 実 験 においては SRE - 1 と CCAATBox を l ヶ 所 ずつ 持 つ SREBP - 2 遺 伝 子 のプロモー タ ー 領 域 を 用 いた レポーターアッセイの 結 果 を Fig.14 に 示 した 縦 軸 には SREBP-2 を 同 時 に 発 現 したときに 転 写 活 性 が 何 倍 に 上 昇 したかを 示 した その 結 果 15 から 20 塩 基 のところに 1 つの 大 きなピークが 見 られた E O Z 6 2 H ω 官 一 比 q 叫 司 4 rーー 寸 SREBP 2 SREBP 2. at 出 e ng), fe 凶 calf in 出 e repo 此 er in 出 e 1,400 3,600 unitslμg 第 四 節 ) 考 察 考 察 および 小 括 SREBP 之 スクアレン 合 成 酵 素 および HMG-CoA 合 成 酵 素 遺 伝 子 はコレステロールの 欠 乏 により 転 写 レベルで 発 現 が 冗 進 する これらの 活 性 化 には SREBP と NF-Y が 協 調 的 に 作 用 していることを 明 らかにした この 他 にもコレステロール 生 合 成 に 関 る diphosphate 合 成 酵 素 (FPPS )が SREBP と NF-Y によって 活 性 化 されることが 報 告 されている (36 ) スクアレン 合 成 酵 素 遺 伝 子 のプロモーター 領 域 においては NF -Y の 両 側 に SREBP が 位 置 しており レポーターアッセイの 結 果 から 考 えると NF-Y は 両 側 の SREBP と 協 調 的 に 作 用 していると 推 察 される N F -Y と SREBP がどのように 相 互 作 用 しているのかは 非 常 に 興 味 深 い コレステロールの 欠 乏 により 転 写 レベルで 発 現 が 冗 進 する 遺 伝 子 のなかでも LDL レ セプタ 一 ACC FAS 遺 伝 子 は NF-Y ではなく Sp1 が SREBP と 協 調 的 に 作 用 して 転 写 を 活 性 化 することが 報 告 されている(,,, 12) いずれの 場 合 でも SREBP は 単 独 では 転 写 を 活 性 化 することはできない しかしながら NF -Y Sp1 のいずれにしても コレステロールによる 転 写 活 性 化 能 の 変 化 などは 確 認 されておらず またいずれもユビ キタスな 転 写 因 子 であるととから 細 胞 内 コレステロールレベルの 変 動 に 伴 った 転 写 調 節 は SREBP のプロセッシングの 段 階 で 制 御 されていると 考 えられる また CBP protein) が SREBP のコアクチベーターとして 機 能 していることが 報 告 さ れており (37)SREBP による 転 写 活 性 化 機 構 の 全 貌 が 徐 々に 明 らかになりつつある FPPS 遺 伝 子 のプロモーター 領 域 および LDL レセプター 遺 伝 子 のプロモーター 領 域 を プローブとしてゲルシフトアッセイを 行 うと SREBP を 単 独 で 加 えるよりも NF-Y ま たは Sp 1 を 同 時 に 加 えた 方 が SREBP のプローブへの 結 合 が 増 すととが 報 告 されている,, 40) 最 近 になって SREBP の bhlh - ZIP 領 域 (ω~ωa.a. )と NF -Y が 直 接 結 合 することが 報 告 された( ) しかしながら NF - Y のどの 領 域 が SREBP と 結 合 して いるのかは 明 らかにされていない NF-Y と Sp 1 を 比 較 すると どちらにも 転 写 活 性 化 ドメインとしてグルタミンリッチな 領 域 が 存 在 する(, ) こ のことから N 下 Y また は Sp 1 のグルタミンリッチな 領 域 が SREBP との 協 調 的 作 用 に 深 く 関 与 している 可 能 性 が 考 えられる 本 実 験 において SREBP と NF -Y の 結 合 領 域 の 間 隔 が その 協 調 的 な 転 写 活 性 化 に 影 響 を 及 ぼすかどうかを 検 討 した SREBP と NF -Y の 結 合 領 域 の 間 隔 が 15 塩 基 から 20 塩 基 の 時 に 転 写 活 性 化 のピークが 見 られた データには 示 していないが SREBP - 2 遺 伝 子 の NF-Y 結 合 領 域 を 逆 向 きにしても SREBP による 転 写 活 性 化 能 には 変 化 は 見 られな かった これらのことから SREBP と NF-Y が 直 接 結 合 するのにその 方 向 性 は 重 要 でな く 2 箇 所 の 間 隔 が 15 塩 基 から 20 塩 基 で 最 も 高 い 活 性 化 が 得 られると 考 えることがで きる 実 際 に 現 在 までに SREBP と NF-Y による 転 写 活 性 化 を 受 ける 遺 伝 子 のそれぞ れの 結 合 配 列 の 間 隔 は( bp HMG-CoA 合 成 酵 素 ; bp スクアレン 合 成 酵 素 ; bp と 16bp bp) となり 本 実 験 での 転 写 活 性 化 能 のピークになる 範 囲 に 集 まっている 一 方 SREBP と Spl の 組 み 合 わせによって 転 写 が 活 性 化 される 遺 伝 子 のそれぞれの 結 合 配 列 の 間 隔 は (LDL レセプター; bp と 5 bp ACC ; bp と 3 旬 FAS; bp) とな り NF-Y の 場 合 と 比 較 するとぱらつきが 見 られる さらに LDL レセプター 遺 伝 子 にお いて Spl 結 合 領 域 を 逆 向 きにすると 転 写 活 性 化 能 が 著 しく 低 下 することからも (39 )

17 N F - Y と Spl は SRE BP と 転 写 を 活 性 化 する 際 に 固 有 の 条 件 を 要 するととが 推 察 される あ 一 三 章 SREBP が 転 写 を 八 ; 進 する 新 規 遺 伝 子 の 探 系 ) 小 括 ヒト HMG - CoA 合 成 酵 素 遺 伝 子 了 上 流 領 域 約 0. 5 Kb のクローニングを 行 った レ ポ ーターアッセイの 結 果 コレステロールに 応 じた 転 写 調 節 には CBl と SREl が 必 須 であり さらに こ の 2 つ の 因 子 の 補 助 として SRE2 と Spl が 作 用 している ことを 明 らかにした ヒト スクアレン 合 成 酵 素 遺 伝 子 においては SREl と CBl さらに SRE2 と CBl が 協 調 的 に 作 用 しており との 作 用 が 合 わさることにより 高 いレベルの 活 性 化 が 起 こることを 明 らかにした ゲルシフト アッ セイにより HMG -CoA 合 成 酵 素 遺 伝 子 およびスクアレン 合 成 酵 素 遺 伝 子 の CBl に NF-Y が 結 合 するととを 示 した SREBP と NF -Y 結 合 領 域 の 間 隔 を 8 から 32 塩 基 まで 変 化 させたところ その 転 写 活 性 化 能 は 15 から 20 塩 基 のところに l つの 大 きなピークが 見 られた SREBP はコレスチ 口 ー-)レによるプイードバックレギコレーションを 担 う 肉 子 ルじて 発 見 