イネ開花遺伝子Hd3aの機能解析

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1 Hd3a 1

2 Hd3a Hd3a:GFP Hd3a:GFP Hd3a Hd3a

3

4 Corbesier and Coupland, 2005; Corbesier and Coupland, 2006; Imaizumi and Kay, 2006; Simpson and Dean, 2002; Zeevaart, Garner Allard Maryland Mammoth Maryland Mammoth Maryland Mammoth Maryland Mammoth 4

5 Maryland Mammoth Maryland Mammoth 1934 Knott 1936 Chailakhyan Knott 5

6 1985 Zeevaart Maryland Mammoth Nicotiana sylvestris Maryland Mammoth Maryland Mammoth 1968 King 1973 King Zeevaart 6

7 Corbesier and Coupland, 2005; Corbesier and Coupland, 2006; Zeevaart, 2006,, 1998 GIGANTEA GI CONSTANS CO FLOWERING LOCUS T FT CO FT GI Fowler et al., 1999; Park et al., 1999 CO N B-box Zn finger C 7

8 CCT CO Putterill et al., 1995; Robson et al., 2001 CO Takada and Goto, 2003; An et al., 2004 CO co CO CO An et al., 2004 FT CO FT CO CO FT Kobayashi et al., HAP DNA CO CCT FT Wenkel et al., 2006 FT 20kDa PEBP Kardailsky et al., 1999; Kobayashi et al., 1999; Suarez-Lopez et al., 2001; Yanovsky and Kay, 2002 FT CO 8

9 FT Kardailsky et al., 1999; Kobayashi et al., 1999 FT Kardailsky et al., 1999; Kobayashi et al., 1999 FT Takada and Goto, 2003 FT 2005 FT FT FD Abe et al., 2005; Wigge et al., 2005 FD 1991 fd Koornneef et al., 1991 FD bzip BiFC 9

10 analysis FT FD AP1 SOC1 Abe et al., 2005; Wigge et al., 2005; Searle et al., 2006 FD FT FT FD FT FT FT FT FT FT 2006 Brassica napus Proteome Brassica napus FT Giavalisco et al., 2006 FT 10

11 FT mran FT SFT ft 35S FT Lifschitz et al., 2006 FT mrna FT mrna FT FT Corbesier and Coupland, 2005; Corbesier and Coupland, 2006; Zeevaart, 2006 FT FT mrna FT QTL quantitative trait loci ; 11

12 Hd1 Yano et al., 2000 Hd1 CO 2003 QTL Hd3a Kojima et al., 2002 Hd3a Hayama et al., 2003; Kojima et al., 2002 FT 2B Hd3a FT Hd3a Kojima et al., 2002 CO FT CO Hd1 FT Hd3a Hayama et al., 2003; Yano et al., A 12

13 Hd3a Ishikawa et al., 2005 Hd3a Hd3a Hd3a Hd3a FT FT FT FT Hd3a Hd3a Hd3a 13

14 1 1-1 Oryza sativa L. 8 N-8 Hd3a Hd3a ::Hd3a:GFP Hd3a::GUS rolc rolc ::Hd3a:GFP rolc::gfp rolc::kaede RPP16 RPP16 ::Hd3a:GFP RPP16::GFP RPP16::Kaede Hiei et al., % to 700 nm, 100 µmol m 2 s 1 T 0 SD 1 Ishikawa Ishikawa et al., 14

15 Oc 100 ml 20 ml R2S Innova2300 ; R2S RNA RNA GTC 2002 RNeasy Plant Mini Kit QIAGEN RNAeasy TaKaRa 2ml RNA RNA cdna DNA DNaseI Amplification Grade Invitorogen DNA 2-2. RT-PCR DNaseI RNA 1 µg Super Script TM II RNase H Reverse Transcriptase Invitrogen Oligo dt dt21 15

16 2-3. cdna PCR PCR PCR Ubq, Hd3a, GFP TA 100 pg / µl PCR PCR 3 PCR ABI PRISM 7700 Applied Biosystem Japan PCR SYBR Green Mster Mix Applied Biosystem Japan cdna 2-5. Oc 16

17 Hd3a::GUS Moritoh et al ULTRACUT UCT Laica 10 µm Moritoh et al., µm

18 GFP Kaede LSM510META x10 x20 x40 x63w 488 nm 505 nm-550 nm mg 1 ml TE PMSF 2.5 µl 5000 rpm 4 15 SDS-PAGE PVDF GFP Roche 5000 ECLPlus GE LAS1000 FUJI 18

19 1. Hd3a Hd3a 10 Kojima et al., 2002 Ishikawa et al., 2005 Hd3a ZT0 ZT0-4 5A RNA Hd3a mrna RT-PCR Hd3a mrna 5B, C Hd3a mrna FT mrna Wigge et al., 2005 Hd3a FT FT Hd3a 19

20 Hd3a Hd3a Ishikawa et al., 2005; Kojima et al., 2002 Hd3a Hd3a mrna 4 Hd3a mrna 5 2. Hd3a::GUS Hd3a Hd3a Oc Hd3a FT Hd1 CO Kojima et al., 2002; Yano et al., 2000 OsGI Hd1 mrna Hd3a mrna Hayama et al., 2003 GI Fowler et al., 1999 GI 20

