Minor Variant Finder Software Quick Reference

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1 Minor Variant Finder ソフトウェア v1.0 Catalog Number A31100 Pub. No. A31786JP 製 品 情 報 Minor Variant Finder ソフトウェアは 簡 単 で 使 いやすいデスクトップソフトウェアです サン ガーシークエンスにより 得 られた 配 列 情 報 からマイナーバリアント(<25%のピーク)の 正 確 な 検 出 や 生 殖 細 胞 のヘテロ 変 異 の 検 出 に 使 用 できます この 資 料 は 使 用 方 法 について 記 載 されていますが より 詳 しい 資 料 であるMinor Variant Finder Software User Guide (Pub. no. MAN )も 併 せてご 参 照 ください 本 ソフトウェアは 以 下 のスペックを 満 たすコンピューターでご 利 用 が 可 能 です 表 1-1:ソフトウェア 推 奨 スペック コンピューター Windows コンピューター 2 GBハードディスクスペース 4GB 以 上 8 GB メモリ 推 奨 OS Windows 7 SP1, 32-bitまたは64-bit Windows 10 Pro, 64-bit ブラウザ Google Chrome Mozilla Firefox Microsoft Internet Explorer v.11 Microsoft Edge 解 像 度 1024 x 768 以 上 1280 x 1024 推 奨 ご 利 用 条 件 本 ソフトウェアはサンガーシークエンスデータに 生 じるバックグラウンドノイズをコントロ ールサンプル(Wild typeサンプル)を 指 標 にして 差 し 引 くことによってバリアントを 検 出 しま す 最 適 な 条 件 でバリアントの 検 出 をするために 以 下 の 条 件 のもとご 使 用 ください 表 1-2:ソフトウェア 使 用 条 件 データ 解 析 条 件 対 応 機 種 実 験 条 件 必 要 データ KB Basecaller v1.4 以 上 で 解 析 した ab1 ファイルが 必 要 です 配 列 データには N が 含 まれない 解 析 条 件 を 使 用 してください Applied Biosystems Genetic analyzer より 得 られた.ab1 ファイルでテストされています 3100 は KB Basecaller v1.4 以 上 で 解 析 さ れた.ab1 ファイルのみサポートします 最 適 な 結 果 を 得 るため すべてのサンプルを 同 一 の 条 件 で 反 応 ランしてく ださい( 試 薬 の 種 類 PCR 条 件 サイクルシークエンス 反 応 条 件 Genetic analyzerのモデル) 1 種 類 の PCR 増 幅 産 物 (Amplicon)につき 検 体 (Test Specimen)のフォワー ド リバースに 加 え バリアントの 無 い 野 生 型 のコントロール(Control)のフ ォワード リバースの 少 なくとも 4 つのデータファイルが 必 要 になります 1

2 1. ソフトウェアのスタート Minor Variant Finder Software Quick Reference スタート を 選 択 し All ProgramsApplied BiosystemsMVFMVF または デスクトップ 上 の をダブルクリックします 以 下 の2つのウィンドウが 開 きます Apache Tomcat ウィンドウ Minor Variant Finder ソフトウェアのブラウザウィンドウ 図 1-1:ソフトウェアウィンドウ Apache Tomcat ウィンドウ:バックグラウンドで 開 いたままにしてください 重 要!:このウィンドウは 絶 対 に 閉 じないで 下 さい 閉 じてしまうとソフトウェアが 正 常 に 機 能 しない 場 合 があります Minor Variant Finderソフトウェアのブラウザウィンドウ:デフォルトではGoogle Chrome が 使 用 されますが 前 のページの 表 1-1に 記 載 されているブラウザもご 使 用 い ただけます 注 :ブラウザの 拡 張 機 能 により ソフトウェアが 正 常 に 機 能 しない 場 合 があります そのた めご 使 用 の 際 は シークレットモード シークレットモードでの でのご 使 用 を 推 奨 いたします ソフトウェア 起 動 時 の ブラウザのURLをコピーし シークレットウィンドウを 開 いて URLを 貼 り 付 けてください 図 1-2:Google Chrome シークレットモード 2

