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1 Developer Toolbox 1.9 ユーザーマニュアル

2 目 次 画 像 を 開 く... 5 ソフトウェアの 起 動... 5 解 析 するイメージスタックファイル(XDCE ファイル)を 開 く イメージスタックウィンドウの 機 能... 6 Display format の 変 更... 7 Image Map Image Map の 表 示 表 示 領 域 の 移 動 表 示 倍 率 の 変 更... 9 疑 似 カラー 表 示 コントラストの 変 更 疑 似 カラー 表 示 コントラスト 変 更 Fused Image の 表 示 解 析 プロトコールを 開 く Protocol Explorer を 開 く 解 析 の 実 行 解 析 プロトコールの 確 認 視 野 または 1 ウェルのみ 解 析 複 数 のウェル/フィールドを 選 択 して 解 析 結 果 の 確 認 イメージスタックの 解 析 イメージスタック 全 体 の 解 析 解 析 結 果 の 保 存 バッチ 解 析 User Defined Analysis Protocol の 作 成 Protocol Manager を 開 く New protocol wizard Protocol Explorer Component Overview パネル Target Set の 作 成 Segmentation Segmentation 方 法 の 選 択

3 - Object Segmentation Intensity Segmentation Vesicle Segmentation Nuclear Segmentation Cytoplasm Segmentation Preprocessing Preprocessing の 追 加 Flat Field Correction Shading Removal QSM Shading Removal Denoising (gradient) Denoise (isotropic diffusion) Denoising (anisotropic diffusion) Denoising (CWT) Dilation Erosion Pseudo Fluorescence Texture Transformation Postprocessing Postprocessing の 追 加 Dilation (Binary) Erosion (Binary) Sieve Clump Breaking Watershed Clump Breaking Watershed Clump Breaking (With Seed) Fill Holes Border Object Removal Target Linking Target linking の 作 成 Target Linking の 設 定 Measure Measures の 設 定 Basic Measures Advanced Measures Measure の 設 定 例 Target をカウントする Target の 面 積 を 出 す

4 - Target のシグナル 強 度 を 出 す Classifiers Threshold Linear Discriminant Decision tree Group summary Macro Macro の 作 成 解 析 プロトコールプロトコールへの Macro の 追 加 Spotfire DecisionSite Spotfire Connect グラフの 作 成 表 示 例 結 果 の 保 存 Image stack transformation Image stitching スティッチイメージの 作 成 Image stitching プロトコールプロトコールのパラメータ 設 定 Extended focus Extended Focus プロトコールプロトコールの 作 成 方 法 : Extended Focus プロトコールプロトコールのパラメータ 設 定

5 画 像 を 開 く Developer Toolbox で 解 析 するデータを 開 きます IN Cell Analyzer で 取 得 したデータは 撮 影 したプレ ートごとに 1 つのフォルダに 保 存 されます そのフォルダに 保 存 されたイメージをまとめてイメージスタ ックと 呼 び イメージスタックについての 情 報 が 保 存 されたファイルをイメージスタックファイル(XDCE ファイル)と 呼 びます ソフトウェアの 起 動 デスクトップの Developer Toolbox アイコンをダブルクリックします IN Cell Developer Toolbox アイコン ソフトウェア 起 動 時 のユーザーインターフェースです メインメニューバー メインツールバー Operations ショートカットパネル Operations ウィンドウ Image View ウィンドウ 5

6 解 析 するイメージスタックファイル(XDCE ファイル)を 開 く Operations ショートカットパネルの View/Analyze Image Stack File で 解 析 するイメージスタックファイ ルを 開 きます View/Analyze Image Stack File アイコン Image View のウィンドウ 数 や 疑 似 カラー 表 示 は 前 回 使 用 時 の 設 定 によって 異 なる 場 合 があります - イメージスタックウィンドウの 機 能 緑 色 のウェルが 撮 影 したウェルです Image View ウィンドウにはイメージスタックウィンドウで 選 択 されているウェルのイメージが 表 示 されます 表 示 させたいウェルをクリックしてください Well: 現 在 選 択 されているウェルです プルダウンリストから 変 更 が 可 能 です λ: Image View に 表 示 するイメージの 波 長 が 選 択 できます 通 常 は All で 取 得 した すべての 波 長 のイメージが 表 示 されています Field: 1 ウェルで 複 数 フィールド 撮 影 した 場 合 に 表 示 するフィールドが 選 択 できます Time: タイムラプス 撮 影 した 場 合 のみ 選 択 できます Image View ウィンドウに 表 示 する タイムポイントが 選 択 できます Z: Z dimension もしくは 3D 撮 影 した 場 合 のみ 選 択 できます Image View ウィンドウ に 表 示 する Z スタック 位 置 が 選 択 できます 6