21 CO mrna OsGI Hd1 Hd1 Hd3a Hd1 Hd1 Yano et al., 2000 Hd1 Hd3a Hd1 Hd3a Hd3a GUS Hd3a::GUS-t 35S GUS 35S::GUS Ubq Hd1 cdna Ubq::Hd1 Bar. Ubq::Bar Oc Ubq::Luc 35S::GUS Ubq::Hd1 Ubq::Bar GUS 21

22 6A Hd3a::GUS-t Ubq::Bar Ubq::Hd1 GUS 1/3 6B Hd1 cdna Hd3a 35S Hd1 Hd3a OsGI Hd3a mrna Hd1 Hd3a Hayama et al., Hd3a Hd3a GUS Hd3a::GUS Hd3a::GUS GUS Hd3a Hd3a mrna GUS Hd3a 22

23 GUS Hd3a mrna 7, 8 Hd3a mrna Hd3a::GUS GUS Ishikawa et al., 2005 Hd3a::GUS data not shown X-Gluc GUS 9 FT Takada and Goto, 2003 Hd3a mrna GUS 9 FT Takada and Goto, 2003 Hd3a mrna 5B, C GUS GUS Hd3a 23

24 4. Hd3a:GFP 4-1 Hd3a::Hd3a:GFP Hd3a Hd3a C GFP Hd3a Hd3a::Hd3a:GFP 2003 Hd3a N GFP Hd3a:GFP, 2003 GUS Hd3a:GFP Hd3a Hd3a:GFP Hd3a mrna Hd3a:GFP Hd3a mrna 10 WT S::Hd3a Kojima et al., S Hd3a Hd3a C GFP 24

25 FT Hd3a Kardailsky et al., 1999; Kobayashi et al., 1999; Kojima et al., 2002 SFT Lifschitz and Eshed, 2006; Lifschitz et al., 2006 FT Teper-Bamnolker and Samach, A FT terminal flower Kardailsky et al., 1999; Kobayashi et al., 1999 Hd3a:GFP Hd3a:GFP Hd3a:GFP Hd3a:GFP 12 Hd3a:GFP 12A-D Hd3a:GFP 25

26 Hd3a:GFP Hd3a:GFP Hd3a:GFP 12G, H Hd3a:GFP Hd3a 4-2 Hd3a Hd3a::GUS rolc RPP16 Hd3a:GFP GFP Kaede rolc Guivarc'H et al., 1996; An et al., 2004 RPP16 26

27 Asano et al., 2002 Kaede 116kDa Ando et al., 2002; Arimura et al., 2004 Kaede rolc RPP16 rolc::kaede RPP16::Kaede Kaede 17I-J 18I-J Kaede 17G, H 18G, H Hd3a:GFP GFP rolc::hd3a:gfp rolc::gfp RPP16::Hd3a:GFP RPP16::GFP Hd3a:GFP Hd3a:GFP Hd3a::Hd3a:GFP GFP

28 Hd3a:GFP rolc::hd3a:gfp rolc::gfp GFP rolc::hd3a:gfp Hd3a:GFP 47kDa rolc::gfp GFP 26kDa WT 16 rolc::hd3a:gfp Hd3a:GFP rolc::hd3a:gfp GFP Hd3a:GFP 17A, B RPP16::Hd3a:GFP Hd3a::Hd3a:GFP RPP16::Hd3a:GFP Hd3a:GFP 18A, B rolc::hd3a:gfp RPP16::Hd3a:GFP Hd3a:GFP rolc::hd3a:gfp RPP16:: Hd3a:GFP Hd3a:GFP 17C-F 18C-F 3 Hd3a:GFP Hd3a:GFP 28

29 rolc::hd3a:gfp RPP16::Hd3a:GFP Hd3a::Hd3a:GFP 15 3 Hd3a:GFP 29

30 Hd3a mrna Hd3a Hd3a Hd3a 1. Hd3a mrna PCR Hd3a::GUS Hd3a mrna 5B, C Hd3a mrna 5B, C 9C FT Wigge et al., Ishikawa Hd3a 30

31 Hd3a Hd3a Knott Hd3a FT Chailakhyan, 1936 FT 11 Hd3a RFT FTL Izawa et al., 2002; Kojima et al., 2002; Ishikawa et al., 2005; Tamaki et al., 2007 FT Hd3a RFT RNAi Hd3a RNAi Hd3a RFT RNAi 300 Hd3a RFT FT FT FD AP1 31

32 Hd3a Hd3a mrna 2. Oc Hd1 Hd3a Hd1 Hd3a 6B Hd1 Hd3a CO FT Hd1 Hd1 N C GFP GFP:Hd1 Hd1:GFP Hd1 data not shown Hd1 Hd3a Hd3a Hd1 Hd1 32

33 Hd3a Hd1 Ishikawa et al., 2005 Hd3a::GUS Hd3a::Hd3a:GFP Hd3a::GUS Hd3a mrna Hd3a Hd3a Hd1 Hd1 OsGI Hd1 Hayama et al., 2003 ;, 2007 Hd1 Hd3a Hd1 Hd1 Hd3a PhyB, Hd3a : GFP Hd3a Hd3a:GFP 3 Hd3a:GFP 33

34 Hd3a:GFP Hd3a:GFP , 18 Hd3a mrna Hd3a mrna Hd3a:GFP Hd3a:GFP 12G, H 17E, F 18E, F Hd3a Hd3a Tamaki et al., Hd3a Hd3a 34