3 2. プロジェクトの 作 成 と 解 析 新 たに 解 析 を 行 うためには Project Listより 新 規 プロジェクトを 作 成 します 1 プロジェクトリスト:ダブルクリックで 開 きます 2 プロジェクト 名 アンプリコン 名 検 体 名 で 検 索 ができます 3 プロジェクトを 作 成 します 4 プロジェクトの 詳 細 情 報 を 表 示 します 5 プロジェクトのインポート エクスポート 削 除 が 行 えます 6 ページを 切 り 替 えます 図 2-1:Project List 2.1 プロジェクトの 作 成 1. Create Projectをクリックします 図 2-2:Projectの の 作 成 2. Create New Projectダイアログボックスにプロジェクト 名 を 入 力 します 図 2-3:Create New Projectダイアログボックス 3

4 3. Import Tracesをクリックし サンプルデータを 読 み 込 みます 図 2-4:サンプルデータのインポート 4. 解 析 に 使 用 するサンプルデータ(.ab1ファイル)をすべて 選 択 し 読 み 込 みます 図 2-5:サンプルデータの 読 み 込 み 5. サンプルデータを 読 み 込 むとデータのクオリティサマリーが 表 示 されます データ 表 示 を 切 り 替 えます クオリティーインジケーター: 波 形 データのクオリティーを 表 示 します クオリティーの 設 定 は Action Quality Flag Settings より 変 更 することができます 各 クオリティステータスバーをクリ ックすると 指 定 のクオリティーのデータをソートできます 3 4 波 形 データの 詳 細 情 報 エクスポート 削 除 クオリティーの 設 定 を 変 更 できます 波 形 データの 選 択 時 にチェックします Ctrl や Shift キーを 押 したままチェックすると 複 数 同 時 に 選 択 できます 5 コメントを 記 入 できます 4

5 6. 必 要 に 応 じてサンプルのチェックボックスを 選 択 し Actions 中 のView Detailよりサンプ ルの 波 形 データやRawデータ 等 を 確 認 してください 図 2-6:Tracesスクリーン 図 2-7: 波 形 データの 確 認 5

6 2.2. Referenceの の 設 定 (オプション オプション) 染 色 体 情 報 や 次 世 代 シーケンサ(NGS)のデータをリファレンスとして 指 定 できます リ ファレンスを 設 定 しない 場 合 は ワークフローバーのReferenceのUse control sequence. Skip to the Organize moduleを 選 択 し 次 のステップ(Organize)へ 進 むか ワークフロー バーのOrganizeを 直 接 選 択 してください 図 2-8:Create Referenceの の 選 択 1. ワークフローバーのReferenceを 選 択 します 図 2-9:ワークフローバー 2. Create reference sequence and optionally upload NGS Variants File (vcf)を 選 択 し Create referenceのnameに 名 前 を 記 入 します 図 2-10:Create referenceの の 設 定 6

7 3. Regions of interest Select one:の 項 目 より1つを 選 択 し リファレンスを 設 定 します Assay IDs:Primer Designer Toolで 設 計 したプライマーをご 使 用 の 場 合 プライマーの Assay IDを 記 入 し リファレンスを 指 定 できます( 現 在 日 本 ではPrimer Designer Toolは 対 応 しておりません Primer Designer のリンクはデザインサイトへ 繋 がりません) Enter Chromosome Position: 染 色 体 番 号 を 選 択 し 位 置 情 報 を 記 入 してください ヒト ゲノムの 位 置 情 報 はNCBI GRCh37/hg19が 指 定 されています 図 2-11:Chromosome Positionの の 設 定 Enter Sequence: 配 列 情 報 をSequence 欄 に 直 接 コピーペーストします(A,G,T,C,Nのみ 使 用 できます) 次 のステップで.vcfファイル(NGSデータ)をインポートする 場 合 のみ 染 色 体 番 号 とスタートポジションを 記 入 してください 次 のステップで.vcfファイルを 使 用 しな い 場 合 は 染 色 体 番 号 とスタートポジションの 記 入 は 必 要 ありません 図 2-12:Sequenceの の 設 定 4..vcfファイルを 使 用 する 場 合 は Setup NGS Variants FileよりChoose fileをクリック し.vcfファイルを 選 択 します 図 2-13:vcfファイルの 読 み 込 み 5. リファレンスを 設 定 したらSaveボタンをクリックします 7