7 Display format の 変 更 Image View ウィンドウの 表 示 ウィンドウ 数 は 任 意 に 変 更 できます メインメニューバーの Settings メニューから Display Format を 選 択 します Display Format ウィンドウで Total # of views( 表 示 されるウィンドウ 数 )を 選 択 します OK をクリックすると Display Format ウィンドウが 閉 じて Image View 表 示 が 変 わります 7

8 Image Map - Image Map の 表 示 Image View ウィンドウのタイトルバー 左 端 のアイコンをクリックします 表 示 されるメニューから Show image map を 選 択 します Image Mapウィンドウが 表 示 されます Image Mapには 1 視 野 全 体 が 表 示 されています Image View ウィンドウに 表 示 されているのは Image Map 中 の 白 い 枠 線 内 の 領 域 です - 表 示 領 域 の 移 動 Image Map 中 に 表 示 されている 白 い 枠 線 内 をクリック&ドラッグして 表 示 領 域 を 移 動 できます 8

9 - 表 示 倍 率 の 変 更 Image Map 中 に 表 示 されている 白 い 枠 線 にマウスのカーソルを 近 づけるとカーソル 表 示 が 両 方 向 の になります この 状 態 でクリック&ドラッグすると 枠 の 大 きさが 変 更 できます 枠 を 小 さ くすると Image View の 表 示 は 拡 大 大 きくすると 縮 小 されます 9

10 疑 似 カラー 表 示 コントラストの 変 更 IN Cell Analyzer で 撮 影 したイメージは 12 ビットもしくは 16 ビットのグレースケールイメージです 表 示 に 疑 似 カラーを 付 けたり コントラストを 変 更 したりできます 表 示 色 とコントラストの 変 更 を 行 う 場 合 は Operations パネルで Visuals アイコンをクリックしてください Image View ウィンドウの 左 側 に Visuals ウィンドウが 表 示 されます Visuals アイコン - 疑 似 カラー 表 示 Image View ウィンドウで 表 示 を 変 更 するチャネルのウィンドウを 選 択 して メインツールバーのグ ラデーションバーのプルダウンリストから 疑 似 カラーを 選 択 します リストに 表 示 したい 疑 似 カラーが 無 い 場 合 は Visuals ウィンドウが 表 示 されている 状 態 で File メ ニューから Open を 選 択 して 任 意 の VIS ファイルを 開 いてください - コントラスト 変 更 Image View ウィンドウで 表 示 を 変 更 するチャネルのウィンドウを 選 択 します Operations パネル で Visuals アイコンをクリックすると Visuals ウィンドウに 選 択 されている Image View ウィンドウの シグナル 強 度 情 報 が 表 示 されます Visuals アイコン キーボードの F10 キーもしくは Visuals ウィンドウの Auto Contrast アイコンをクリックするとオート コントラスト 機 能 により 自 動 で 表 示 コントラストが 調 整 されます Auto Contrast アイコン メインツールバーのカーブタイプのプルダウンリストからグラデーションのトーンカーブが 変 更 でき ます コントラストを 調 整 しても 認 識 領 域 やピクセルごとのシグナル 強 度 は 変 更 されないため 解 析 結 果 には 影 響 しません 10

11 Fused Image の 表 示 異 なる 波 長 のイメージを 重 ねたイメージを Fused Image といいます 視 野 ごとに 自 動 でコントラスト 調 整 されたイメージに RGB 疑 似 カラーを 付 けて 重 ねた Fused Image を Image View に 表 示 できます イメージスタックウィンドウの Define Fusion アイコンをクリックします Define Fusion アイコン Define Fused Image ウィンドウで Enable fused image をチェックして 各 波 長 に 割 り 当 てる 疑 似 カラーを 選 択 します Apply ボタンをクリックすると Image View に Fused Image が 表 示 されます この 方 法 で 表 示 される Fused Image は それぞれに 自 動 でコントラスト 調 整 した 状 態 で 重 ねています ここでは Fused Image のコントラストを 調 整 することはできません 11