35 Hd3a Tamaki et al., 2007 Hd3a Kojima et al., 2002; Tamaki et al., 2007 FT FT Corbesier et al., 2007 Hd3a FT Kojima et al., 2002 Hd3a Tamaki et al., 2007 Hd3a:GFP Tamaki et al., Hd3a Chailakhyan, 1936; Lang, 1965; Zeevaart, Hd3a Hd3a mrna Hd3a 5 Hd3a Hd3a 35

36 Hd3a Hd3a FT Hd3a FT Kojima et al., 2002 FT / Hd3a FT Lifschitz et al., 2006 FT Bohlenius et al., 2006 rolc::hd3a:gfp, 2007 Hd3a:GFP FT / Hd3a 5 36

37 rolc::hd3a:gfp FT / Hd3a Hd3a Brassica napus FT FT Giavalisco et al., 2006 Hd3a Hd3a Hd3a Aoki et al., 2005 Hd3a Hd3a Hd3a 37

38 Hd3a:GFP Hd3a::Hd3a:GFP Hd3a:GFP 20 Hd3a:GFP Hd3a:GFP Hd3a FT Kardailsky et al., 1999; Kobayashi et al., 1999; Kojima et al., 2002 FT WT An et al., 2004 Hd3a / FT FT / Hd3a TFL1 TFL1 FT 38

39 FT Bradley et al., 1997 TFL1 RCN1 RCN2 Nakagawa et al., 2002 TFL1 FT Ahn et al., 2006 TFL1 Conti and Bradley, 2007 FT / Hd3a TFL1 FT FD Wigge et al., 2005 FT / Hd3a FT Ahn et al., Zea mays dlf dlf FD b-zip dlf 39

40 Muszynski et al., 2006 FD FT FD TFL1 TFL1 FD FT TFL1 FD TFL1 FD Abe et al., 2005; Wigge et al., 2005 Hd3a:GFP 15 35S::FT SEP3 FUL Teper-Bamnolker and Samach, 2005 SFT FT Bohlenius et al., 2006; Lifschitz et al., 2006; Lifschitz and Eshed,

41 FT / Hd3a 41

42 Hd3a Hd3a 19 Hd3a Hd3a::Hd3a:GFP Hd3a:GFP Hd3a:GFP 42

43 Hd3a RPP16 rolc 16 Wong Hann Ling 43

44 Abe, M., Kobayashi, Y., Yamamoto, S., Daimon, Y., Yamaguchi, A., Ikeda, Y., Ichinoki, H., Notaguchi, M., Goto, K., and Araki, T FD, a bzip protein mediating signals from the floral pathway integrator FT at the shoot apex. Science 309, Ahn, J.H., Miller, D., Winter, V.J., Banfield, M.J., Lee, J.H., Yoo, S.Y., Henz, S.R., Brady, R.L., and Weigel, D A divergent external loop confers antagonistic activity on floral regulators FT and TFL1. EMBO J. 25, An, H., Roussot, C., Suarez-Lopez, P., Corbesier, L., Vincent, C., Pineiro, M., Hepworth, S., Mouradov, A., Justin, S., Turnbull, C., and Coupland, G CONSTANS acts in the phloem to regulate a systemic signal that induces photoperiodic flowering of Arabidopsis. Development 131, Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., and Miyawaki, A An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, Aoki, K., Suzui, N., Fujimaki, S., Dohmae, N., Yonekura-Sakakibara, K., Fujiwara, T., Hayashi, H., Yamaya, T., and Sakakibara, H Destination-selective long-distance movement of phloem proteins. Plant Cell 17, Arimura, S., Yamamoto, J., Aida, G.P., Nakazono, M., and Tsutsumi, N Frequent fusion and fission of plant mitochondria with unequal nucleoid distribution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, Asano, T., Kusano, H., Okuda, T., Kubo, N., Shimada, H., and Kadowaki, K Rpp16 and Rpp17, from a common origin, have different protein characteristics but both genes are predominantly expressed in rice phloem tissues. Plant Cell Physiol. 43, Bohlenius, H., Huang, T., Charbonnel-Campaa, L., Brunner, A.M., 44

45 Jansson, S., Strauss, S.H., and Nilsson, O CO/FT regulatory module controls timing of flowering and seasonal growth cessation in trees. Science 312, Bradley, D., Ratcliffe, O., Vincent, C., Carpenter, R., and Coen, E Inflorescence commitment and architecture in Arabidopsis. Science 275, Chailakhyan, M.K New facts in support of the hormonal theory of plant development. C. R. Acad. Sci. URSS Conti, L., and Bradley, D TERMINAL FLOWER1 is a mobile signal controlling Arabidopsis architecture. Plant Cell 19, Corbesier, L., and Coupland, G Photoperiodic flowering of Arabidopsis: integrating genetic and physiological approaches to characterization of the floral stimulus. Plant Cell Environ. 28, Corbesier, L., and Coupland, G The quest for florigen: a review of recent progress. J. Exp. Bot. 57, Corbesier, L., Vincent, C., Jang, S., Fornara, F., Fan, Q., Searle, I., Giakountis, A., Farrona, S., Gissot, L., Turnbull, C., and Coupland, G FT protein movement contributes to long-distance signaling in floral Induction of Arabidopsis. Science 316, Fowler, S., Lee, K., Onouchi, H., Samach, A., Richardson, K., Morris, B., Coupland, G., and Putterill, J GIGANTEA: a circadian clock-controlled gene that regulates photoperiodic flowering in Arabidopsis and encodes a protein with several possible membrane-spanning domains. EMBO J. 18, Giavalisco, P., Kapitza, K., Kolasa, A., Buhtz, A., and Kehr, J Towards the proteome of Brassica napus phloem sap. Proteomics 6,