8 6. ファイルを 読 み 込 んだらSaveボタンをクリックします セーブしたリファレンス 情 報 は 次 回 以 降 Select reference from projectsより 読 み 出 すこ とができます 図 2-14:リファレンスの 読 み 出 し セーブしたリファレンスの 情 報 はActionsExport Referenceよりエクスポートし 保 存 することができます 図 2-15:リファレンスのエク リファレンスのエクスポート スポート 8

9 2.3. Organizeの の 設 定 Organizeでは 各 PCR 増 幅 産 物 (Amplicon)のコントロール(Control)の 波 形 データの 指 定 やそれに 対 する 検 体 (Test Specimen)の 波 形 データの 分 類 をします 1. ワークフローバーのOrganizeを 選 択 します 図 2-16:Organizeの の 選 択 2. Organizeスクリーンが 表 示 され インポートした 波 形 データを 振 り 分 けます 自 動 で 振 り 分 ける 方 法 と マニュアルで 振 り 分 ける 方 法 があります 1 Amplicon 名 が 表 示 されます リファレンスの 設 定 を 行 っている 場 合 はリファレンスファイルより Amplicon 名 が 表 示 されます 新 たに 作 成 する 場 合 は をクリックします 名 前 をダブルクリ ックすると 名 前 の 変 更 ができます 2 Amplicon の 削 除 追 加 検 索 を 行 います 3 Control を 指 定 するボックス 4 各 Specimen に 振 り 分 けられた 波 形 データが 表 示 されます 5 インポートされた 振 り 分 け 前 の 波 形 データが 表 示 されます 6 Organize スクリーンの 切 り 替 え 検 索 をします 7 自 動 の 振 り 分 け 機 能 を 使 用 します 8 Specimen 名 が 表 示 されます 新 たに 作 成 する 場 合 は をクリックします 名 前 をダブルクリ ックすると 名 前 の 変 更 ができます 図 2-17:Organizeスクリーン 9

10 2.3.1 自 動 でControl Amplicon Specimenの 設 定 を 行 う 場 合 サンプルファイル 名 に 含 まれる 文 字 を 指 定 して 自 動 でControl Amplicon Specimenの 設 定 を 行 うことができます 自 動 で 設 定 を 行 う 場 合 以 下 の 条 件 を 満 たしている 必 要 があります Organizeスクリーンに 設 定 されているAmplicon 名 とサンプルファイル 内 で 指 定 する Amplicon 名 は 一 致 している 必 要 があります(リファレンスの 設 定 をしている 場 合 はあら かじめ 設 定 されているAmpliconの 名 前 を 変 更 してサンプルファイルと 一 致 させてくださ い) サンプルファイル 名 にはフォワード 配 列 リバース 配 列 を 区 別 するための"forward" "fwd" "f"または"reverse" "rev" "r"が 含 まれている 必 要 があります これらの 文 字 は 区 切 り 文 字 (-_$.%)によって 区 別 されている 必 要 があります 1. Organizeをクリックし Organizeダイアログボックスを 開 きます Control と Specimen を 指 定 する 文 字 がサンプル 名 の 同 じ 部 位 にある 時 にチェックします Amplicon Specimen Control を 指 定 するときにクリックします Un-Grouped traces list に 表 示 されている 最 初 のファイル 名 が 表 示 されます Control を 指 定 する 文 字 を 記 入 します 図 2-18:Organizeダイアログボックス 2. Specimenとコントロールを 指 定 する 文 字 が 同 じ 部 位 にある 場 合 は Specimen and Control identifier at the same locationにチェックを 入 れてください 3. Ampliconをクリックし Organizeダイアログボックス 中 に 表 示 されているサンプル 名 からAmpliconを 示 す 文 字 をクリックして 指 定 してください 10 図 2-19:Ampliconの の 指 定

