樫本、芝野

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1 論 文 審 査 の 要 旨 お よ び 担 当 者 学 位 申 請 者 大 野 秀 樹 ( 大 野 犬 猫 病 院 ) 学 位 論 文 題 目 イ ヌ の 前 十 字 靭 帯 断 裂 に お け る A n d r o g e n の 関 与 に 関 す る 研 究 担 当 者 主 査 北 里 大 学 教 授 副 査 北 里 大 学 教 授 副 査 北 里 大 学 准 教 授 岡 野 昇 三 渡 辺 大 作 吉 岡 一 機 副 査 日 本 獣 医 生 命 科 学 大 学 教 授 原 康 論 文 審 査 の 要 旨 膝 関 節 は 動 物 の 身 体 運 動 に 極 め て 重 要 な 関 節 で あ り 前 後 膝 十 字 靭 帯 外 内 側 側 副 靭 帯 半 月 大 腿 靭 帯 な ど 複 数 の 靱 帯 で 補 強 さ れ 複 雑 な 構 造 を 有 し て い る 近 年 イ ヌ ネ コ の 高 齢 化 に 伴 い 関 節 疾 患 が 急 増 し て い る が 特 に 前 十 字 靭 帯 (Anterior cruciate ligament; 以 下 ACL) 断 裂 は 膝 関 節 疾 患 の 中 で も 発 生 が 多 く 跛 行 を 主 訴 と す る イ ヌ 患 畜 の 約 20% に 発 生 し て い る 従 っ て ACL 断 裂 は 小 動 物 臨 床 上 最 も 重 要 な 整 形 外 科 疾 患 で あ る ACL 断 裂 の 発 生 要 因 と し て 遺 伝 学 的 要 因 免 疫 学 的 要 因 大 腿 骨 顆 間 窩 狭 窄 な ど 形 態 学 的 要 因 運 動 力 学 的 要 因 や 内 分 泌 因 子 肥 満 な ど の リ ス ク フ ァ ク タ ー の 関 連 が 考 え ら れ て い る ヒ ト で は 男 性 の み な ら ず 女 性 の ACL からも Androgen Receptor ( 以 下 AR)が 発 現 し て い る こ と か ら Androgen が ACL の 成 長 と 発 達 に 重 要 な 役 割 を 果 た し ま た ACL 断 裂 に 深 く 関 与 し て い る と の 報 告 が 多 数 あ る イ ヌ に お い て も 性 や 年 齢 に 1

2 よって ACL 断 裂 の 発 生 頻 度 が 異 なり 雄 より 雌 の 発 症 率 が 高 く また 未 避 妊 雌 お よ び 未 去 勢 雄 よ り も 避 妊 雌 お よ び 去 勢 雄 の 方 が 発 症 率 が 高 い と い う 疫 学 的 な 相 違 が 指 摘 さ れ て い る し か し な が ら そ の 詳 細 は 十 分 に 解 明 さ れ て い な い そ こ で 著 者 は イ ヌ ACL 断 裂 における 性 ホルモン 特 に Androgen の 関 与 に つ い て 解 明 す べ く 組 織 学 的 見 地 か ら 本 研 究 を 行 っ た 第 1 章 で は 基 礎 的 な 研 究 と し て 正 常 な イ ヌ の ACL における AR の 発 現 に つ い て 観 察 し 第 2 章 では 5α-dihydrotestosterone (DHT)が 培 養 イヌ ACL 線 維 芽 細 胞 に 及 ぼ す 影 響 に つ い て そ し て 第 3 章 で は 断 裂 し た イ ヌ ACL におけ る AR および procollagen type 1 の 発 現 状 況 に つ い て 観 察 し た 第 1 章 正 常 な イ ヌ 前 十 字 靱 帯 の 組 織 構 造 と Androgen Receptor の 発 現 について ACL が Androgen 応 答 組 織 で あ る か 否 か 雌 雄 間 並 び に 若 齢 高 齢 間 における AR の 発 現 程 度 に ついて 1~ 2 歳 の 若 齢 ビ ー グ ル 犬 21 匹 ( 雌 12 雄 9 匹 )および 7~ 11 歳 の 高 齢 雑 種 犬 5 匹 ( 雄 3 雌 2 匹 )の 計 26 匹 から 得 られた ACL 組 織 を 形 態 学 的 および 免 疫 組 織 化 学 的 に 観 察 し また 血 清 総 Testosterone 濃 度 の 測 定 を 行 っ た 血 清 総 Testosterone 濃 度 は 雌 よ り も 雄 が 有 意 な 高 値 を 示 し (p<0.01) 高 齢 雄 よ り も 若 齢 雄 で 高 か っ た ACL は 密 な 線 維 性 結 合 組 織 で あ り 粗 大 な 膠 原 線 維 の 束 か ら 構 成 さ れ て い た 若 齢 雄 の ACL 組 織 内 には 多 くの 小 血 管 が 分 布 し て い た が 若 齢 雌 で は そ れ は 少 な か っ た 高 齢 個 体 で は 雌 雄 共 に ACL 内 の 血 管 分 布 は さ ら に 減 少 し て い た 雌 雄 全 て の ACL に お い て 組 織 を 構 成 す る 線 維 細 胞 線 維 芽 細 胞 滑 膜 細 胞 血 管 内 皮 細 胞 の そ れ ぞ れ の 核 が 抗 AR 抗 体 に 陽 性 を 示 していた 若 齢 雄 の AR 発 現 が 2

