目 的 腰 痛 は 日 常 生 活 の 訴 えの 中 で 最 も 多 い 症 状 であり 椎 間 板 (IVD) 変 性 は 腰 痛 の 原 因 の 1 つ である IVD 変 性 の 発 生 に 関 連 する 因 子 には 年 齢 性 別 職 業 喫 煙 などが 挙 げられ 腰 痛 とたばこの 関

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1 ラット 椎 間 板 構 成 細 胞 の 遺 伝 子 発 現 プロファイル 解 析 : 新 たな 構 成 細 胞 marker 遺 伝 子 と 受 動 喫 煙 による 発 現 変 動 遺 伝 子 ( 要 約 ) 日 本 大 学 大 学 院 医 学 研 究 科 博 士 課 程 外 科 系 整 形 外 科 学 専 攻 沼 口 俊 平 修 了 年 2015 年 指 導 教 員 德 橋 泰 明

2 目 的 腰 痛 は 日 常 生 活 の 訴 えの 中 で 最 も 多 い 症 状 であり 椎 間 板 (IVD) 変 性 は 腰 痛 の 原 因 の 1 つ である IVD 変 性 の 発 生 に 関 連 する 因 子 には 年 齢 性 別 職 業 喫 煙 などが 挙 げられ 腰 痛 とたばこの 関 連 については 報 告 が 多 い 腰 痛 患 者 の 70%が 喫 煙 者 であり 1 喫 煙 の 頻 度 や 喫 煙 量 喫 煙 期 間 と 腰 痛 症 発 生 率 とが 相 関 する 2 しかしながら 一 方 で 腰 痛 と 喫 煙 との 関 連 がないという 報 告 も 多 く 認 められる 3 このように 喫 煙 とIVD 変 性 については 未 だ 因 果 関 係 が 明 らかになっていない 我 々は 以 前 より 受 動 喫 煙 ラットを 作 製 し IVD 変 性 について 研 究 を 行 ってきた 最 近 受 動 喫 煙 ラッ トのIVDについて 詳 細 な 組 織 学 的 検 討 を 行 ったところ 受 動 喫 煙 により 軟 骨 終 板 の 軟 骨 細 胞 にアポトーシスが 起 こっていることを 見 出 した また 線 維 輪 (AF, annulus fibrosus)と 軟 骨 終 板 (CEP, cartilage endplate)の 細 胞 外 基 質 が 低 下 し 髄 核 (NP, nucleus pulposus) 内 では Ⅱ 型 コラーゲンやプロテオグリカンの 減 少 により 髄 核 構 築 が 破 壊 することがわかった ( 中 橋 ら 論 文 投 稿 中 ) そこで 我 々は 受 動 喫 煙 がラット 椎 間 板 に 及 ぼす 変 化 を 詳 細 に 解 析 す るため NPとAFとCEPとを 別 々に 採 取 し 各 々で 起 こる 変 化 を 詳 細 に 調 べることにした 本 研 究 ではAF/CEP 細 胞 とNP 細 胞 とを 個 別 に 解 析 し より 組 織 間 の 違 いを 明 確 化 する 目 的 で 行 った マ イクロアレイを 用 いた 網 羅 的 遺 伝 子 発 現 解 析 から AF/CEP 細 胞 では NP 細 胞 にはない 特 徴 的 な 遺 伝 子 発 現 があることを 見 いだした さらに 受 動 喫 煙 がもたらす 発 現 変 化 遺 伝 子 についても 新 た な 知 見 を 見 いだした 材 料 と 方 法 生 後 8 週 のオス Sprague-Dawley ラットに 8 週 間 受 動 喫 煙 させた 群 6 頭 と 非 喫 煙 コント ロール 群 6 頭 から 腰 椎 を 採 取 した 各 ラット 腰 椎 5 椎 間 から IVD を 切 離 し 線 維 輪 + 軟 骨 終 板 (AF/CEP)と 髄 核 (NP)に 分 け 採 取 した 各 々より total RNA 抽 出 後 ラット 遺 伝 子 のマイクロアレイを 用 いて 網 羅 的 遺 伝 子 発 現 解 析 を 行 った その 後 リアルタイム PCR を 行 い mrna 発 現 量 変 化 の 検 証 を 行 った 遺 伝 子 の 日 内 変 動 解 析 実 験 では 生 後 8 週 のオス Sprague-Dawley ラットを 8 週 間 受 動 喫 煙 させた 群 12 頭 と 非 喫 煙 群 15 頭 を 作 製 した 受 動 喫 煙 最 終 日 後 両 群 ともに 約 6 時 間 おきに 解 剖 を 5 回 行 い 上 述 の 様 に RNA を 抽 出 し mrna 発 現 定 量 を 行 った