46 Garner W.W. and Allard H.A Further studies on photoperiodism, the response of plants to relative length of day and night. J. Agric. Res. 23, Guivarc'H, A., Spena, A., Noin, M., Besnard, C., and Chriqui, D The pleiotropic effects induced by the rolc gene in transgenic plants are caused by expression restricted to protophloem and companion cells. Transgenic Res. 5, Hayama, R., Yokoi, S., Tamaki, S., Yano, M., and Shimamoto, K Adaptation of photoperiodic control pathways produces short-day flowering in rice. Nature 422, Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T., and Kumashiro, T Efficient transformation of rice Oryza sativa L. mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant J. 6, Imaizumi, T., and Kay, S.A Photoperiodic control of flowering: not only by coincidence. Trends Plant Sci. 11, Ishikawa, R., Tamaki, S., Yokoi, S., Inagaki, N., Shinomura, T., Takano, M., and Shimamoto, K Suppression of the floral activator Hd3a is the principal cause of the night break effect in rice. Plant Cell 17, Izawa, T., Oikawa, T., Sugiyama, N., Tanisaka, T., Yano, M., and Shimamoto, K Phytochrome mediates the external light signal to repress FT orthologs in photoperiodic flowering of rice. Genes Dev. 16, Kardailsky, I., Shukla, V.K., Ahn, J.H., Dagenais, N., Christensen, S.K., Nguyen, J.T., Chory, J., Harrison, M.J., and Weigel, D Activation tagging of the floral inducer FT. Science 286, King R.W., Evans L.T. and Wardlaw I.F Translocation of the floral stimulus in Pharbitis nil in relation to that of assimilates. Z. Pflanzenphysiol. 59,

47 King R.W. and Zeevaart J.A.D Floral stimulus movement in Perilla and flower inhibition caused by noninduced leaves. Plant Physiol. 51, Knott J.E Effect of a localized photoperiod on spinach. Proc. Am. Soc. Hort. Sci. 31, Kobayashi, Y., Kaya, H., Goto, K., Iwabuchi, M., and Araki, T A pair of related genes with antagonistic roles in mediating flowering signals. Science 286, Kojima, S., Takahashi, Y., Kobayashi, Y., Monna, L., Sasaki, T., Araki, T., and Yano, M Hd3a, a rice ortholog of the Arabidopsis FT gene, promotes transition to flowering downstream of Hd1 under short-day conditions. Plant Cell Physiol. 43, Koornneef, M., Hanhart, C.J., and van der Veen, J.H A genetic and physiological analysis of late flowering mutants in Arabidopsis thaliana. Mol. Gen. Genet. 229, Lang, A Physiology of flower initiation. In Encyclopedia of Plant Physiology Vol. XV. W. Ruhland, ed., Berlin: Springer pp Lifschitz, E., Eviatar, T., Rozman, A., Shalit, A., Goldshmidt, A., Amsellem, Z., Alvarez, J.P., and Eshed, Y The tomato FT ortholog triggers systemic signals that regulate growth and flowering and substitute for diverse environmental stimuli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, Lifschitz, E., and Eshed, Y Universal florigenic signals triggered by FT homologues regulate growth and flowering cycles in perennial day-neutral tomato. J. Exp. Bot. 57, Moritoh, S., Miki, D., Akiyama, M., Kawahara, M., Izawa, T., Maki, H., and Shimamoto, K RNAi-mediated silencing of OsGEN-L OsGEN-like, a new member of the RAD2/XPG nuclease family, causes male sterility by defect of microspore development in rice. Plant Cell Physiol. 46,

48 Muszynski, M.G., Dam, T., Li, B., Shirbroun, D.M., Hou, Z., Bruggemann, E., Archibald, R., Ananiev, E.V., and Danilevskaya, O.N delayed flowering1 encodes a basic leucine zipper protein that mediates floral inductive signals at the shoot apex in maize. Plant Physiol. 142, Nakagawa, M., Shimamoto, K., and Kyozuka, J Overexpression of RCN1 and RCN2, rice TERMINAL FLOWER 1/CENTRORADIALIS homologs, confers delay of phase transition and altered panicle morphology in rice. Plant J. 29, Park, D.H., Somers, D.E., Kim, Y.S., Choy, Y.H., Lim, H.K., Soh, M.S., Kim, H.J., Kay, S.A., and Nam, H.G Control of circadian rhythms and photoperiodic flowering by the Arabidopsis GIGANTEA gene. Science 285, Putterill, J., Robson, F., Lee, K., Simon, R., and Coupland, G The CONSTANS gene of Arabidopsis promotes flowering and encodes a protein showing similarities to zinc finger transcription factors. Cell 80, Robson, F., Costa, M.M., Hepworth, S.R., Vizir, I., Pineiro, M., Reeves, P.H., Putterill, J., and Coupland, G Functional importance of conserved domains in the flowering-time gene CONSTANS demonstrated by analysis of mutant alleles and transgenic plants. Plant J. 28, Searle, I., He, Y., Turck, F., Vincent, C., Fornara, F., Krober, S., Amasino, R.A., and Coupland, G The transcription factor FLC confers a flowering response to vernalization by repressing meristem competence and systemic signaling in Arabidopsis. Genes Dev. 20, Simpson, G.G., and Dean, C Arabidopsis, the Rosetta stone of flowering time? Science 296, Suarez-Lopez, P., Wheatley, K., Robson, F., Onouchi, H., Valverde, F., and Coupland, G CONSTANS mediates between the circadian clock and the control of flowering in Arabidopsis. Nature 410,