12 解 析 プロトコールを 開 く Protocol Explorer を 開 く Operations パネルで Protocol Explorer アイコンをクリックします Protocol Explorer アイコン Protocol Explorer のツール Clear analysis settings in current Protocol: 設 定 を 初 期 状 態 に 戻 します Select a Protocol: 保 存 されている 解 析 プロトコールを 開 きます Save Protocol: 解 析 プロトコールを 保 存 します Open a new image stack: 新 しいイメージスタックファイルを 開 きます Import image stack from miner: IN Cell Miner からイメージをインポートします Analyze: 解 析 を 実 行 します Analyze current block: Image View ウィンドウに 表 示 されているイメージを 解 析 します Analyze current field: イメージスタックウィンドウで 選 択 されているフィール ドを 解 析 します Analyze current well: イメージスタックウィンドウで 選 択 されているウェルを 解 析 します Analyze entire stack: イメージスタック 全 体 を 解 析 します 12

13 解 析 の 実 行 解 析 プロトコールの 確 認 コントロールウェルなどで Target の 認 識 や 計 算 式 の 設 定 が 適 当 かどうかを 確 認 します 特 にサンプル の 調 製 条 件 を 変 えたり 撮 影 条 件 を 変 えたりしたときには 確 認 が 必 要 です - 1 視 野 または 1 ウェルのみ 解 析 イメージスタックウィンドウで 任 意 のウェル/フィールドを 選 択 します Protocol Explorer のツールの Analysis アイコンをクリックして プルダウンリストから Analysis current block を 選 択 すると 表 示 しているイメージのみ 解 析 されます Analyze current well を 選 択 した 場 合 は 1 ウェルのみ 解 析 さ れます - 複 数 のウェル/フィールドを 選 択 して 解 析 イメージスタックウィンドウのツールで Switch to table view アイコンをクリックします Switch to table view Switch to plate view 13

14 イメージスタックに 含 まれるイメージが 一 覧 表 示 されるので 解 析 したいウェル/フィールドのイメ ージを 選 択 します Ctrl キーを 押 しながらクリックすると 複 数 のイメージが 選 択 できます Shift キーを 押 しながら 始 点 と 終 点 をクリックしてまとめて 選 択 することもできます 選 択 した 行 を 右 クリックして 表 示 されるメニューから Create a New Subset を 選 択 すると 選 ん だイメージだけのサブセットが 作 成 されます Subset タブを 選 択 した 状 態 で Protocol Explorer のツールの Analysis アイコンをクリックして プ ルダウンリストから Analysis entire stack を 選 択 すると Subset に 含 まれるイメージが 解 析 されま す Analysis アイコン - 結 果 の 確 認 解 析 を 実 行 すると Data テーブルに 解 析 結 果 が 表 示 されます Data テーブルの 表 示 には 次 の 3 つがあります プルダウンリストから 表 示 を 変 更 指 定 ください プルダウンリストはメインツールバーにあり ます 表 示 されていない 場 合 は View メニューで Table Bar を 選 択 してください Target table プロトコールで 設 定 した Target ごとの 数 値 が 表 示 されます このテーブルに 表 示 されるの は Measures で 設 定 した 中 で Statistical Function が 空 欄 のものです Statistical Function については 次 章 User Defied Analysis Protocol の Measure の 項 を 参 照 してください 任 意 の 行 をクリックすると Image View ウィンドウでイメージ 中 の Target のアウトラインが 表 示 されます 14

15 Summary table by block フィールドごとの 数 値 が 表 示 されます このテーブルに 表 示 されるのは Measure で 設 定 した 中 で Statistical Function が 選 択 されているものです Statistical Function については 次 章 User Defied Analysis Protocol の Measure の 項 を 参 照 してください 任 意 の 行 を クリックすると Image View ウィンドウでイメージ 中 の Target Set のアウトラインが 表 示 され ます Summary table by well ウェルごとの 数 値 が 表 示 されます このテーブルには Measure で 設 定 した 中 で Statistical Function が 選 択 されているものが 表 示 されます Statistical Function については 次 章 User Defied Analysis Protocol の Measure の 項 を 参 照 してください 15