されたが 最 近 になって SREBP-2 はコレステロール 代 謝 関 連 遺 伝 チを 制 御 し は 脂 b 酸 代 謝 関 連 遺 伝 子 の 転 写 を 調 節 すると 考 えられている また SREBP-l は 脂 肪 細 胞 において 高 発 現 していることが 確 認 されており 脂 肪 細 胞 分 化 における 1 の 寄 与 が 明 らかにされつつある そこで 広 範 な 標 的 遺 伝 子 を 持 っととが 予 想 さ れる SREBP - l の 転 写 調 節 のネットワークの 全 貌 を 明 らかにするため SREBP 1 によっ て 転 写 調 節 される 新 規 遺 伝 子 の 探 索 を 行 なった 第 一 節 la 発 現 細 胞 株 の 樹 立 ) 実 験 材 料 および 実 験 方 法 IPTG )を 用 いた による 誘 導 によって SREBP-la )を 発 現 する 細 胞 株 の 樹 立 プラスミド 構 築 : ヒト SREBP - l a の アミノ 酸 をコードする 領 域 の DNA 断 片 を PCR 法 によって 増 幅 し これを popi3ca )の Not 1 部 位 に 挿 入 した このプラスミドを 1 と 名 イ 寸 けた 細 胞 培 養 : ) 細 胞 チャ イ ニーズハムスター 卵 巣 由 来 の CHO - Kl 2) 培 地 % 牛 胎 児 血 清 3) 培 養 条 件 37 0 C CO 2 濃 度 5 %で 培 養 した 細 胞 遺 伝 子 導 入 と 薬 物 による 選 択 : Kl 細 胞 を 6 0 dis h に1. 5xl0 5 個 まき (dayo ) dayl に 3μg の p3'ss をリン 酸 カルシウム 法 を 用 いて 導 入 した day2 に 100 dish にまき 直 し day4 に 400μ glml) を 加 えた 得 られた hygromycin 耐 性 細 胞 を CHO-Lac と 名 付 けた 次 に CHO-Lac に po P I 3SREBPl を 導 入 し hygromycin 400μ glml) と G418 (500μg 加 1 を 加 えた 培 地 で 培 養 し 得 られた 耐 性 株 を CHO と 名 付 けた 核 抽 出 液 の 調 製 と 総 RNA の 回 収 : CHO と CH O-Lac を 10μg/ml コレステロールと 1μg -ヒドロキシコレス テロール( 内 因 性 SREBP のプロセッシングを 抑 制 する 目 的 で 加 えた)および l mm IPTG を 含 む 培 地 で 1 9 時 間 培 養 した その 後 核 抽 出 液 を 第 一 章 第 三 節 に 準 じて 回 収 した 同 様 に 総 RNA を 第 一 章 第 一 節 に 準 じて 回 収 した ウエスタンブロット 法 : 20μg の 核 抽 出 液 を 10 SDS-PAGE により 分 離 後 PVDF 膜 に 転 写 した ヒト

18 SREBP-l 抗 血 清 ( 第 四 章 第 て 節 参 照 )を 用 いて ECL Am ersham) により 検 出 した 第 二 節 SREBP-la によって 転 写 が 充 進 する 遺 伝 子 のクローニング ノーザンブロット 法 : 20μg の RNA を 2.2 M ホルムアミドを 含 む 1% アガロースゲルで 分 離 後 ナイロン メンブレン フラスチャージ( )に 転 写 した cdna ( 東 京 大 学 先 端 研 教 授 児 玉 龍 彦 博 士 より 御 供 与 していただいた)を 用 いて DIG RNA ラベリングキット Mannhe 加 )により DIG ラベルした RNA フローブを 調 整 し DIG 発 光 検 出 キ ッ ト( Mannheim) によりハイブリダイズするバンドを 検 出 した それぞれのプロー ブは 翻 訳 開 始 コド ン ATG の A を+ 1 としたとき S17 では nt) HMG - CoA 合 成 酵 素 では ) 実 験 結 果 nt) に 対 応 する ウエスタンブロットの 結 果 IPTG での 誘 導 によって 約 70KDa の SREBP - 1a が 発 現 す ることが 確 認 された (Fig.15A) さらにノーザンブロットの 結 果 IPTG 処 理 によって CoA 合 成 酵 素 遺 伝 子 の 発 現 が 充 進 していることが 明 らかになった (Fig.15B) これ により CHO 487 細 胞 は IPTG 処 理 によって SREBP - 1a の 発 現 が 誘 導 され さらにその la は 実 際 に 転 写 活 性 化 能 を 持 つことを 示 した 一 + 一 + ) 実 験 材 料 および 実 験 方 法 差 引 きハイブリダイゼーション 法 : Wang と Brown の 差 引 きハイブリダイゼーション 法 ( )に 準 じた CHO と CHO-Lac を 10μg/ m1コレステロールと lμg - ヒドロキシコレステロールおよ び l mm IPTG を 含 む 培 地 で 19 時 間 培 養 し 総 RNA を 回 収 した さらに Oligo (dt) カラ ム( )を 用 いてボリ (A)RNA を 調 製 した さらに cdna を 用 いてお -cdna を 作 製 した これを 制 限 酵 素 AluI で 切 断 し 1 % ア ガロースゲルで 電 気 泳 動 後 約 300 bp の DNA 断 片 を ηle )を 用 いて 回 収 した これにリンカーをライゲーションした リンカーの 配 列 は 以 下 に 示 した( 下 線 は 制 限 酵 素 Eco RI の 認 識 部 位 ) リンカー 配 列 を 用 いて PCR 法 により cdna を 増 幅 した CHO-487 由 来 の cdna を Tracer cdna とし CHO - Lac 由 来 の cdna を Driver cdna とし た 次 に Driver cdna をビオチン 化 (170 W のランプで 7cm 15 凶 n )し 制 限 酵 素 EcoRI で 切 断 することによりリンカーを 切 り 離 した 2.5μg cdna と 50μg のビ オチン 化 した Driver cdna をハイブリダイズした (68 0 C 20 ) これ にストレプトアビジンを 加 え ビオチン 化 した Driver cdna およびそれとハイブリダイ ズした Tracer cdna を 取 り 除 いた Driver cdna とハイブリダイズしなかった Tracer cdna を 鋳 型 にしてリンカー 配 列 を 用 いて PCR を 行 い 増 幅 した( +1cDNA) 次 に 2.5μg と 25μg のビオチン 化 した Driver cdna をハイブリダイズした (68 t ) これにストレプトアビジンを 加 え ビオチン 化 した Driver cdna およびそれとハイブリダイズした Tracer cdna を 取 り 除 いた Driver cdna とハイ ブリダイズしなかった Tracer cdna を 鋳 型 にしてリンカー 配 列 を 用 いて PCR を 行 い 増 幅 した (+2cDNA) さらに long hybridization と short hybridization を 2 回 ずつ 行 い 十 6cDNA を 得 た この cdna を 制 限 酵 素 EcoRI で 切 断 し pbluescript の EcoRI 部 位 にライゲーショ ンした これにより 得 られた cdna をプローブにしてノーザンブロットを 行 い CHO-487 において IPTG 処 理 によって 誘 導 されるかどうかを 検 討 した た 次 に 実 際 に 誘 導 されている cdna の 塩 基 配 列 を 決 定 し BLAST による 解 析 を 行 なっ 5' ー CTCTTGCTTGAATTCGGACTA-3' SREBP 1a A, cont 出 ning 10μ glml 1μglml -μg ag 出 nst B, CHO Lac 10μglml 1μglml Twenty-μg gel, membran, HMGぐ oa 1, CHO-Lac~ 2, sep 訂 ate experiments, ノーザンブロット 法 : 20μg の RNA を 2. 