3 結 果 と 考 察 本 研 究 で 我 々はラット 椎 間 板 の 包 括 的 mrna 発 現 解 析 から 次 の 2 点 を 新 たに 見 いだした 第 一 点 は AF/CEP と NP について 新 しい 遺 伝 子 発 現 marker とその 特 徴 を 見 出 した 第 二 点 は 椎 間 板 内 組 織 の 概 日 リズムの 発 見 と 受 動 喫 煙 によるその 変 化 である 今 までの 椎 間 板 構 成 細 胞 の 報 告 は AF と NP との 比 較 であった 4; 5 我 々は 今 回 AF に CEP を 加 えて NP と 比 較 している 新 たな 比 較 解 析 AF/CEP と NP 間 の 発 現 遺 伝 子 比 較 から 10 倍 以 上 発 現 量 が 異 なる 遺 伝 子 が 112 個 見 つかった そのうち 96 個 が AF/CEP 細 胞 で 高 発 現 を 示 した それらには 細 胞 外 マトリックス 関 連 遺 伝 子 の 他 炎 症 免 疫 関 連 遺 伝 子 プロテ アーゼ プロテアーゼインヒビター 細 胞 増 殖 関 連 遺 伝 子 など 多 数 の 生 理 機 能 分 子 が 新 た に 見 いだされた 従 来 の 報 告 にない 数 多 くの AF/CEP マーカーを 見 つけた 理 由 は 多 く が CEP に 由 来 するためと 考 えられる さらに AF/CEP では 多 様 なプロテアーゼの 産 生 とそれ らの 制 御 因 子 の 産 生 が 同 時 に 観 察 され 細 胞 外 基 質 のコントロールなど AF/CEP 細 胞 が 活 発 に 行 っていると 考 えられた 一 方 NP 細 胞 では 新 規 に Mir490 などの noncoding RNA の 高 発 現 や 神 経 細 胞 由 来 の 遺 伝 子 発 現 が 特 徴 的 であった また desmosome のような 細 胞 間 接 着 に 関 わる 遺 伝 子 発 現 も 特 徴 的 に 見 出 された 最 近 Mir490 については cyclin D1 や c-fos の 遺 伝 子 発 現 を 抑 制 し 癌 細 胞 増 殖 抑 制 に 関 連 すると 報 告 がある 6; 7 ヒト 椎 間 板 変 性 では 肥 満 ホル モンであるレプチンが NP 細 胞 に 作 用 すると cyclind1 の 誘 導 をとおして 起 こる NP 細 胞 の 増 殖 が 変 性 の 機 序 とも 言 われている 8 ラット NP 細 胞 でも 同 様 のことが 起 こることから 9 Mir490 は NP 細 胞 の 異 常 増 殖 を 抑 制 し 恒 常 性 維 持 に 働 いているとも 考 えられる そして 受 動 喫 煙 でその 発 現 が 低 下 することから 椎 間 板 変 性 に 寄 与 する 可 能 性 がある このように 新 規 marker 遺 伝 子 を 数 多 く 見 出 せたことは ラット 27,342 全 ゲノムを 対 象 としたマイクロアレイ 解 析 を 実 施 で きたためと 考 える 第 二 の 注 目 点 は 椎 間 板 における 概 日 リズム 関 連 遺 伝 子 の 発 現 である 受 動 喫 煙 によって AF/CEP と NP 共 に nuclear receptor subfamily 1, group D, member 1 (Nr1d1) aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like (Arntl) neuronal PAS domain protein 2 (Npas2) D site of albumin promoter (albumin D-box) binding protein (Dbp)などの 時 計 遺 伝