3 最 も 強 く 高 齢 雄 で は そ の 発 現 は 減 弱 し て い た 一 方, 雌 で の 発 現 は 年 齢 に よ る 発 現 の 程 度 差 は 認 め ら れ な か っ た が 雄 よ り も 明 ら か に 弱 か っ た 以 上 の 結 果 よ り イ ヌ ACL は Androgen の 標 的 組 織 で あ る と 解 さ れ また AR 発 現 と 血 管 分 布 の 程 度 差 が ACL 断 裂 の 疫 学 的 背 景 ( 頻 度 性 差 ) に 相 関 し て い る こ と か ら Androgen が ACL 組 織 内 の 血 流 量 の 調 整 や 靱 帯 の 強 度 に 影 響 を 及 ぼ し て い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た (Ohno et al., Okajimas Folia Anat. Jpn. 90: [2013]) 第 2 章 イ ヌ 前 十 字 靭 帯 培 養 線 維 芽 細 胞 に お け る Androgen の 影 響 につ いて イヌ ACL における Androgen の 関 与 が 明 ら か に さ れ た こ と か ら さ ら に DHT が ACL 線 維 芽 細 胞 に 及 ぼ す 影 響 に つ い て 2 匹 の 正 常 ビ ー グ ル 犬 ( 雄 5 ヶ 月 齢 )の ACL か ら 得 ら れ た 線 維 芽 細 胞 を 1~ 10-3μM 各 濃 度 の DHT を 添 加 し た 基 礎 培 地 な い し 非 添 加 の 基 礎 培 地 で 培 養 し AR 発 現 細 胞 増 殖 活 性 お よ び コ ラ ー ゲ ン 合 成 に つ い て 比 較 観 察 し た DHT 添 加 群 の 培 養 線 維 芽 細 胞 は 添 加 48 時 間 で 核 は 大 型 化 し 大 き く 明 瞭 な 核 小 体 を 形 成 し て い た 抗 AR 抗 体 陽 性 細 胞 の 数 は DHT 添 加 群 で い ず れ の 培 養 時 点 で も 非 添 加 群 よ り も 多 か っ た 増 殖 細 胞 核 抗 原 (PCNA)の 陽 性 率 は 24 時 間 後 の DHT 添 加 群 全 て が 非 添 加 群 よ り も 優 位 に 高 値 を 示 し(p<0.05) 時 間 後 で も 高 い 傾 向 を 示 し て い た 抗 procollagen type 1 陽 性 細 胞 の 数 は 24 時 間 後 の DHT lμm 添 加 群 にお い て 対 照 群 よ り も 発 現 の 程 度 が 強 く 添 加 後 48 時 間 で は 用 量 依 存 的 に そ の 程 度 を 増 し て い た さ ら に 細 胞 増 殖 測 定 (MTS 法 )か ら 全 て の 時 点 に お い て DHT 添 加 群 は 非 添 加 群 よ り も 高 い 増 殖 能 を 示 す 傾 向 に あ り 3