2 M ホルムアミドを 含 む 1% アガロースゲルで 分 離 後 Hydond - N + 膜 (Am ersham) に 転 写 した 差 引 きハイブリダイゼーション 法 によって 得 られた cdna を 鋳 型 に Megaprime )および [α_ 32 pj 6000Cνmmo1) を 用 いプローブを 作 製 した 得 られたシグナルは BAS fjjm) を 用 いて 定 量 化 した ) 実 験 結 果 差 引 きハイブリダイゼーションの 結 果 SREBP-la によって 誘 導 される 遺 伝 子 に 由 来 する 10 個 の cdna を 得 た それら 遺 伝 子 の 転 写 産 物 は CHO-487 細 胞 で 確 かに 増 加 し ていた (Fig.16) 増 加 の 程 度 を 定 量 化 した 結 果 および BLAST による 解 析 でそれぞれの

19 ぢ, ク ロ ーンと 90 % 以 上 の 相 向 性 が ある cdna を Table 1 に 示 した クローン 2 と 3 は 現 在 までに 報 告 されている cdna と 相 向 性 が 低 く 新 規 な 遺 伝 子 であると 思 われる クロ ー ン 6 が FAS クローン 7 が SC D 2 ) ク ロ ーン 9 が HMG - C oa 合 成 酵 素 と 90 % 以 上 の 相 向 性 が 見 られ それぞれはチャ イ ニーズハ ム ス タ ー のオ ー ソ ロガス 遺 伝 子 と 結 論 できる これら 3 個 の 遺 伝 子 は 現 在 まで に SRE BP による 転 写 の 活 性 化 が 報 告 されており( ) これ は 本 実 験 が 良 好 に 進 行 していたことを 示 している 第 三 節 細 胞 内 コレステロールレベルに 応 じた 転 写 変 動 差 引 きハイブリダイゼーションにより 得 られた 遺 伝 子 のうち 現 在 までにコレステロー ル 量 に 応 じた 転 写 調 節 を 受 けるかどうか 明 らかでない 7 個 のクローンについて 実 際 に 細 胞 内 コレステロール 量 に 応 じて 転 写 が 変 動 するかどうかを 検 討 した ) 実 験 材 料 お よび 実 験 方 法 細 胞 の 調 製 と 総 陀 ~A の 回 収 : CHO -K1 細 胞 を 第 三 章 第 一 節 に 準 じて 培 養 した さらに 第 一 章 第 一 節 に 準 じてコ レステロ ー ル 過 剰 または 欠 乏 条 件 で 2 ト ーフ ェノ ー ル ークロ ロホル ム 抽 出 法 ( ) に よ り 調 製 した 日 間 培 養 した 総 RNA をグアニジンチ オ シアネー ノーザ ン ブロ ッ ト 法 : 第 三 章 第 二 節 に 準 じた ) 実 験 結 果 CHO 487 CHO Lac Twenty -μg samp 民 s gel, filters, 1, CHO Lac ; 2, 結 果 を Fig. 17 に 示 した ク ロ ー ン 1 )および ク ロ ーン 2 ( unknown) とク ロ ー ン 10 (ACL) はコレステロ ー ルを 欠 乏 させることで 1. 5 か ら1. 7 倍 の 転 写 活 性 化 が 見 ら れた もともと 発 現 の 少 ない Clone (M -protein) は 検 出 する こ とができなかった( da 回 shown) その 他 のクローンは 転 写 の 活 性 化 は 見 られなかった SREBP la INSIG 1 Ots 8 INSIG 1 ; d satur... 2 o (F 吋 i Film). 百 le h >ld ncrcéls じ F け ld +ー+ CHO Kl inhibitor, (ー). Ten-μg s~~ples ag 紅 ose gel, 仕 組 sfeηed filters, meωured 2 o (F 吋 i thrl 伐 separa 也 experiment s e s sentially 出 e

20 第 四 節 考 察 および 小 括 ) 考 察 SREBP - la により 転 写 が 抗 進 する 遺 伝 子 のうち クローン 6 が FAS クローン 7 が SCD2 クローン 9 が HMG - CoA 合 成 酵 素 であった これら 3 個 の 遺 伝 子 は 現 在 までに SREBP による 転 写 の 活 性 化 が 報 告 されている( ) クローン l の insulin - induced grow 出 response )はインスリン 刺 激 によっ て 誘 導 される 遺 伝 子 としてクローニングされているが( 46) その 機 能 は 明 らかにされて いない しかし 3T3 - Ll 細 胞 を 脂 肪 細 胞 へ 分 化 させることで 転 写 レベルで 誘 導 されるこ とが 報 告 されており( 47) 脂 質 代 謝 に 関 連 している 可 能 性 が 考 えられる また 脂 肪 細 胞 への 分 化 過 程 において SREBP-l SREBP が 関 与 しているととが 推 察 される の 発 現 が 冗 進 しているととから このときの 活 性 化 に クローン 4 の O 也 - 8 は TPA 刺 激 によって 誘 導 される 遺 伝 子 としてクローニングされて いるが( 48) その 機 能 は 明 らかにされていない クローン 5 の musculus M-protein はコネクチン 結 合 タンパク 質 としてクローニングさ れた( ) コネクチン(タイチン)とは 骨 格 筋 の 弾 性 タンパク 質 で 全 筋 原 繊 維 タンパ ク 質 中 に 約 10 % 含 まれている(ミオシンとアクチンの 含 量 はそれぞれ 44% と 20 %) M - protein はミオシンフィラメントを 支 える M 線 を 構 成 している この 遺 伝 子 はプロモー ター 領 域 もクローニングされており( ) CCAAT Box および E-Box が 多 数 見 られ SREBP により 直 接 制 御 を 受 けている 可 能 性 が 高 い SREBP が 筋 原 繊 維 の 構 成 タンパク 質 である M - protein の 発 現 を 転 写 レベルで 冗 進 することが どのような 生 理 的 意 味 を 持 つのかは 明 らかではない 今 後 他 の 筋 原 繊 維 の 構 成 成 分 の 発 現 が SREBP によって 調 節 を 受 けているかどうかを 検 討 するととで 筋 原 繊 維 における