49 Takada, S., and Goto, K TERMINAL FLOWER2, an Arabidopsis homolog of HETEROCHROMATIN PROTEIN1, counteracts the activation of FLOWERING LOCUS T by CONSTANS in the vascular tissues of leaves to regulate flowering time. Plant Cell 15, Tamaki, S., Matsuo, S., Wong, H.L., Yokoi, S., and Shimamoto, K Hd3a protein is a mobile flowering signal in rice. Science 316, Teper-Bamnolker, P., and Samach, A The flowering integrator FT regulates SEPALLATA3 and FRUITFULL accumulation in Arabidopsis leaves. Plant Cell 17, Wenkel, S., Turck, F., Singer, K., Gissot, L., Le Gourrierec, J., Samach, A., and Coupland, G CONSTANS and the CCAAT box binding complex share a functionally important domain and interact to regulate flowering of Arabidopsis. Plant Cell 18, Wigge, P.A., Kim, M.C., Jaeger, K.E., Busch, W., Schmid, M., Lohmann, J.U., and Weigel, D Integration of spatial and temporal information during floral induction in Arabidopsis. Science 309, Yano, M., Katayose, Y., Ashikari, M., Yamanouchi, U., Monna, L., Fuse, T., Baba, T., Yamamoto, K., Umehara, Y., Nagamura, Y., and Sasaki, T Hd1, a major photoperiod sensitivity quantitative trait locus in rice, is closely related to the Arabidopsis flowering time gene CONSTANS. Plant Cell 12, Yanovsky, M.J., and Kay, S.A Molecular basis of seasonal time measurement in Arabidopsis. Nature 419, Zeevaart, J.A.D Physiology of flower formation. Annu. Rev. Plant Physiol. 27, Zeevaart, J.A.D Florigen coming of age after 70 years. Plant Cell 18,

50 2007. Hd3a Hd : RNAi Dicer RdRP Hd3a ,, 218p FT. 50

51 表 1. フロリゲンの 定 義 1 植 物 の 花 成 が 誘 導 される 日 長 条 件 下 の 葉 において 作 られる 2 植 物 の 花 成 を 誘 導 する 3 接 木 間 を 移 動 できる 4 長 日 植 物 と 短 日 植 物 において 共 通 である 5 師 管 を 通 じて 移 動 する 6 茎 頂 分 裂 組 織 にシグナルとして 運 ばれる Corbesier and Coupland, 2005; Corbesier and Coupland, 2006; Zeevaart, 2006, 瀧 本, 1998 を 参 考 にして 作 製 51

52 表 2. 形 質 転 換 体 用 コンストラクト 作 成 のためのプライマーリスト Primer sequence rolc promoter-f rolc promoter-r RPP16 promoter-f RPP16 promoter-r Hd3a for Hd3a:FP-F Hd3a for Hd3a:FP-R GFP for Hd3a:GFP-F GFP for Hd3a:GFP-R GFP full length-f GFP full length-r Kaede for Kaede-F Kaede for Kaede-R AAGCTTAAAGTTGGCCCG GGTACCAACAAAGTAGGAAACAGGT AAGCTTCCAAACCCACCACGGCT GGTACCTCCCCAGCATCCCCCGGCGCC GGTACCCTTCAGGGTTTTTTGC TCTAGAGGGGTAGACCCTCCTGCCGC TCTAGAGTGAGCAAGGGCGAGGAGCT ACTAGTTTACTTGTACAGCTCGTCC GGTACCATGGTGAGCAAGGGCGA ACTAGTTTACTTGTACAGCTCGTCC GGTACCATGGTGAGTCTGATTAAACC ACTAGTTTACTTGACGTTGTCGGG FR Fluorescence protein(gfp & Kaede) 下 線 部 : 制 限 酵 素 サイト 52

53 表 3. リアルタイムRT-PCR 用 のプライマーリスト Primer sequence length ubq-f AACCAGCTGAGGCCCAAGA 77 bp ubq-r ACGATTGATTTAACCAGTCCATGA Hd3a(FT-L2)-F GCTCACTATCATCATCCAGCATG 118 bp Hd3a(FT-L2)-R CCTTGCTCAGCTATTTAATTGCATAA GFP-F TACGGGGTGCAGTGCTTC 73 bp GFP-R CGGGCAYGGCGGACT 53