16 イメージスタックの 解 析 Target の 認 識 や 計 算 式 の 設 定 を 確 認 したら 全 体 の 解 析 を 行 います 解 析 するデータの 量 や 解 析 内 容 によっては 解 析 終 了 までに 数 時 間 かかることがあります 解 析 プロトコールを 編 集 している 場 合 は 解 析 を 実 行 する 前 に 念 のため 保 存 してください プロトコールの 保 存 は Protocol Explorer のツールの Save Protocol をクリックします - イメージスタック 全 体 の 解 析 Protocol Explorer のツールの Analysis アイコンをクリックして プルダウンリストから Analysis entire stack を 選 択 します イメージスタックウィンドウで Subset タブを 表 示 している 場 合 は All Images タブを 選 択 してから 解 析 を 実 行 してください - 解 析 結 果 の 保 存 Analyze entire stack で 解 析 した 結 果 は プロトコールの Data Management 設 定 に 従 って 自 動 保 存 されます 保 存 できるファイルタイプ Data file MS Excel format Comma-delimited text Tab-delimited text Xml text Developer toolbox の 解 析 ファイル(.lg3) Developer の 解 析 パラメータや Target 認 識 のアウトライン 数 値 とイメージとのリンクなどの 情 報 が 含 まれます Data file を 残 しておくことによって 過 去 の 解 析 での 認 識 状 態 を 確 認 した り 解 析 を 行 った 時 点 のプロトコール 設 定 を 読 み 込 んだりできま す Microsoft Excel 形 式 のファイル(.xls) コンマ 区 切 りのテキストファイル(.csv) タブ 区 切 りのテキストファイル(.txt) Extensible Markup Language 形 式 のファイル(.xml) Spotfire Connect でこの 形 式 のデータを 開 いて Spotfire DecisionCite でグラフ 作 成 できます Data Management を 設 定 していなかった 場 合 でも Developer Data File は File メニューの Save または Save As で 保 存 できます また Data テーブルに 表 示 されている 数 値 は File メニュ ーの Export で 出 力 できます Data Management 設 定 は Protocol Manager で 変 更 できます 詳 しくは 次 章 User Defined Analysis Protocol の 作 成 を 参 照 してください 16

17 Protocol Manager でリストから 変 更 するプロトコールを 選 択 して Edit アイコンをクリックします Edit Protocol の Data Management で 必 要 なファイルをチェックしてください Edit アイコン - バッチ 解 析 複 数 のイメージスタックをまとめて 解 析 します バッチ 解 析 を 行 う 場 合 は 必 ず 事 前 に Data Management 設 定 を 行 って 解 析 結 果 が 自 動 的 に 保 存 されるようにしてください 既 存 のプロト コールをコピーしたり Save Protocol で 別 の 名 前 を 付 けて 保 存 したりした 場 合 Data Management 設 定 は 初 期 設 定 に 戻 るので 注 意 してください 1. メインメニューバーの Analysis メニューから Batch Analysis Manager を 選 択 します 2. Batch Queue Manager で Add ボタンをクリックします 3. Add Image Stack to Batch Queue で Protocol セクションの Select ボタンをクリックします 17

18 4. Select a Protocol ダイアログで 解 析 に 使 用 するプロトコールを 選 択 します バッチ 解 析 で 使 用 するプロトコールはプルダウンリスト 中 で <ba>プロトコール 名 と 表 示 されます 5. Add Image Stack to Batch Queue で Image Stack セクションの... をクリックして Browse For Folder で 解 析 するイメージスタックが 保 存 されている 階 層 のフォルダを 選 んで OK をクリックします 6. Add Image Stack to Batch Queue で Image Stack セクションの Scan ボタンをクリックする と そのフォルダ 内 にあるイメージスタックファイルのリストが 表 示 されます 既 に 選 択 してい るプロトコールでまとめて 解 析 するイメージスタックファイルをチェックして OK をクリックしま す 18

19 選 択 したプロトコールがバッチ 解 析 プロトコールではない 場 合 次 のようなメッセージが 表 示 されます OK をクリックして Export Analysis Protocols ダイアログで Save を 選 択 してくださ い 7. 他 のプロトコールで 解 析 するイメージスタックがあれば 2~6 のステップを 繰 り 返 し 行 ってく ださい 選 択 が 終 わったら Done をクリックして Batch Queue Manager を 閉 じます 8. メインメニューバーの Analysis メニューの Run Batch Analysis を 選 択 すると Batch Queue Manager の 設 定 に 従 って 解 析 が 実 行 されます 終 了 すると バッチ 解 析 のログが 表 示 され ます 19