11 4. Specimenをクリックし 同 様 にSpecimenを 示 す 文 字 をクリックし 指 定 してくださ い(Specimen and Control Identifier at the same locationにチェックを 入 れている 場 合 はスキ ップします) 図 2-20:Specimenの の 指 定 5. Controlをクリックし 同 様 にControlを 示 す 文 字 をクリックし 指 定 してください 図 2-21:コントロールの 指 定 6. Organizeをクリックしてください ダイアログボックスが 閉 じControl Amplicon Specimen が 自 動 で 振 り 分 けられます Amplicon 作 成 された Specimen 各 Specimen に 振 り 分 けられた 波 形 データ 図 2-22: 振 り 分 け 後 のOrganizeスクリーン 7. Un-Grouped Tracesに 波 形 データが 残 っている 場 合 は マニュアルで 指 定 をしてくださ い( 次 ページ 参 照 ) 注 : 振 り 分 けを 解 除 する 場 合 は Ampliconを 削 除 してください 11

12 マニュアルでControl Amplicon Specimenの 設 定 を 行 う 場 合 1. Ampliconの をクリックし PCR 増 幅 産 物 名 を 記 入 します 既 にAmplicon 名 が 表 示 さ れている 場 合 は 次 のステップに 進 んでください 図 2-23:Ampliconの の 新 規 作 成 2. Test Specimenの をクリックし 検 体 名 を 記 入 します 同 様 の 操 作 を 繰 り 返 し Ampliconに 対 するSpecimenを 必 要 数 作 成 します 図 2-24:Specimenの の 新 規 作 成 3. Controlとして 使 用 する 波 形 データをUn-Grouped Tracesより 選 択 します フォワード 配 列 を 選 択 し( 青 いハイライトになります) ドラッグしてControlボックスのForwardへド ラッグしてください 同 様 にリバース 配 列 を 選 択 し Reverseにドラッグしてください 図 2-25:Controlの の 指 定 4. それぞれのTest Specimenに 波 形 データを 振 り 分 けます 作 成 したSpecimen 名 をクリッ クします( 青 くハイライトになります) 振 り 分 ける 波 形 データをリバース フォワード 両 方 選 択 します 選 択 したサンプルデータをGrouped Tracesにドラッグします それぞ れのTest Specimenに 対 して 同 様 の 操 作 を 繰 り 返 します 12

13 図 2-26:Test Specimenへの 波 形 データの 振 り 分 け 注 : 振 り 分 けを 解 除 する 場 合 は Ampliconを 削 除 してください 2.4. データの 解 析 サンプルデータは 予 めKB Basecaller v1.4 以 上 のベースコーラーによって 解 析 されている 必 要 があります 解 析 には Controlのフォワード リバースのサンプルデータ Test Specimenのフォワード リバースのサンプルデータについて 15 bp 以 上 のオーバーラップが 必 要 です バリアントの 情 報 は 上 記 4つのデータのオーバーラップしている 場 所 のみレポートされます 1. ワークフローバーのAnalysisを 選 択 し Run Analysisをクリックします 図 2-27:データの 解 析 の 開 始 13

14 3. データの 閲 覧 Minor Variant Finder Software Quick Reference 解 析 が 完 了 するとワークフローバーがResultsに 移 動 し 結 果 が 表 示 されます Resultsスクリーンは5つのデータ 確 認 方 法 があります Overview:シークエンスとバリアント 情 報 を 表 示 します Variant:バリアントのリストを 表 示 します Annotated Variantの 既 知 バリアント 名 をクリックするとNCBIのバリアント 情 報 にリンクします Electropherogram: 波 形 データを 表 示 します Summary:バリアント 情 報 と 解 析 結 果 のエラーや 警 告 情 報 を 表 示 します NGS Confirmation:NGSとの 比 較 データを 表 示 します 図 3-1:Resultsスクリーンバー 3.1. データ 閲 覧 のワークフロー 以 下 の 順 にデータの 確 認 を 行 っていきます 1. Summaryを 選 択 し 解 析 エラーや 警 告 が 生 じているか 確 認 します 図 3-2:Summaryの の 確 認 正 常 に 解 析 されたSpecimenデータ 中 に バリアントが1つもない 場 合 は このSpecimen はTraces with Analysis Errors Warningsに 表 示 されます 2. Overviewを 選 択 し バリアントの 位 置 情 報 を 確 認 します 必 要 に 応 じてOverview 画 面 の 表 示 情 報 の 変 更 をします 14