SREBP の 果 たす 役 割 が 明 確 になってくると 思 われる クローン 8 の malate )とクローン 10 の ATP (ACL) は 共 に 脂 肪 酸 合 成 に 関 る 酵 素 である (51, 52) 脂 肪 酸 の 生 合 成 の 初 発 段 階 は ACC と FAS によって 行 われる ACC はアセチル CoA からマロニル CoA を 合 成 する 酵 素 であり FAS はアセチル CoA とマロニル CoA から NADPH を 補 酵 素 として 脂 肪 酸 を 合 成 する 酵 素 である ACL はクエン 酸 を 分 解 し アセチル CoA を 供 給 し MNO はリン ゴ 酸 と NADP 十 からピルビン 酸 と CO 2 と NADPH を 合 成 する 酵 素 であり 脂 肪 酸 合 成 の 際 に 必 要 となる NADPH を 供 給 している このことから MNO ACL ACC FAS の 4 種 の 酵 素 は 脂 肪 酸 合 成 のスモールファミリーを 形 成 すると 考 えられている 現 在 までに ACC と FAS は SREBP によって 転 写 活 性 化 を 受 けるととが 報 告 されており 脂 肪 酸 合 成 に 対 する SREBP の 関 与 が 示 されている さらに 今 回 の 実 験 で MNO と ACL も SREBP による 転 写 活 性 化 を 受 ける 可 能 性 を 明 らかにした 脂 肪 酸 合 成 のスモールファミリーを 形 成 する 4 種 の 酵 素 すべてが SREBP による 直 接 制 御 を 受 けているかどうか 興 味 深 い クローン 2 3 は 現 在 報 告 されている cdna と 相 向 性 が 低 く 新 規 な 遺 伝 子 であると 考 えられる これらの 遺 伝 子 が 生 体 内 でどのような 機 能 を 担 っているのかを 今 後 の 研 究 で 明 らかにすることが 望 まれる ここで 得 られた 遺 伝 子 が 細 胞 内 コレステロール 量 に 応 じて 転 写 調 節 を 受 けるかどうか を 検 討 した 結 果 クローン 1 )およびクローン 2 unknown) とクローン 10 ACL) の 転 写 が 調 節 されていることが 明 らかになった 他 のクローンは SREBP-la を 過 剰 に 発 現 した 場 合 に 転 写 が 活 性 化 されるが 細 胞 内 コレステロール 量 の 低 下 に 伴 った SREBP のプロセッシングの 冗 進 では 転 写 の 活 性 化 は 見 られなかった またクローン 5 の M-protein は 骨 格 筋 のタンパク 質 であり CHO - Kl 細 胞 では 発 現 が 低 いため 検 出 する ととができなかったと 考 えられる クローニングされた 10 個 の 遺 伝 子 のうち 4 個 のクローン [6(FAS) 7 (SCD2) 9 HMG -CoA 合 成 酵 素 ) ]は SREBP が 直 接 フロモーター 領 域 に 結 合 し 転 写 を 冗 進 すること が 明 らかにされている クローン 10 (ACL) も 我 々のグループが SREBP により 直 接 調 節 を 受 けることを 明 らかにしている しかしその 他 のクローンは SREBP - la )を CHO-Kl 細 胞 に 発 現 させることで 転 写 が 誘 導 されるが これが SREBP が 直 接 それぞ れのプロモーター 領 域 に 結 合 することで 転 写 を 活 性 化 しているのか あるいは SREBP が 第 三 の 因 子 の 発 現 を 抑 制 または 充 進 する 副 次 的 な 結 果 によるものであるかどうかは 明 らかではない 今 後 個 々の 遺 伝 子 の 解 析 が 待 たれる また Tracer cdna と Driver cdna を 逆 にすることで SREBP - la によって 転 写 が 抑 制 さ れる 遺 伝 子 を 探 索 することもできる 我 々はすでに Microsomal れは SREBP ) 遺 伝 子 が SREBP によって 転 写 が 抑 制 されるととを 明 らかにしており こ を 介 した 転 写 調 節 の 多 様 性 を 示 している このことからも SREBP によって 転 写 が 抑 制 される 遺 伝 子 を 本 方 法 によって 探 索 することで さらに 詳 細 な SREBP によ る 転 写 調 節 のネットワークが 明 らかになると 思 われる ) 小 括 (Stratagene) を 用 いて IPTG 誘 導 によって SREBP - la )を 発 現 する 細 胞 株 CHO-487 を 樹 立 した 2. 差 引 きハイブリダイゼーション 法 によって SREBP-la によって 転 写 が 誘 導 される 10 個 の 遺 伝 子 のクローニングに 成 功 した そのうちの 7 個 のクローンは 現 在 までに SREBP による 転 写 の 活 性 化 は 報 告 されていない クローン 1 )およびクローン 2 (unknown) とクローン 10 (ACL) は 細 胞 内 コレステロール 量 を 欠 乏 させることで 転 写 が 活 性 化 された

21 第 四 章 脂 肪 細 胞 分 化 過 程 における SREBP の 発 現 (Promega) を 用 いて 決 定 した SREBP - l は 前 駆 脂 肪 細 胞 である 3T3-L 1 細 胞 が 脂 肪 細 胞 に 分 化 する 過 程 において 転 写 レベルで 発 現 が 冗 進 することが 報 告 されている( Spiegelman 等 のグループでは 3T3-Ll 細 胞 には SREBP - lc がドミナントに 発 現 し さらに 分 化 誘 導 によって SREBP-lc の 転 写 が 充 進 すると 報 告 している( ) しかし Brown 等 のグルーフでは SREBP - la がド ミナントであり 分 化 誘 導 によって SREBP-la の 転 写 が 元 進 すると 報 告 しており( 54) 両 者 の 実 験 結 果 は 異 なっている そこで 私 は 3T3 - Ll 細 胞 に 発 現 している SREBP-l のア イソフォームを 確 認 した SREBP は 小 胞 体 膜 や 核 膜 に 前 駆 体 として 局 在 し 細 胞 内 コレステロール 量 の 低 下 に 伴 いプロセッシングを 受 け N 末 端 側 が 核 内 へと 移 行 し 転 写 因 子 として 機 能 する との ことから 脂 肪 細 胞 への 分 化 過 程 において SREBP が 転 写 因 子 としての 機 能 を 発 揮 する ためには コレステロール 存 在 下 においてもフロセッシングが 起 きることが 必 要 になる すなわち コレステロールによるプロセッシングの 制 御 とは 異 なったフロセッシング 機 構 の 存 在 が 考 えられる そこでコレステロールによるフロセッシングに 関 与 している SIP S2P SCAP 遺 伝 子 および SREBP - 2 遺 伝 子 などの 転 写 が 脂 肪 細 胞 分 化 過 程 におい てどのような 挙 動 を 示 すのかも 検 討 した 一 方 脂 肪 細 胞 への 分 化 過 程 では SREBP-1 の 転 写 が 允 進 することは 示 されているが タンパク 質 レベルでの 