54 表 4. フロリゲンの 定 義 および 今 回 の 解 析 で 明 らかになったこと 植 物 の 花 成 が 誘 導 される 日 長 条 件 下 の 葉 において 作 られる Hd3a mrnaは 短 日 条 件 の 葉 身 でのみ 発 現 する 植 物 の 花 成 を 誘 導 する Hd3a 過 剰 発 現 体 は 早 咲 き 表 現 型 を 示 す 接 木 間 を 移 動 できる Hd3a の 相 同 遺 伝 子 FT のタンパク 質 は 接 木 間 を 移 動 できる 長 日 植 物 と 短 日 植 物 において 共 通 である 短 日 植 物 のイネのHd3a と 長 日 植 物 のシロイヌナズナのFT は アミノ 酸 レベルで 高 い 相 同 性 を 示 し 機 能 もまた 保 存 されている 師 管 を 通 じて 移 動 する Hd3a は 維 管 束 の 師 管 周 辺 で 発 現 している 茎 頂 分 裂 組 織 にシグナルとして 運 ばれる Hd3a タンパク 質 が 茎 頂 分 裂 組 織 で 観 察 された Corbesier and Coupland, 2005; Corbesier and Coupland, 2006; Zeevaart, 2006, 瀧 本, 1998 を 参 考 にして 作 製 結 論 Hd3a タンパク 質 がイネにおけるフロリゲンである 可 能 性 が 高 い 54

55 葉 茎 頂 分 裂 組 織 師 部 フロリゲン フロリゲンの 動 く 方 向 図 1. フロリゲンのモデル 植 物 においてフロリゲンはその 植 物 が 花 成 誘 導 される 日 長 条 件 下 におい て 葉 で 作 られ その 後 茎 頂 分 裂 組 織 へと 伝 わり 花 成 を 誘 導 する 55

56 A シロイヌナズナ 長 日 植 物 イネ 短 日 植 物 GI OsGI CO Hd1 長 日 条 件 短 日 条 件 長 日 条 件 FT Hd3a B FT 1: M SI N.. I RDPL I V S RVVGDVLDP F N RSI T L K V T Y G Q R E V T NGL D L R PSQ V QNKPRVEI GG: 58 Hd3a 1: M AGSGRDRDPL V V G RVVGDVLDA F V RSTNL K V T Y G S K T V S NGC E L K PSM V THQPRVEV GG: FT 59: E D L R N FYTLVMVDPDV PSPSN P H L R E Y L H WL V T D I P A TTG T T FGN E I V CYEN P S PTA GI H:118 Hd3a 61: N D M R T FYTLVMVDPDA PSPSD P N L R E Y L H WL V T D I P G TTA A S FGQ E VMCYES P R PTM GI H: FT 119: R V VFI L F R QL GRQT V YA PGWRQNF NT REFAEI YNL GL PVAAVFYNCQRES G C GGRRL.. :175 Hd3a 121: R L VFV L F Q QL GRQT V YA PGWRQNF NT KDFAEL YNL GS PVAAVYFNCQREA G S GGRRV YP:179 図 2. 光 周 性 花 成 反 応 のシグナル 伝 達 モデル (A) 長 日 植 物 シロイヌナズナと 短 日 植 物 イネにおける 光 周 性 花 成 経 路 の モデル 図 シロイヌナズナは 長 日 条 件 で 花 成 統 合 遺 伝 子 FT の 発 現 が 誘 導 され 花 成 が 促 進 され イネでは 短 日 条 件 で Hd3a の 発 現 が Hd1 により 誘 導 され 長 日 条 件 では Hd1 により 抑 制 される (B) FT と Hd3a のアミノ 酸 の 相 同 性 を 比 較 したもの FT と Hd3a は 非 常 に 高 い 相 同 性 を 示 す 56

57 1. Hd3a pro GUS nos T 2. Hd3a pro Hd3a GFP nos T 3. RPP16 pro Hd3a GFP nos T 4. RPP16 pro GFP nos T 5. RPP16 pro Kaede nos T 6. rolc pro Hd3a GFP nos T 7. rolc pro GFP nos T 8. rolc pro Kaede nos T 図 3. 本 解 析 に 使 用 した 形 質 転 換 体 作 製 のためのコンストラクトの 模 式 図 Hd3a::GUS は pbi101 をそれ 以 外 は p2k1 + をもとに 作 成 した 57

58 レポーターコンストラクト Hd3a pro GUS nos T 35S pro GUS nos T エフェクターコンストラクト Ubq pro Hd1 nos T Ubq pro Bar nos T インターナルコントロールコンストラクト Ubq pro LUC nos T 図 4. 本 解 析 に 使 用 した 一 過 的 発 現 解 析 のためのコンストラクトの 模 式 図 エフェクターコンストラクトは pig221 をそれ 以 外 は puc19 をもとに 作 成 した 58

59 A (Day) 0 LD30 SD10 Sampling (ZT) Sampling B 2.5 Hd3a / Ubq mrna 茎 頂 根 基 部 葉 鞘 葉 身 C Hd3a mrna expression (Hd3a /Ubq ) meristem root stem Leaf sheath Leaf blade Exp1 Exp 図 5. WTにおける Hd3a mrnaの 組 織 別 発 現 解 析 (A) 今 回 の 解 析 に 用 いた 植 物 体 の 生 育 条 件 およびサンプリング 時 間 明 期 開 始 時 をZT=0としてZT0-4の 間 にサンプリングを 行 った (B) Hd3a mrnaの 各 組 織 における 発 現 量 を real - time RT PCR を 用 いて 検 出 を 行 った 結 果 をグラフで 示 した (C) Hd3a mrnaの 各 組 織 における 発 現 量 をreal-time RT-PCRを 用 いて 検 出 を 行 った 結 果 を 表 で 示 したもの 再 現 性 をとるため 実 験 を2 回 繰 り 返 した 59