20 User Defined Analysis Protocol の 作 成 Protocol Manager を 開 く メインメニューバーの Analysis メニューから Protocol Manager を 選 択 します Analysis Protocol Manager が 開 きます Analysis Protocol Manager のツール New: 新 しいプロトコールファイルを 作 成 します Edit: 既 存 のプロトコールファイルを 編 集 します Copy: 既 存 のプロトコールファイルをコピーします Delete: プロトコールファイルを 消 去 します Rename: プロトコール 名 を 変 更 します Import: プロトコールファイルをインポートします Export: プロトコールファイルをエクスポートします 20

21 New protocol wizard Analysis Protocol Manager のツールバーで New アイコンをクリックすると New Protocol Wizard が 開 きます New アイコン Protocol Name の Name 欄 に 任 意 のプロトコール 名 を 入 力 して Next をクリックします Analysis/Protocol Method で User defined analysis を 選 択 して Next をクリックします 21

22 Data Management で 解 析 結 果 の 出 力 で 必 要 な 形 式 を 選 択 して Finish をクリックします 既 にプロトコールが 開 かれている 場 合 は Use current settings か Start fresh のどちらかを 選 択 して Finish します Use current settings: 開 いているプロトコールをテンプレートとして 新 しいプロトコール が 作 成 されます Start fresh: 全 く 新 規 のプロトコールが 作 成 されます 22

23 Protocol Explorer Component Overview パネル Target Sets Developer Toolbox では 例 えば Nuclei や Cell などイメージ 中 の 解 析 対 象 を Target と 呼 びます Target の 集 合 が Target Set です Target Linking Target Set が 複 数 設 定 されている 場 合 Target 同 志 を 関 連 付 けて 解 析 できます Target をリンクすることによって 核 と 細 胞 体 の 両 方 にシグナルがある 細 胞 だけを 解 析 したり 細 胞 ごとに 内 包 する 顆 粒 の 数 を 数 値 化 したりできます Classifiers イメージから 数 値 化 した 項 目 に 対 して 閾 値 を 設 定 して Target を 分 類 できます 例 えば Target をマーカータンパク 質 由 来 の 蛍 光 強 度 で 分 類 したり 細 胞 の 面 積 や 形 態 で 分 類 し たりして 解 析 できます Dynamic Behavior タイムラプス 撮 影 したイメージで 細 胞 の 移 動 などをトラッキング 解 析 できます プロトコールはツリー 状 に 構 成 していきます プロトコール 中 の 処 理 はプロトコールツリーの 上 から 順 番 に 実 行 されます 23

24 Target Set の 作 成 Developer Toolbox の 解 析 プロトコールプロトコールでは イメージ 中 の 解 析 対 象 のオブジェクト (Target)を 認 識 (Segmentation)して 認 識 した 領 域 の 蛍 光 強 度 や 大 きさ/ 面 積 を 数 値 化 (Measure) します 核 や 細 胞 体 などのイメージ 中 の 解 析 するオブジェクトの 集 合 を Target Set と 呼 び Target Set の 個 々のオブジェクトを Target といいます 例 えば 核 の 解 析 を 行 う 場 合 イメージ 全 体 の 核 の 集 合 が Target Set で 個 々の 核 が Target です Component Overview パネルの Protocol ツリーを 右 クリックしてポップアップメニューから New Target Type を 選 択 します New Target Type ウィンドウに Target の 名 称 ( 例 : Nuclei) とその Target が 写 っている Source Image をドロップダウンリストから 選 択 します Source Image リストの 表 記 はそのイメ ージを 取 得 したときの 励 起 蛍 光 フィルタの 名 称 です プロトコールのツリー 表 示 の Target Sets の 下 に Nuclei が 追 加 されます Target ノード(Target の 名 称 )をクリックすると Setting パネルに 次 のような 情 報 が 表 示 さ れます 24