発 現 は 確 認 されていな い この 点 に 注 目 し SREBP - l のタンパク 質 レベルでの 発 現 を 解 析 した 第 一 節 脂 肪 細 胞 分 化 過 程 における SREBP-l SREBP-2 の 転 写 レベルでの 発 現 -ノーザンブロット 方 法 は 第 三 章 第 二 節 に 準 じた プローブ 作 製 用 のテンプレ ー トとしては 以 下 に 示 す DNA 断 片 を 用 いた ハイブリダイゼーションのシグナルは BAS2000 により 数 値 化 した SREBP-l SREBP-2 SCAP ではそれぞれのヒトの cdna をテンプレートにして PCR 法 によって 増 幅 した DNA 断 片 を SlP S2P ではそれぞれマウス cdna をテンプレート にして PCR 法 によって 増 幅 した DNA 断 片 を 用 いた それぞれの DNA 断 片 は SREBP-l では nt) SREBP-2 では ) SCAP では nt) S1P では nt) S2P では 567nt) に 対 応 する いずれも 開 始 コドン の l 番 目 の 塩 基 から 数 えている 2 と 36B4 cdna は Spiegelman 博 士 より 御 供 与 していただいたものを 用 いた プローブとして 以 下 の 領 域 を 用 いた PPARγ2 ;マウス PPARγ2cDNA を 制 限 酵 素 EcoRI で 切 断 して 得 た 0. 8Kb の 断 片 36B4 マウス 36B4 cdna を 制 限 酵 素 Pst 1 で 切 断 して 得 た 0.6Kb の 断 片 ) 実 験 結 果 ) 実 験 材 料 および 実 験 方 法 3T3-L1 細 胞 の 分 化 誘 導 総 RNA の 回 収 3T3-L1 細 胞 の 分 化 誘 導 は Lane )の 方 法 に 従 った 3T3-L1 細 胞 を 基 本 培 地 で 培 養 し 細 胞 がコンフレントになってから 2 日 後 を DO とした このときから 分 化 誘 導 培 地 で 培 養 し 42 時 間 後 に 成 熟 促 進 培 地 に 交 換 した Dl から D6 までと D10 および 増 殖 期 の 総 RNA を 第 一 章 第 一 節 に 準 じて 回 収 した Fig.1 8B に 示 したように RT-PCR の 結 果 3T3-Ll 細 胞 においては SREBP-la がドミナ ントに 発 現 していることが 明 らかになった また 3T3-L1 細 胞 を 脂 肪 細 胞 に 分 化 誘 導 し た DI0 においても SREBP-1a がドミナントであり Brown 等 と 同 様 の 結 果 になった マ ウス 肝 臓 においては SREBP-1c が 高 発 現 していた Fig. 19 に 示 したように 脂 肪 細 胞 への 分 化 のマーカーである PPARγ2 は 約 13 倍 に 誘 導 された また SREBP-l も 約 2.3 倍 に 誘 導 された SREBP - 2 S1P S2P SCAP は 発 現 に 大 きな 変 動 は 認 められなかった 基 本 培 地 100μM アスコルビン 酸 + 分 化 誘 導 培 地 : 基 本 培 地 + μm デキサメタゾン mmトメチル -3-イソブチルキサンチン 10μ g1ml インスリン 成 熟 促 進 培 地 : 基 本 培 地 +5μ glml インスリン 3T3-Ll 細 胞 の 増 殖 期 および 脂 肪 細 胞 へ 分 化 誘 導 後 ( DI0) の 附 仏 およびマウス 肝 臓 由 来 の RNA より First -strand s 戸 出 esis )を 用 いて FirstcDNA を 作 製 した これをテンプレートにして Fig. 18A に 示 したプライマー( 1a 1c 1ac) を 用 いて PCR (25 サイクル 94 't 30sec 60 oc30sec 72 't 30sec )を 行 った ととで 用 いたフ ライマーの 塩 基 配 列 は 以 下 に 示 した 反 応 液 を1. 0 %アガロースゲルで 泳 動 し エチジ ウムブロマイド 染 色 した (Fig. PCR 産 物 を The )により 回 収 し TA ベクタ 一 ( )に DNA )を 用 いてライゲーションし た( oc 1 時 間 ) フラグメントの 塩 基 配 列 は Silver I 一 SREBP 1c ーや h 叩 側 聞 車 -- L 一..J Lーー 3T3 L1 3T3 し 1 3T3 Ll A, SREBP-lc 訂 e B, electropho 陀 tic Templa 舵 cdna; Lanel,2 liver, Lane3,4 stage), Lane5,6 stage,d 1,3,5) 2 人 6), 島 ーーーー

22 SRlBI 人 l 1. け Id inじ rca ~ c i nc r c 山 c () 討 Il. 討 ().() ら I P in じ rcd ;, C 1. 抗 1.0 (1. 討 O.~ i n crc 凶 C (). 芯 お( 人 p in じ じé1 \ C 1 ' 1' 入 J{ ~' 轟 轟 轟 ncrc,,;,じ 園 田 2.2 ()り 7. '2 SREBP 1a 3T3 L1 Twenty-μg were 仕 actionated gel, 36B4 ロボNA )およびマウス SREBP - la )に 対 する 抗 血 清 および Dyn amics) を 用 いて Fluorlmager Dynamics) により 検 出 した ) 実 験 結 果 3T3-L1 の 脂 肪 細 胞 への 分 化 過 程 において 核 内 の SREBP - l は 約 4 倍 に SREBP - 2 は 約 3 倍 に 上 昇 した( ) メI< I:ßP 日 I< EBP - 2,() H-l 第 二 節 脂 肪 細 胞 分 化 過 程 における SREBP-1 SREBP-2 のタンパク 質 レベルでの 発 現 変 化 U A づ U U J C アコ ~. () ) 実 験 材 料 および 実 験 方 法 ー - 抗 血 清 の 調 製 抗 原 は pet )を 用 いて 作 製 した 第 一 章 第 三 節 で 作 製 したヒト (1""'481A.A. ) および それに 準 じて 作 製 したマウス SREBP-1a およびヒト SREBP-la (1""'487A.A.) を 用 いた 発 現 プラスミドは 次 のようにして 作 製 し た マウス SREBP-la タンパク 質 の アミノ 酸 をコードする DNA 断 片 が TA ベク ター( )に 挿 入 されたフラスミドを 制 限 酵 素 EcoRI で 切 断 した この DNA 断 片 を pet - 28c Novagen) の EcoRI 部 位 に 組 み 込 んだ ヒト SREBP-1a タンパク 質 の 1""' 487 アミノ 酸 をコードする DNA 断 片 が TA ベクター( )に 挿 入 されたプラスミ ドを 制 限 酵 素 EcoRI と Hind III で 切 断 した この DNA 断 片 を pet-28a (Novagen) の Eco III 部 位 に 組 み 込 んだ 精 製 したヒト SREBP-2 )とマウス SREBP-la )およびヒト 150μglml) をそれぞれ 等 量 の Freund の complete a 匂 uvant