60 A 35S::GUS B Hd3a::GUS n=3 n= GUS activity/luc activity (%) GUS activity/luc activity (%) Reporter Effecter (Bar ) Effecter (Hd1) 図 6. イネプロトプラストを 用 いた 一 過 的 発 現 解 析 (A) レポーター 遺 伝 子 に 35S プロモーターを 用 いた 解 析 の 結 果 (B) レポーター 遺 伝 子 に Hd3a プロモーターを 用 いた 解 析 の 結 果 解 析 には 各 処 理 区 とも 独 立 して3 回 実 験 を 行 いその 結 果 の 平 均 お よび 標 準 偏 差 を 示 した 各 処 理 区 において 用 いたエフェクターコ ンストラクトを+で 示 している なお 内 在 コンロトールとして すべての 処 理 区 に Ubq::Luc を 用 いた 60

61 A 短 日 条 件 B 長 日 条 件 Hd3a /ubq (ZT) Hd3a /ubq (ZT) GUS / ubq GUS / ubq (ZT) (ZT) 図 7. Hd3a::GUS 植 物 体 の 播 種 後 35 日 における 短 日 長 日 両 条 件 下 での Hd3a および GUS mrnaの 発 現 (A) 短 日 条 件 下 におけるHd3a および GUS mrnaの24 時 間 の 発 現 パ ターン(B) 長 日 条 件 における Hd3a および GUS mrnaの24 時 間 の 発 現 パターン 明 期 開 始 時 をZT=0としている 61

62 A 短 日 条 件 B 光 中 断 処 理 Hd3a /ubq Hd3a /ubq (ZT) (ZT) GUS / ubq GUS / ubq (ZT) (ZT) 図 8. Hd3a::GUS 植 物 体 の 播 種 後 35 日 における 短 日 光 中 断 処 理 両 条 件 下 での Hd3a および GUS mrnaの 発 現 (A)は 短 日 条 件 下 にお ける Hd3a および GUS mrnaの24 時 間 の 発 現 パターンを (B)は 光 中 断 処 理 後 における Hd3a および GUS mrnaの24 時 間 の 発 現 パ ターンを 示 している 明 期 開 始 時 をZT=0としている 光 中 断 処 理 においてはZT-8に 一 時 間 の 光 中 断 処 理 を 行 った 62

63 A B C 葉 身 葉 身 横 断 切 片 茎 頂 arrow head : 茎 頂 分 裂 組 織 図 9. Hd3a::GUS 植 物 体 の 短 日 条 件 下 播 種 後 35 日 における Hd3a::GUS の 組 織 化 学 染 色 処 理 の 結 果 (A) 組 織 化 学 染 色 処 理 後 の 葉 身 (B) 組 織 化 学 染 色 処 理 後 の 葉 身 横 断 切 片 (C) 組 織 化 学 染 色 処 理 後 の 茎 頂 分 裂 組 織 を 含 んだ 縦 断 切 片 各 写 真 の 右 下 のBarは (A) 1 mm (B) 20 mm (C) 50 µm 63

64 A B Hd3a :GUS /ubq Hd3a /ubq (ZT) (ZT) 図 10. Hd3a::Hd3a:GFP 植 物 体 の 短 日 条 件 下 におけるHd3a および Hd3a:GFP mrnaの 発 現 (A) 短 日 条 件 下 における Hd3a mrnaの24 時 間 の 発 現 パターン (B) Hd3a:GFP mrnaの24 時 間 の 発 現 パター ン 明 期 開 始 時 をZT=0としている 64

65 A (Day) 70 B 60 Days to flowering WT Hd3a::Hd3a:GFP arrow head : 小 穂 図 11. Hd3a::Hd3a:GFP 植 物 体 の 短 日 条 件 下 における 開 花 表 現 型 (A) 短 日 条 件 下 における Hd3a::Hd3a:GFP の 植 物 体 白 い 四 角 で 囲 っ た 写 真 は 小 穂 の 拡 大 写 真 (B) 短 日 条 件 下 におけるWT および Hd3a::Hd3a:GFP の 開 花 日 を 示 した データーはすべてT0 世 代 のデー ターを 用 いた 65

66 A B C D E F G H I J 図12. Hd3a::Hd3a:GFP 植物体における茎頂分裂組織 Hd3a::Hd3a:GFP 植物体の茎頂分裂組織を含む縦断切片を蛍光顕微鏡 を用いて観察した (A) (C) (E) (G) (I) 明視野+GFP (B) (D) (F) (H) (J) 分光処理画像 GFP 蛍光は緑で 自家蛍光は赤で示し ている 矢印は茎頂分裂組織を示している Bar = 50 µm 66

67 A B C D arrow : SAM Bar = 50 µm 図 13. Hd3a::Hd3a:GFP 植 物 体 の 茎 頂 分 裂 組 織 および 維 管 束 組 織 にお けるHd3a:GFP タンパク 質 の 局 在 (A) (B) 茎 頂 分 裂 組 織 におけるHd3a:GFP タンパク 質 の 局 在 (B) (A)に おいて 黄 線 で 囲 んだ 部 分 の 高 倍 率 画 像 (C) (D) 維 管 束 組 織 における Hd3a:GFP タンパク 質 の 局 在 (D) (C)において 赤 線 で 囲 んだ 領 域 の 高 倍 率 画 像 Bar = 50 µm 67