25 Target Type Name - Target Set の 名 称 です Source Image - Target Set の 認 識 を 行 うのに 使 用 するイメージです Target Color - イメージ 中 で Target として 認 識 した 領 域 を 示 す 色 を 指 定 します 例 えば Red を 選 択 した 場 合 イメージの 認 識 された 部 分 は Image View ウィンドウ 内 で 赤 く 塗 りつ ぶされます Targets Target 認 識 に 関 するオプションです: Filled - Target を 認 識 した 際 ドーナツ 状 に 認 識 されて 認 識 領 域 に 穴 がある 場 合 に その 部 分 を 穴 埋 めします この 処 理 は Target Set 認 識 の 最 後 に 行 われます Remove single pixel targets - 1 ピクセルサイズの 認 識 領 域 を Target から 除 き ます Acceptance Target 判 定 基 準 に 関 するオプションです: Use acceptance criteria - ボックスにチェックを 入 れて ボタンをクリックす ると Target Acceptance Criteria ダイアログが 開 きます このダイアログで Target の 判 定 基 準 が 設 定 できます Exclusion color - Use acceptance criteria がチェックされている 場 合 にアクティ ブになります 認 識 後 に Acceptance criteria で 排 除 された Target の 表 示 色 です Target Color とは 異 なる 色 を 選 択 してください Target Acceptance Criteria ダイアログで Target の 判 定 基 準 を 設 定 します 例 えば 単 位 面 積 あたりのシグナル 強 度 の 平 均 が 200 より 大 きい Target のみを 解 析 したい 場 合 次 の 手 順 で 判 定 基 準 を 設 定 できます: 25

26 ダイアログ 右 側 の Measures ボックスにある Density グループを 開 きます [Dens - Levels] をダブルクリックします Acceptance Criteria ボックスに [Dens Levels] と 入 ります ダイアログのボタンを 使 って 判 定 基 準 の 数 式 を 入 力 します 例 えば [Dens - Levels] > 200 と 入 れます シグナル 強 度 の 判 定 基 準 に 加 えて 他 の 判 定 基 準 も 入 れたい 場 合 は 改 行 して 入 力 します Targets と Acceptance で 設 定 した 処 理 の 結 果 を 認 識 結 果 の 出 力 に 反 映 する 場 合 は Update output image をチェックします Target Set の 5 つのノードはこの Target Set に 関 連 するパラメータ あるいは 実 行 可 能 な 操 作 を 表 しています 360_40-535_50: Target Set の Source Image の 波 長 です 励 起 フィルタ 名 蛍 光 フィルタ 名 で 表 示 されます Preprocessing: Segmentation を 行 う 前 に Source Image に 対 してノイズを 除 くなど Target の 識 別 を 改 善 するための 処 理 を 行 う 場 合 に 設 定 します Segmentation: Source Image から Target を 識 別 する 設 定 です イメージから Target を 識 別 することを 2 値 化 (Binary)といいます Postprocessing: Segmentation で 2 値 化 したイメージに 対 して 認 識 領 域 を 大 きく/ 小 さくする 一 定 の 面 積 よりも 大 きい/ 小 さいものを 除 くなどの 後 処 理 を 行 います Measures: 認 識 した Target に 対 して 数 値 化 の 設 定 を 行 います 26

27 Segmentation Target の 認 識 は Preprocessing Segmentation Postprocessing の 3 ステップで 行 います Segmentation は Source Image から Target の 領 域 を 識 別 して それ 以 外 の 領 域 と 分 割 するステッ プです このように Target とバックグラウンドの 領 域 を 分 けることを 2 値 化 (Binary)といいます 利 用 可 能 なセグメンテーション 方 法 はそれぞれに 調 整 可 能 なパラメータがあり 解 析 するイメージス タックに 合 わせて 選 択 し 最 適 化 できます 不 明 瞭 でノイズの 多 いイメージで 認 識 領 域 の 正 確 性 が 低 い 場 合 は Segmentation の 前 に 前 処 理 (Preprocessing)を 行 うことによってその 影 響 を 低 減 できます 詳 しくは Preprocessing の 項 を 参 照 し てください - Segmentation 方 法 の 選 択 Target Set の Segmentation を 行 うには Component Overview パネルに 表 示 されているプロト コールツリーで 目 的 の Target Set の Segmentation ノードを 右 クリックしてポップアップメニュー の Change Segmentation Type から 適 切 なセグメンテーション 操 作 を 選 択 します Setting パネルに 選 択 した 操 作 の 設 定 が 表 示 されます パラメータを 調 整 の 結 果 を 確 認 するに は Segmentation ノードをダブルクリックします 2 値 化 した 結 果 が Image View - Preview ウィン ドウに 表 示 され それが Source Image に 重 ねて 表 示 されます Segmentation 方 法 を 変 更 するには Segmentation ノードを 右 クリックしてポップアップメニュー から Change segmentation type を 選 択 します Object Intensity Vesicle Nuclear Cytoplasm ピクセルのシグナルが 周 囲 のピクセルの 平 均 シグナルよりも 大 きい 場 合 に 認 識 されます Minimum Threshold と Maximum Threshold の 範 囲 内 にある 領 域 を 認 識 します イメージ 中 の 顆 粒 状 の 物 体 を 粒 の 大 きさと 相 対 的 な 強 度 によっ て 認 識 する 方 法 です イメージ 中 の 細 胞 核 あるいは 細 胞 核 のような 形 状 のオブジェクト を 認 識 するのに 使 用 します Cytoplasm はイメージ 中 の 比 較 的 大 きく 均 一 な 形 状 の 明 るい( 強 度 の 高 い) 領 域 の 検 出 に 使 用 します 27