と 混 合 し Japanese White 雌 性 ウサギ( 約 2 kg) の 皮 下 に 投 与 した との 操 作 を 2 週 間 毎 に 8 回 行 い 最 終 投 与 から 一 週 間 後 に 耳 静 脈 から 血 液 を 採 取 し 抗 血 清 を 得 た - 細 胞 の 回 収 3T3-Ll 細 胞 を 第 四 章 第 一 節 に 準 じて 脂 肪 細 胞 へ 分 化 させ 第 一 章 第 三 節 に 準 じて 核 抽 出 液 を 調 製 した -ウエスタンブロット 法 20μg の 核 抽 出 液 を 10 SDS-PAGE により 分 離 後 PVDF 膜 に 転 写 した ヒト 4 汚 6 Jay SREBP 2 3T3 L1 Twenty-μg direc 胞 d agむnst NH~-terr 凶 nal essentialy 出 e 第 三 節 考 察 および 小 括 ) 考 察 3T3-L1 の 脂 肪 細 胞 への 分 化 過 程 において SREBP-la の 転 写 レベルが 上 昇 することを 明 らかにした しかし タンパク 質 レベルでは SREBP-la と SREBP-2 の 両 方 とも 核 内 の 成 熟 体 量 が 増 加 しており 脂 肪 細 胞 への 分 化 過 程 において SREBP のプロセッシングが 冗 進 していることが 示 唆 された とれは 脂 質 を 蓄 積 した 脂 肪 細 胞 におけるプロセッシング の 冗 進 であり 現 在 までに 明 らかにされている 細 胞 内 コレステロール 量 の 減 少 に 伴 うプ ロセッシングとは 異 なった 機 構 により SREBP のフロセッシングが 制 御 されている 可 能 性 が 考 えられる さらに SlP S2P SCAP などの コレステロール 量 に 応 じたプロセッ シングに 関 与 するタンパク 質 の 発 現 が 転 写 レベルで 大 きな 変 動 を 示 さないととからも 脂 肪 細 胞 への 分 化 過 程 において SREBP の 新 規 なプロセッシング 機 構 の 存 在 が 考 えられ

23 る データには 示 していないが 分 化 誘 導 の 際 に 核 内 に 増 加 する SREBP-2 の 成 熟 体 と 3T3 - L1 細 胞 をコレステロール 欠 乏 培 地 で 培 養 した 際 に 核 内 に 増 加 する SREBP-2 の 成 熟 体 との 分 子 量 を 比 較 すると ウエスタンブロットのレベルではほとんど 違 いが 見 られな かった このことから 脂 肪 細 胞 における SREBP のフロセッシングは コレステロー ルに 応 じたプロセッシングの 切 断 部 位 と 同 一 またはその 近 傍 であると 推 察 される 脂 肪 細 胞 において SREBP はどのような 役 割 を 果 たしているのであろうか 3T3-L1 細 胞 に SREBP - 1 の dominant ( 多 量 体 は 形 成 するがDNA には 結 合 しない)を 発 現 させることにより 内 因 性 の SREBP の 機 能 を 欠 失 させると 脂 肪 細 胞 への 分 化 が 抑 制 さ れることが 報 告 されている( ) また 脂 肪 細 胞 分 化 のマスターレギュレーターである と 考 えられている PPARy のリガンド 量 を SREBP が 増 加 させるという 報 告 もある (56 ) しかし SREBP - 1 のノックアウトマウスでは 脂 肪 細 胞 が 正 常 に 見 られることも 報 告 され ており( ) 脂 肪 細 胞 への 分 化 過 程 における SREBP の 役 割 は 明 らかではない また 3T3 - Ll 細 胞 では SREBP - la がドミナントであるが マウスの 脂 肪 細 胞 においては SREBP - lc がドミナントであることが 報 告 されている( 58) 従 って 脂 肪 細 胞 分 化 の モデル 細 胞 として 多 用 されている 3T3-L1 細 胞 での 知 見 が SREBP-l の 機 能 に 関 する 限 り どこまで in vivo を 反 映 しているのか 更 に 比 較 検 討 を 進 めていく 必 要 があると 思 わ れる ) 小 括 3T3 - Ll において SREBP - la がドミナントに 発 現 していることを RT-PCR 法 により 示 した 3T3 Ll 細 胞 における 脂 肪 細 胞 への 分 化 過 程 において SREBP - 1a の 転 写 レベルが 充 進 することを 示 した また SREBP - 2 遺 伝 子 およびコレステロールに 応 答 した SREBP のプロセッシングに 関 与 している S1P S2P SCAP の 発 現 が 転 写 レベルで 大 きく 変 動 していないことを 示 した 3T3-L1 細 胞 における 脂 肪 細 胞 への 分 化 過 程 において SREBP-la および SREBP-2 の 成 熟 体 が 核 内 に 増 加 することを 示 した 総 括 コレステロールは 生 体 にとって 必 要 不 可 欠 な 成 分 であるが その 摂 取 量 が 多 すぎると 動 脈 硬 化 などの 原 因 のひとつになる そのために 生 体 は 細 胞 内 のコレステロール 量 が 過 剰 になると コレステロールの 合 成 および 血 中 からの 取 り 込 みを 転 写 レベルで 制 御 して いる その 制 御 を 担 う 転 写 調 節 因 子 として SREBP が 発 見 された SREBP は 合 成 後 小 胞 体 膜 および 核 膜 に 前 駆 体 として 局 在 し 細 胞 内 コレステロール レベルの 低 下 に 伴 って 2 段 階 のプロセッシングを 受 け N 末 端 側 が 切 り 離 され とれが 核 内 へと 移 行 して 転 写 因 子 として 働 く コレステロールによる SREBP の 制 御 は プロ セッシングの 段 階 でのみ 行 われていると 考 えられていた 遺 伝 子 の 転 写 を SREBP しかし 本 研 究 により SREBP-2 自 身 が 活 性 化 することを 示 したことで コレステロールによる SREBP の 制 御 はプロセッシングの 段 階 だけではなく SREBP - 2 の 前 駆 体 量 を 増 加 させ ることによってより 効 率 的 に 行 われるという 新 たな 機 構 の 存 在 を 示 した SREBP による 転 写 活 性 化 は NF -Y または Spl といったユビキタスに 発 現 している 転 写 因 子 と 協 調 的 に 作 用 することが 必 須 であると 考 えられている 本 研 究 により SREBP - 2 スクアレン 合 成 酵 素 HMG - CoA 合 成 酵 素 遺 伝 子 の 転 写 活 性 化 には SREBP と NF - Y の 協 調 的 な 作 用 が 必 須 であることが 明 らかになった さらにその 転 写 活 性 化 は プロモー ター 上 で SREBP と NF-Y の 結 合 配 列 が 15 塩 基 から 20 塩 基 のとき 最 大 になることを 示 した 現 在 のところ SREBP は 5' -C 汀 A ' 配 列 に NF -Y は CCAATBox に Spl は GC Box に 結 合 すると 考 えられている このことから SREBP はかなり 多 くの 遺 伝 子 