4 子 や 時 計 関 連 遺 伝 子 が 複 数 発 現 変 化 することがわかった それらの 発 現 日 内 変 動 を 調 べたと ころ 時 計 遺 伝 子 や 時 計 関 連 遺 伝 子 は 椎 間 板 組 織 細 胞 においても 日 内 変 動 を 示 し かつ 受 動 喫 煙 によりその 多 くは-6-9 時 間 の 位 相 変 化 が 起 きた NP では 日 内 変 動 が 消 失 する 遺 伝 子 (Arntl Dbp)も 認 められた ラット 肺 の 時 計 遺 伝 子 はすでに 日 内 変 動 することが 示 されてい るが 10 今 回 AF/CEP 細 胞 や NP 細 胞 に 時 計 遺 伝 子 の 日 内 変 動 発 現 を 見 出 したのは 我 々 が 初 めてである また タバコの 煙 によりラット 肺 でも 時 計 遺 伝 子 や 時 計 関 連 遺 伝 子 の 発 現 が 変 化 することも 近 年 報 告 され 我 々のラット 肺 や 椎 間 板 と 同 じ 位 相 変 化 を 示 した 11 マ ウス 肺 でも 同 様 の 報 告 があり 12; 13 遺 伝 子 によっては 位 相 変 化 は 見 られず 振 幅 の 低 下 が 見 られるものもあった 13 我 々のラット NP 細 胞 でも 受 動 喫 煙 によって 日 内 変 動 の 消 失 が 見 られる 遺 伝 子 もあり 受 動 喫 煙 による 影 響 は 遺 伝 子 や 組 織 に 依 存 すると 思 われる 受 動 喫 煙 がどのようなメカニズムで 概 日 リズムの 位 相 変 化 を 起 こすかは まだよくわかっていない 受 動 喫 煙 は 椎 間 板 clock の 日 内 変 動 に 影 響 し 椎 間 板 変 性 への 易 罹 患 性 に 関 与 するかもし れない 実 際 受 動 喫 煙 で 椎 間 板 変 性 につながる 遺 伝 子 発 現 変 化 は,プロテアーゼやプロテ アーゼインヒビターによく 見 られた AF/CEP では Mmp3 Ctsk Mmp13 が 亢 進 する 一 方 で A2m Serping1 も 亢 進 が 見 られ 組 織 の 恒 常 性 維 持 にむけて 相 反 する 反 応 が 同 時 に 起 こっていると 考 えられた 一 方 NP では 発 現 低 下 する 遺 伝 子 が 多 く 機 能 低 下 が 示 唆 された ラット 椎 間 板 組 織 mrna 発 現 の 包 括 的 解 析 から 新 たな NP marker 特 に CEP marker を 見 いだし 各 細 胞 の 新 たな 特 徴 を 提 示 した またこれらの 細 胞 には clock が 存 在 し 受 動 喫 煙 によって 日 内 変 動 の 位 相 変 化 を 起 こすことが 明 らかとなった clock の 日 内 変 動 位 相 変 化 は 椎 間 板 細 胞 の 機 能 維 持 や 変 性 に 関 連 する 可 能 性 があり 今 後 椎 間 板 変 性 の 予 防 や 予 後 改 善 に 向 けて 興 味 深 い 示 唆 を 与 える 日 内 変 動 の 位 相 変 化 は 夜 間 勤 務 や 時 差 ぼけにみら れる 体 調 不 良 と 深 い 関 係 がある 本 研 究 は 椎 間 板 変 性 や 腰 痛 に 限 らず 広 く 日 内 変 動 の 位 相 変 化 と 疾 病 の 易 罹 患 性 受 動 喫 煙 と 疾 病 の 易 罹 患 性 について クロストークする 経 路 の 可 能 性 を 示 唆 した

5 引 用 文 献 1. Kostova V, Koleva M Back disorders (low back pain, cervicobrachial and lumbosacral radicular syndromes) and some related risk factors. J Neurol Sci 192: Frymoyer JW, Pope MH, Costanza MC, et al Epidemiologic studies of low-back pain. Spine (Phila Pa 1976) 5: Goldberg MS, Scott SC, Mayo NE A review of the association between cigarette smoking and the development of nonspecific back pain and related outcomes. Spine (Phila Pa 1976) 25: Lee CR, Sakai D, Nakai T, et al A phenotypic comparison of intervertebral disc and articular cartilage cells in the rat. Eur Spine J : 16: Minogue BM, Richardson SM, Zeef LA, et al Transcriptional profiling of bovine intervertebral disc cells: implications for identification of normal and degenerate human intervertebral disc cell phenotypes. Arthritis Res Ther 12:R Gu H, Yang T, Fu S, et al MicroRNA-490-3p inhibits proliferation of A549 lung cancer cells by targeting CCND1. Biochem Biophys Res Commun 444: Li S, Xu X, Hu Z, et al MicroRNA-490-5p inhibits proliferation of bladder cancer by targeting c-fos. Biochem Biophys Res Commun 441: Li Z, Shen J, Wu WK, et al Leptin induces cyclin D1 expression and proliferation of human nucleus pulposus cells via JAK/STAT, PI3K/Akt and MEK/ERK pathways. PLoS One 7:e Zhao CQ, Liu D, Li H, et al Expression of leptin and its functional receptor on disc cells: contribution to cell proliferation. Spine (Phila Pa 1976) 33:E Sukumaran S, Jusko WJ, Dubois DC, et al Light-dark oscillations in the lung transcriptome: implications for lung homeostasis, repair, metabolism, disease, and drug action. J Appl Physiol 110: Gebel S, Gerstmayer B, Kuhl P, et al The kinetics of transcriptomic changes induced by cigarette smoke in rat lungs reveals a specific program of defense, inflammation, and circadian clock gene expression. Toxicol Sci 93: Vasu VT, Cross CE, Gohil K Nr1d1, an important circadian pathway regulatory gene, is suppressed by cigarette smoke in murine lungs. Integr Cancer Ther 8: Hwang JW, Sundar IK, Yao H, et al Circadian clock function is disrupted by environmental tobacco/cigarette smoke, leading to lung inflammation and injury via a SIRT1-BMAL1 pathway. Faseb J 28:

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