68 Days to flowering (Day) Hd3a : GFP GFP WT RPP16 rolc genotype Days to flowering (days ± S.E..) WT RPP16 ::Hd3a:GFP RPP16::GFP rolc::hd3a:gfp rolc::gfp 50.4 ± 7.6 (n = 5) 14.6 ± 4.6 (n = 5) 62 (n = 2) 19.5 ±13.6 (n = 11) 82 (n = 2) 図 14. RPP16::Hd3a:GFP RPP16::GFP rolc::hd3a:gfp rolc::gfp 植 物 体 の 短 日 条 件 下 における 開 花 表 現 型 各 形 質 転 換 体 T0 世 代 を 短 日 条 件 下 で 育 成 し 出 穂 日 を 調 べた そ れぞれの 個 体 における 導 入 遺 伝 子 の 有 無 はRT-PCRにより 確 認 し た 68

69 A B 図 15. rolc::hd3a:gfp RPP16::Hd3a:GFP 植 物 体 の 短 日 条 件 下 にお ける 開 花 表 現 型 (A) rolc::hd3a:gfp 形 質 転 換 体 (B) RPP16::Hd3a:GFP 形 質 転 換 体 69

70 ウエスタン 解 析 (kda) rolc pro. :: WT GFP Hd3a:GFP Hd3a :GFP 46.9 kda 28 GFP 27kDa (kda) 68 CBB 染 色 図 16. rolc::hd3a:gfp 形 質 転 換 体 におけるHd3a:GFP タンパク 質 の 発 現 rolc::hd3a:gfp rolc::gfp 形 質 転 換 体 およびWTの 可 溶 性 画 分 を 抽 出 し GFP 抗 体 を 用 いてウエスタンブロット 解 析 を 行 った rolc::hd3a:gfp rolc::gfp 形 質 転 換 体 の 可 溶 性 画 分 を 流 したレーン でそれぞれ Hd3a:GFP タンパク 質 および GFP タンパク 質 の 推 定 分 子 量 のサイズにバンドが 検 出 された 70

71 A B C D E F G H I J 図17. rolc::hd3a:gfp および rolc::kaede 植物体における Hd3a:GFP タ ンパク質および Kaede タンパク質の局在 (A)-(F) rolc::hd3a:gfp (G) (H) (I) (J) rolc::kaede (A) (B) は葉身横 断切片 (C) (D) 茎頂分裂組織含む縦断切片 (E) (F)茎頂分裂組織 (G) (H) 茎頂分裂組織 (I) (J) 基部横断切片 矢印は茎頂分裂組織を示して いる (A) (C) (E) (G) (I) は明視野+GFP画像 (B) (D) (F) (H) (J) は 分光処理画像 GFP蛍光は緑で 自家蛍光は赤で示している Bar = 50 µm 71

72 A B C D E F G H I J 図18. RPP16::Hd3a:GFP および RPP16::Kaede 植物体におけるHd3a:GFP タンパク質および Kaede タンパク質の局在 (A)-(F) RPP16::Hd3a:GFP (G) (H) (I) (J) RPP16::Kaede (A) (B) は葉 身横断切片 (C) (D) 茎頂分裂組織含む縦断切片 (E) (F)茎頂分裂組織 (G) (H) 茎頂分裂組織 (I) (J) 基部横断切片 矢印は茎頂分裂組織を 示している (A) (C) (E) (G) (I) は明視野+GFP画像 (B) (D) (F) (H) (J) は 分光処理画像 GFP蛍光は緑で 自家蛍光は赤で示し ている Bar = 50 µm 72

73 Hd3a 葉 師 部 Hd3a 茎 頂 分 裂 組 織 Hd3a Hd3a タンパク 質 Hd3a タンパク 質 の 動 く 方 向 図 19. イネにおけるフロリゲンHd3a タンパク 質 移 動 のモデル Hd3a 遺 伝 子 は 短 日 条 件 下 において 光 周 性 花 成 経 路 により 葉 身 の 維 管 束 組 織 特 異 的 に 発 現 し タンパク 質 へと 翻 訳 される Hd3a タンパク 質 は その 後 維 管 束 組 織 を 通 じて 茎 頂 分 裂 組 織 へと 運 ばれ 花 成 を 促 進 する 73

74 A B C D 図 20. Hd3a::Hd3a:GFP 植 物 体 における 茎 頂 分 裂 組 織 (A) (B) の 茎 頂 分 裂 組 織 は 栄 養 成 長 期 の 茎 頂 分 裂 期 だと 思 われる (C) (D) の 茎 頂 分 裂 組 織 は すでに 生 殖 成 長 期 に 移 行 したものだと 思 われる (A) (C) (E) (G) (I) は 明 視 野 +GFP 画 像 (B) (D) (F) (H) (J) は 分 光 処 理 画 像 GFP 蛍 光 は 緑 で 自 家 蛍 光 は 赤 で 示 してい る 赤 線 で 囲 った 領 域 は 茎 頂 分 裂 組 織 を 示 している Bar = 50 µm 74

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