のプロモーター 領 域 に 結 合 すると 考 えられる しかし 転 写 を 活 性 化 するためにはその 15 から 20 塩 基 離 れた 位 置 に CCAATBox (または GC Box) が 必 要 であり これにより 特 異 的 な 遺 伝 子 を 活 性 化 するこができると 考 えることができる すなわち SREBP は 細 胞 内 のコレステロールレベルのセンサーであり NF-Y および Spl は 特 異 的 な 遺 伝 子 を 活 性 化 するために 機 能 してると 推 察 することができる また 本 研 究 において SREBP によって 転 写 が 活 性 化 される 新 規 な 遺 伝 子 のク 口 一 ニン グを 行 なった その 結 果 とこれまでの 知 見 を 考 え 合 わせると 脂 肪 酸 合 成 を 担 うスモー ルファミリーである 札 制 O ACL FAS ACC の 4 種 の 遺 伝 子 すべてが SREBP によっ て 転 写 調 節 を 受 けることが 示 された また 骨 格 筋 に 含 まれる M-protein が SREBP によっ て 活 性 化 を 受 けることが 明 らかになった 現 在 のところ なぜ 細 胞 内 のコレステロール レベルに 応 じて 脂 肪 酸 合 成 や 骨 格 筋 に 含 まれるタンパク 質 をコードする 遺 伝 子 の 転 写 が 調 節 されるのかは 不 明 である 最 近 の 報 告 によると インスリンにより SREBP-lc の 転 写 およびプロセッシングが 冗 進 し( ) Fish Oil に 含 まれるアラキドン 酸 やリノール 酸 などの 多 価 不 飽 和 脂 肪 酸 がこ れを 阻 害 することが 明 かにされた(,, ) このことから 考 えると 細 胞 内 コレス テロールレベルに 応 じて 脂 肪 酸 合 成 が 調 節 されるのではなく それを 担 う 因 子 が SREBP であるため コレステロールの 低 下 によって SREBP が 活 性 化 されると その 結 果 として 脂 肪 酸 合 成 に 関 る 遺 伝 子 までもが 活 性 化 されると 考 えることが 妥 当 と 思 われる さらに 脂 肪 細 胞 への 分 化 過 程 において SREBP のプロセッシングが 允 進 しているこ とを 示 した これはコレステロール 存 在 下 におけるプロセッシングの 允 進 であり 新 た なプロセッシング 機 構 の 存 在 を 示 している このととからも SREBP がコレステロール 代 謝 だけでなく 脂 肪 酸 代 謝 など 多 岐 にわたる 機 能 の 調 節 を 担 っていると 考 えられる SREBP による 転 写 調 節 の 全 貌 は 未 だ 明 らかになっていない 私 は SREBP-2 遺 伝 子 の 自 己 制 御 機 構 を 明 らかにし さらに SREBP がコレステロール 代 謝 のみならず 脂 質 代 謝 全 般 を 調 節 することを 明 らかにした 今 回 の 研 究 成 果 は 生 理 作 用 の 解 明 に 大 きく 貢 献 したと 考 えられる SREBP の 多 岐 にわたる

24 士 滑 口 川 町 三 ム 再 開 謝 辞 SREBP - 2 遺 伝 子 の 転 写 が SREBP と NF - Y による 協 調 的 な 作 用 によって 活 性 化 されることを 示 した これによって SREBP-2 遺 伝 子 の 転 写 の 自 己 制 御 機 構 を 明 らかにした HMG -C oa 合 成 酵 素 遺 伝 子 およびス クアレン 合 成 酵 素 遺 伝 子 の 転 写 が SREBP と NF - Y による 協 調 的 な 作 用 によって 活 性 化 されることを 示 した また SREBP と NF -Y 結 合 領 域 の 間 隔 が 15 から 20 塩 基 のときその 活 性 化 は 最 大 となることを 明 らかにした )を 発 現 する 細 胞 株 CHO を 用 いて 差 引 きハイブリ 夕 イゼーション 法 を 行 なった その 結 果 SREBP - 1a によって 転 写 が 誘 導 される 10 個 の 遺 伝 子 のクローニングに 成 功 した 3T3-L1 細 胞 における 脂 肪 細 胞 への 分 化 過 程 において SREBP-1a の 転 写 レベルが 充 進 し SREBP-2 の 転 写 レベルが 大 きく 変 動 しないととを 示 した またそのとき SREBP - l および SREBP - 2 の 成 熟 体 が 核 内 に 増 加 することを 示 した これにより 脂 肪 細 胞 への 分 化 過 程 において SREBP の 新 規 なプロセッシング 機 構 の 存 在 を 示 した 本 研 究 を 遂 行 するにあたり 終 始 に 亙 ってご 指 導 とご 鞭 縫 を 賜 りました 大 阪 大 学 薬 学 部 教 授 恩 師 前 田 正 知 先 生 に 篤 く 御 礼 申 し 上 げます 研 究 途 上 有 益 なご 助 言 とご 配 慮 をいただきました 東 京 大 学 農 学 部 助 教 授 佐 藤 隆 一 郎 先 生 に 深 く 感 謝 いたします また 本 研 究 にあたり 種 々ご 指 導 を 頂 きました 大 阪 大 学 薬 学 部 助 手 寺 田 知 行 先 生 に 感 謝 の 意 を 表 すと 共 に 実 験 に 熱 心 に 御 協 力 頂 きました 大 阪 大 学 薬 学 部 坂 井 祐 子 修 士 宮 本 亘 修 士 岡 本 章 裕 修 士 安 倍 紀 学 士 林 崎 由 佳 学 士 さらに 討 論 に 参 加 して 頂 きました 大 阪 大 学 薬 学 部 分 子 生 物 学 講 座 の 皆 様 に 深 く 感 謝 いたします 本 研 究 を 行 うにあたり 御 協 力 を 頂 ました 東 京 大 学 農 学 部 教 授 清 水 誠 先 生 に 深 く 感 謝 いたします 配 ~ Assay を 行 うにあたり 御 協 力 いただきました 東 京 大 学 先 端 研 教 授 児 玉 龍 彦 博 士 並 びに 川 辺 良 樹 博 士 に 深 く 感 謝 いたします NF-YB 抗 体 を 御 供 与 いただきましたミラノ 大 学 Mantovan i. R 博 士 に 深 く 感 謝 します 差 引 きハイブリダイゼーション 法 を 行 うにあたり ご 指 導 いただきました 神 戸 大 学 医 学 部 教 授 江 本 憲 昭 博 士 に 深 く 感 謝 します 最 後 に 在 学 中 の 経 済 的 支 援 を 賜 りました 日 本 育 英 会 ならびに 日 本 学 術 振 興 会 に 感 謝 いたします