28 - Object Segmentation Object はさまざまな 形 状 の Target の Segmentation に 用 いることができる 汎 用 的 な 方 法 です ピクセルのシグナル 強 度 が Kernel Size で 規 定 した 範 囲 の 周 辺 ピクセルの 平 均 シグナル 強 度 よ りも 高 い 場 合 に 認 識 します Object Segmentation パネルで 設 定 するパラメータは Kernel Size と Sensitivity です Kernel Size - 認 識 される 領 域 は Kernel Size で 表 わされる 周 囲 のピクセルの 範 囲 により 変 化 し ます 最 小 の Kernel Size は 3 で この 場 合 3x3 ピクセルが 1 単 位 となり 中 心 のピクセルが 周 囲 の 8 ピクセルよりもシグナル 強 度 が 高 ければ 認 識 されます (a) Kernel size = 3, Sensitivity = 50 (b) Kernel size = 9, Sensitivity = 50 (c) Kernel size = 15, Sensitivity = 50 Sensitivity - バックグラウンドに 対 してオブジェクトとして 認 識 するときの 閾 値 の 設 定 です 設 定 された Kernel 中 で 周 囲 のピクセルに 対 して 中 心 のピクセルが 閾 値 よりも 強 度 が 高 ければ 認 識 されます 細 胞 の 輪 郭 などバックグラウンドに 対 して 認 識 したいオブジェクトが 不 明 瞭 なイメージ では Sensitivity の 設 定 によって 認 識 される 領 域 が 大 きく 異 なります (a) Kernel size = 15, Sensitivity = 10 (b) Kernel size = 15, Sensitivity = 50 (c) Kernel size = 15, Sensitivity = 90 28

29 - Intensity Segmentation Intensity はピクセルごとのシグナル 強 度 (Intensity)によってイメージを 認 識 する 方 法 です イメ ージ 全 体 でシグナル 強 度 が Minimum Threshold と Maximum Threshold の 範 囲 内 にあるピク セルを 認 識 します Minimum Threshold/Maximum Threshold パラメータ 閾 値 の 下 限 (Minimum Threshold) と 上 限 (Maximum Threshold)を 設 定 します 閾 値 の 設 定 方 法 には 認 識 の 様 子 を 見 ながら 閾 値 を 変 更 していく 方 法 と それぞれのフィールドに 直 接 入 力 する 方 法 があります Intensity の 範 囲 は 12 ビット 表 示 の 場 合 0 から ビット 表 示 の 場 合 は 0 から です イメージを 見 ながらセグメンテーションの 閾 値 を 変 更 する 方 法 Find Target ボタンをクリックすると Intensity Segmentation Parameter が 表 示 されます 通 常 は Source Image で 選 択 しているイメージで 認 識 される 領 域 が 表 示 されます Minimum または Maximum Threshold を 変 更 するには ダイアログ 中 のそれぞれの 数 値 が 表 示 されてい るボックスをクリックしたまま 上 下 にドラックして Image View ウィンドウの 認 識 の 様 子 を 見 ながら 調 整 できます 閾 値 の 微 調 整 を 行 うには 調 整 する 方 のボックスをクリックして をクリックし ます OK をクリックすると 調 整 した 閾 値 が Intensity Segmentation パネルに 入 ります Minimum Threshold = 100 Maximum Threshold = 4095 Minimum Threshold = 300 Maximum Threshold =