15 拡 大 縮 小 を 行 います Reference Overview バー: 表 示 されている 配 列 情 報 の 領 域 が 赤 枠 で 表 示 されます リ ファレンスを 設 定 している 場 合 exon やバリアント 情 報 が 表 示 されます サンガーシークエンスで 検 出 されたバリアント NGS で 検 出 されたバリアント サンガーシークエンスと NGS で 検 出 されたバリアント 染 色 体 位 置 情 報 が 表 示 されます コントロールまたはレファレンスの 配 列 情 報 が 表 示 されます NGS とサンガーシークエンスのバリアント 情 報 が 表 示 されます バリアントをクリッ クすると 詳 細 情 報 を 確 認 できます サンプルのシークエンス 領 域 を 表 示 します フォワードがピンク リバースが 青 で 表 示 されます サンプル 配 列 上 のバリアント 情 報 が 表 示 されます サンプル 情 報 を 色 分 けして 表 示 します データを.pdf ファイルや.vcf/.csv ファイルとしてエクスポートできます 図 3-3:Overviewの の 確 認 3. Variantを 選 択 し 検 出 されたバリアントの 詳 細 情 報 を 確 認 します それぞれのサンプル の 列 をダブルクリックすると 波 形 データを 確 認 できます 図 3-4:Variantスクリーンの 確 認 15

16 4. Electropherogramを 選 択 し 波 形 データを 確 認 します 矢 印 キー( )を 押 すと 次 の バリアント 情 報 を 確 認 することができます 必 要 に 応 じてElectropherogram 画 面 の 表 示 情 報 の 変 更 をします 1 バックグラウンドノイズを 最 小 限 にしたサンプル 波 形 データ ピークをダブルクリック すると 塩 基 の 変 更 やコメントを 記 入 できます サンプルデータとコントロールの 波 形 データ View Options: 図 3-6 を 参 照 してください 表 示 させる Amplicon Specimen を 切 り 換 えます バリアントの 採 用 (Accept) 不 採 用 (Reject)を 決 定 します メインピークに 対 するバリアントのピーク 高 の 割 合 を 表 示 します バリアントピーク 高 の 割 合 :100x バリアントピーク 高 /(メインピーク 高 +バリアントピ ーク 高 ) コメントを 記 入 できます 検 証 者 の 名 前 を 記 入 できます データを.pdf ファイルや.vcf/.csv ファイルとしてエクスポートできます リバース 配 列 が 相 補 配 列 の 情 報 へ 変 換 されます すべての 波 形 データの 拡 大 縮 小 ができます 個 別 の 波 形 データの 拡 大 縮 小 ができます 図 3-5:Electropherogramスクリーンの 確 認 16

17 5. 確 認 したいAmpliconとSpecimenを 選 択 します 赤 枠 : 矢 印 キー( )で 表 示 させるバリアント 情 報 を 変 更 できます チェックを 入 れた 情 報 へ 移 動 するように 設 定 でき ます Base Calls: 各 塩 基 の 波 形 の 表 示 / 非 表 示 の 設 定 ができます Show Reference:リファレンスの 配 列 情 報 の 表 示 / 非 表 示 の 設 定 ができます Show Overview: 波 形 データの 概 要 の 表 示 / 表 示 の 設 定 がで きます 図 3-6:View Options 図 3-7:AmpliconとSpecimenを を 選 択 6. ノイズが 最 小 化 された 波 形 データ( 一 番 上 の 波 形 データ)よりバリアントピークの 評 価 と ピーク 高 の 割 合 ( 下 図 赤 枠 )を 確 認 します 図 3-8:バリアントピークの 評 価 バリアントピークのピーク 高 の 割 合 は フォワードとリバースの 波 形 データで 異 なるこ とがあります 極 端 にピーク 高 の 割 合 が 異 なるバリアントは 十 分 に 注 意 し 場 合 によ り 候 補 から 除 外 します 重 要!:サンガーシークエンスに 定 量 性 はありません ピーク 高 の 割 合 とDNA 中 の 変 異 率 は 一 致 するものではありませんのでご 注 意 ください 7. 選 択 したバリアントの 採 用 不 採 用 を 決 定 します 8. キーボードの 矢 印 キー(, )を 押 して 他 のバリアントについて 同 様 に 評 価 します 17