25 Bloch, 150, 引 用 文 献 Brown, M.S., Goldstein, 23 2, Bilheimer, O.W., Grundy, S.M., Brown, M 弓, fu~d Go1dstein, 80, Goldstein, J.L., Brown, 3 量 '1 Briggs, M.R., Yokoyama, C., Wang, X., Goldstein, 268, Smith, J.R., Osborne, T.F., Brown, M.S., Gold~tein, J.L., Gíl, 263, Wang, X., Briggs, M.R., Hua, X., Yokoyama, C. 司 Goldstein, J.L., Brown, 268, Yokoyarna, c., Wang, X., Briggs, M.R., Admon, A, Wu, J., Hua, X., Goldstein, J.L., Brown, 5, Hua, X., Yokoyama, c., 1., Briggs, M.R., Brown, M.S., Goldstein, 90, Bennett, M.K., Lopez, J.M., Sanchez, H.B., Osborne, 270, Kawabe, Y., Salo, R., Malsumoto, A., Honda, M., Wada, Y., Y 位 aki, Y., Endo, A., Takano, T., Itakura, H., Ko 正 lama, 219, Lopez, J.M., Bennett, M.K., Sanchez, H.B., Rosenfeld, J.M., Osborne, 93, Wang, X., Sato, R., Brown, M.S., Hua, X., Goldstein, Ce1l 77, Sato, R., Yang, J., Wang, X., Evans, M.J., Ho, Y.K., Goldstein, J. L., Brown, 269, Hua, X., Sakai, J., Ho, Y.K., Goldstein, 1.L., Brown, 270, Sakai, J., Rawson, R.B., Espenshade, P.J., Cheng, 0., Seegmiller, A.C., Go1dslein, Brown, 2, Rawson, R.B., Ze lenski, N.G., Nijhawan, D., Ye, J., Sakai, J., Hasan, 恥 1.T., Chang, T. Y., Brown,お1.S. Go1dstein, 1, Hua, X., Nohturfft, A., Goldstein, J.L., Brown, 87, Sheng, Z., Otani, H., Brown, M.S., 加 d Goldstein, 92, Kim, Spiegelman, 10, Gey, G.O., Coffman, W.O., Kubicek, Scherer, W.F., Syverton, J.T., Gey, 97, Johnson, K.A., Morrow, C.J., Knight, G.O., Scallen, 35, Chomczynski, 15, Kawabe, Y., Shimokawa, T., Matsumolo, A., Honda, M., Waぬ, Y., Yazaki, Y., Endo, A., Itakura, H., Kodama, 208, Kawabe, Y., Honda, M., Wada, Y., Yazaki, Suzuki, T., Ohba, Y., Nabata, H., Endo, A., Matsumoto, A., Itakura, H., Kodarna, 202, Frohman,.A., Oush, M.K., Martin, 85, Lund, 1 6, Chen, C. 加 d Okayama, 7, Sudhof, T.C., Westhuyzen, O.R., Goldstein J. L., Brown, M.S., Russell, Shimano, H., Horton, J.O., 1., Hammer, R.E., Brown, Goldsteín, ln ν e st. 99, Horton, J.O., Shimomura, 1., Brown, M.S., Hammer, R.E., Goldstein, Shimano, 101, 233 ト 2339 Jiang, G., McKenzie, T.L., Conrad, Shechler, 268, Gil, G., Smith, J.R., Goldstein, Brown, 84, Guan, G., Jiang, G., Koch, Shechter, 270, Ericsson, J., Jackson, S.M., Lec, B.C., Edwards, Acαd. Oooley, K. A., Bennett, Osborne, 274, Ericsson, J., Jackson, S.M., Edwards, ) よ Bio l. 71, Sanchez, H.B., Yieh, Lynn., Osborne, 270, Yieh, L., Sanchez, H.B., Osborne, 92, 卜 Oooley, K. A., Millinder, andosborne, 273, Courey, A.J., 加 d Tjian, 55, 93, Li, Y., Huijsduijnen, O.A., Mantovani, R., Benoisl, C., Malhis, 267, Wang, andbrown, 88, Tabor, O.E., Kim, 1.B., Spiegelman, Edwards, 274, Oiamond, R. H., Ou, K., Lee, M., Mohn, K.L., Haber, Tewari, Taub, 268, Peng, Y., Schwarz, E.J., L 位 ar, M.A., Genin, A., Spínner, 43, Nose, Saito, Kuroki, 268, Vinkemeier, U., Obermann, W., Weber, Furst, 106, Steiner, Weber, Furst, 49, Bagchi, S., Wise, S., Brown, M.L., Bregman, 0., Sul, Rubin, 262, EIshourbagy, N.A., Near, J.C., Kmetz, P.1., Sathe, G.M., Southan, c., Strickler, J.E., Gross, M., Young, J.F., Wells, andgroot, 265, Kim, J.B., Sarraf, P., Wright, M., Yao, K.M., Mueller, E., Solanes, G., Lowell, Spiegelman, 101, 1 9 Shimomura, I., Bashmakov, Y., Shímano, H., Horton, J.O., Go1dslein, Brown, 94, Lin, Lane, 6, Kim, J.B., Wright, H.M., Wright, M. 加 d Spiegelman, 95, Shimano, H 叶 Shimomura, I., Hammer,R.E., Herz, 1., Goldstein, J.L., Brown, Horton, 100, Shimomura, I., Shimano, H., Horton, J.O., Goldstein, Brown, 99, Worgall, T.S., Sturley, S.L., Seo, T., Osborne, T. F. 却 d Oeckelbaum, 273, Kim, H.-J., Takahashi, Ez 紘 i, 274, Xu, J., Nakamura, M.T., Cho, andclarke, 274, ,

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