4 (p<0.05) 特 に 48 時 間 後 で は 添 加 用 量 依 存 的 に 反 応 が 増 大 す る 傾 向 を 示 していた 以 上 DHT が ACL 線 維 芽 細 胞 に 作 用 し て AR 発 現 と 細 胞 増 殖 活 性 を 亢 進 す る こ と が 明 ら か に さ れ DHT がコラーゲン 合 成 に 関 与 しているこ と す な わ ち, 性 ホ ル モ ン が イ ヌ 生 体 ACL の 強 度 保 持 に 関 与 し ACL 断 裂 発 生 頻 度 の 性 差 に 影 響 を 及 ぼ し て い る こ と が 示 唆 さ れ た (Ohno et al., Okajimas Folia Anat. Jpn. 89:35-38[2012]) ま た DHT 添 加 に よ る ACL 線 維 芽 細 胞 の DNA 合 成 と 細 胞 分 裂 は DHT 添 加 後 24 時 間 か ら 48 時 間 の 間 に 行 わ れ る こ と が 明 ら か に さ れ た 第 3 章 断 裂 し た イ ヌ の 前 十 字 靭 帯 に お け る Androgen Receptor の 発 現 について 第 1 章 および 2 章 に お い て イ ヌ ACL が Androgen の 標 的 組 織 で あ り Androgen の 動 態 が ACL 断 裂 に 深 く 関 与 す る こ と が 示 唆 さ れ た こ と か ら さ ら に 断 裂 し た イ ヌ ACL における AR の 発 現 状 況 について 非 断 裂 例 と 比 較 観 察 した ACL 断 裂 16 例 ( 雄 6 雌 10 匹 )と 健 康 な ビ ー グ ル 犬 9 例 ( 雄 5 雌 4 匹 )に つ い て 血 清 総 Testosterone 濃 度 を 測 定 し 採 取 し た ACL 組 織 に つ い て 病 理 組 織 学 的 観 察 と AR Procollagen type 1 の 分 布 状 況 PCNA を 用 いた 細 胞 増 殖 活 性 を 観 察 した 雌 の 血 清 総 Testosterone 濃 度 は 正 常 例 断 裂 例 と も に 雄 よ り も 低 く 測 定 可 能 下 限 値 を 下 回 る 低 値 を 示 していた 雄 断 裂 例 の 血 清 総 Testosterone 濃 度 は 正 常 例 雄 に 比 べ て 低 い 傾 向 を 示 し て い た 断 裂 例 の ACL には 増 殖 初 期 増 殖 期 および 再 生 期 へと 推 移 する 各 ステージの 組 織 変 化 が 観 察 さ れ た AR の 発 現 は Collagen 線 維 束 や 間 質 の 結 合 組 織 に 存 在 す る 線 維 芽 細 胞 滑 膜 細 胞 や 間 質 の 血 管 内 皮 細 胞 の 核 に 認 め ら れ た 4

5 AR の 発 現 程 度 は 血 清 総 Testosterone 濃 度 と 正 の 相 関 を 示 し 正 常 例 断 裂 例 と も に 雄 よ り も 雌 で 発 現 が 弱 か っ た ま た 断 裂 例 で は AR 発 現 は さ ら に 弱 く 特 に 去 勢 雄 避 妊 雌 の 断 裂 例 で は 著 し く 弱 い 傾 向 に あ っ た Procollagen type 1 の 発 現 も 同 様 で 正 常 例 断 裂 例 ともに 雄 より も 雌 で 発 現 が 弱 く 正 常 例 と 比 較 す る と 断 裂 例 で よ り 弱 い 傾 向 が 認 め ら れた PCNA 陽 性 細 胞 も 正 常 例 断 裂 例 と も に 雄 よ り 雌 で 少 な く 正 常 例 よ り も 断 裂 例 で 少 な い 傾 向 を 示 し て い た こ れ ら 結 果 か ら 血 清 総 Testosterone 濃 度 が 低 く か つ 靱 帯 に お い て AR 発 現 の 低 い 個 体 は ACL 線 維 芽 細 胞 の 増 殖 活 性 が 低 く Procollagen 合 成 が 低 下 し ACL の 構 造 的 強 度 が 低 下 し て い る こ と が 示 さ れ 疫 学 的 にみた ACL 断 裂 の 年 齢 差 雌 雄 差 と の 関 連 性 が 明 ら か に さ れ た (Ohno et al., Philipp. J. Vet. Med. 51: [2014]) 以 上 イ ヌ の 正 常 お よ び 断 裂 ACL における AR の 発 現 に 関 する 一 連 の 観 察 より ACL は Androgen 標 的 組 織 で あ り Androgen が ACL 構 成 細 胞 に 作 用 し て 細 胞 増 殖 を 活 性 化 し コ ラ ー ゲ ン 産 生 を 促 進 さ せ る こ と で ACL の 構 造 的 な 強 度 保 持 に 関 与 していること AR の 発 現 強 度 は 雄 よ り も 雌 で 弱 く 年 齢 的 に は 雌 雄 共 に 高 齢 で 低 下 し て お り こ れ ら が ACL 断 裂 の 有 病 率 に 大 き く 影 響 を 及 ぼ し て い る こ と が 裏 付 け ら れ た 本 研 究 は 前 十 字 靱 帯 断 裂 の 臨 床 と 基 礎 を 結 ぶ 比 較 医 学 的 デ ー タ を 提 示 し た も の で そ の 成 果 は 今 後 の 伴 侶 動 物 医 療, 特 に 高 齢 動 物 に お け る 運 動 器 疾 患 の 獣 医 療 に 貢 献 す る 価 値 あ る も の と 確 信 す る 著 者 は 膝 関 節 疾 患 に 興 味 を 抱 い て 以 来 獣 医 診 療 に 従 事 し な が ら 本 研 究 を 遂 行 し た そ の た ゆ ま ぬ 熱 意 と 探 究 心 な ら び に 得 ら れ た 成 果 よ り 著 者 は 博 士 ( 獣 医 学 )の 学 位 を 受 け る に 相 応 し い 判 断 し 審 査 委 員 一 同 は 合 格 と 判 定 し た 5

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