18 注 :Variantスクリーン Electropherogramスクリーンに 見 られるデータの 色 分 けは 評 価 時 のリスクの 高 さを 示 しています 緑 黄 色 赤 の 順 にリスクが 高 くなります 図 3-9:Variantスクリーンのインジケーター 図 3-10:Electropherogramスクリーンのインジケーター ハイリスクの 指 標 が 示 される 原 因 として 以 下 が 考 えられます KB Basecallerによって 決 定 されたQuality Valueの 値 が 低 い KB Basecallerによって 決 定 されたミックスベースがフォワード 側 とリバース 側 で 一 致 しない バリアントピークのSignal-to-noise 比 が 高 い コントロールサンプルとテストサンプルでメインピークの 配 列 情 報 が 異 なる 9. 再 度 Summaryを 確 認 しすべてのバリアントが 検 証 されているか 確 認 します 図 3-11: 検 証 済 みデータ 数 の 確 認 18

19 10. Reference 設 定 時 にNGSデータ(.vcf ファイル)をインポートしている 場 合 は NGS ConfirmationでNGSデータとサンガーシークエンスデータの 比 較 を 行 うことができます バリアントベンダイアグラム:NGS データとサンガーシークエンスのバリアント 数 を 表 示 します 染 色 体 番 号 アノテーションされたバリアント 情 報 バリアント 部 位 の 塩 基 情 報 Electropherogram スクリーンで 評 価 した 検 証 結 果 を 表 示 します 図 3-12:Confirmationスクリーン これまでのResultデータはActionメニューより.pdfファイルまたは.vcf/.csvファイルとしてエ クスポートすることができます 図 3-13:データのエクスポート The information in this guide is subject to change without notice. 19

20 DISCLAIMER TO THE EXTENT ALLOWED BY LAW, LIFE TECHNOLOGIES AND/OR ITS AFFILIATE(S) WILL NOT BE LIABLE FOR SPECIAL, INCIDENTAL, INDIRECT, PUNITIVE, MULTIPLE, OR CONSEQUENTIAL DAMAGES IN CONNECTION WITH OR ARISING FROM THIS DOCUMENT, INCLUDING YOUR USE OF IT. Limited Use Label License No. 358: Research Use Only Notice to Purchaser: The purchase of this product conveys to the purchaser the limited, non-transferable right to use the purchased amount of the product only to perform internal research for the sole benefit of the purchaser. No right to resell this product or any of its components is conveyed expressly, by implication, or by estoppel. This product is for internal research purposes only and is not for use in commercial applications of any kind, including, without limitation, quality control and commercial services such as reporting the results of purchaser's activities for a fee or other form of consideration. For information on obtaining additional rights, please contact or Out Licensing, Life Technologies Corporation, 5791 Van Allen Way, Carlsbad, California Limited Use Label License No. 481: Sequencing or Fragment Analysis Intellectual Property Notice to Purchaser: This product is optimized for use in the DNA sequencing or fragment analysis methods covered by patents owned and/or controlled by Life Technologies Corporation ("LTC"). LTC does not convey any right or license under these patents, whether expressly, by implication, by estoppels, or otherwise, to the purchaser by the purchase of this product to use the DNA sequencing or fragment analysis methods. Notwithstanding the foregoing, a limited license to use the DNA sequencing or fragment analysis methods covered by such patents can be obtained for certain research and development activities (a) through the purchase of certain LTC reagents when such reagents are used in conjunction with an authorized LTC instrument, or (b) directly from LTC. For information on obtaining additional rights to practice the DNA sequencing or fragment analysis methods, please contact or Out Licensing, Life Technologies Corporation, 5791 Van Allen Way, Carlsbad, California Corporate entity Life Technologies Carlsbad, CA USA Toll Free in USA TRADEMARKS All trademarks are the property of Thermo Fisher Scientific and its subsidiaries unless otherwise specified. Apache and Tomcat are trademarks of the Apache Software Foundation. Google and Chrome are trademarks of Google Inc. Microsoft and Internet Explorer are trademarks of Microsoft Corporation. Mozilla and Firefox are trademarks of the Mozilla Foundation Thermo Fisher Scientific Inc. All rights reserved. 20

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