30 - Vesicle Segmentation 多 くの 細 胞 内 小 器 官 は 蛍 光 イメージで 顆 粒 状 の 構 造 ( 粒 状 のイメージ)になります これらの 顆 粒 は 観 察 される 実 際 の 物 体 の 状 態 ( 大 きさ)にばらつきがあったり 小 さいユニットが 近 接 し てイメージ 上 ではより 大 きな 構 造 に 見 えたりするため その 大 きさや 形 状 にはある 程 度 の 幅 が あります ここでいう 顆 粒 とは 球 形 のものだけではなく 不 規 則 な 形 状 のものも 含 みます Vesicle は 大 きさと 相 対 的 なシグナル 強 度 によって イメージ 中 の 粒 状 の 物 体 を 認 識 する 方 法 で す Vesicle Segmentation パネルでは 最 小 / 最 大 の 顆 粒 サイズ 最 小 と 最 大 の 間 の 目 盛 りの 数 および 認 識 の 感 度 を 設 定 します Minimum および Maximum Granule Size - イメージ 中 の 顆 粒 の 形 状 は 様 々です このパラメ ータで 入 力 するサイズは オブジェクトの 短 軸 の 長 さです Minimum Granule Size にはイメージ 中 の 小 さい 顆 粒 の 横 断 面 の 長 さを 入 力 します Maximum Granule Size にはイメージ 中 の 大 きい 顆 粒 の 横 断 面 の 長 さを 入 力 します Number of Scales - 顆 粒 状 のオブジェクトの 大 きさにはかなりの 幅 がある 場 合 があります Vesicle Segmentation パネルの Number of Scales では Minimum Granule Size と Maximum Granule Size の 間 で 何 段 階 のサイズ 目 盛 りを 入 れるのかを 選 択 します( 最 大 10 段 階 ) Number of Scales が 1 の 場 合 Minimum Granule Size と 同 じくらいの 顆 粒 だけが 認 識 されま す スケール 1 は 比 較 的 大 きさの 揃 った 顆 粒 を 定 量 する 場 合 に 使 用 します Number of Scale を 2 にした 場 合 は Minimum および Maximum Granule Size と 同 じくらいの 顆 粒 が 認 識 されます Minimum と Maximum の 差 が 大 きい 場 合 中 間 の 大 きさの 顆 粒 は 認 識 されません 中 間 の 大 きさの 顆 粒 も 認 識 したい 場 合 は Number of Scale を 2 以 上 にします 設 定 可 能 なスケール 数 が 不 明 な 場 合 ドロップダウンメニューから 10 を 選 択 すると その 右 に 入 力 されている 最 小 / 最 大 顆 粒 サイズの 間 に 設 定 可 能 な 最 大 スケール 数 が 表 示 されます Sensitivity - バックグラウンドに 対 してシグナル 強 度 の 高 い 領 域 を 顆 粒 として 認 識 するときの 閾 値 の 設 定 です バックグラウンドに 対 して 認 識 したいオブジェクトが 不 明 瞭 なイメージでは Sensitivity が 低 すぎると Target の 認 識 ができず 逆 に 高 すぎると Target 以 外 の 領 域 (バックグ ラウンドシグナル)も 多 く 認 識 します Sensitivity range イメージのシグナル 強 度 に 対 する 閾 値 設 定 のレンジが 変 更 できます この 値 を 大 きくすると Sensitivity で 設 定 される 相 対 的 な 認 識 感 度 が 低 くなります Sensitivity が 同 30

31 じ 50 でも Sensitivity range を 2 にした 場 合 設 定 しない 場 合 に 比 べて 認 識 される 領 域 は 少 な くなります Sensitivity = 50 Sensitivity range = 1.3 Sensitivity = 50 Sensitivity range = 2 Shape detection 選 択 により 特 定 の 形 状 のターゲットを 認 識 しやすくなります No constraints: Target の 形 状 を 特 に 識 別 しません Peak: オブジェクト 内 のシグナルピークを 識 別 します 円 形 のターゲットが 識 別 されます Ridge: 細 長 いターゲットが 識 別 されます Low background Target の 識 別 アルゴリズムを 低 バックグラウンド 画 像 に 合 わせます IN Cell Analyzer 2000 で 撮 影 した 2D Deconvolution イメージや IN Cell Analyzer 6000 で 撮 影 した 共 焦 点 イメージなどのバックグラウンドが 低 いイメージの 場 合 わずかなノイズでもコントラスト 差 が 大 きいために 認 識 されることがあります そのような 場 合 にこのオプションを 選 択 すると 認 識 が 改 善 されます Use octagonal morphology/precise mask いずれも 識 別 アルゴリズムを 改 善 するオプショ ンです チェックを 入 れてください - Nuclear Segmentation イメージ 中 の 細 胞 核 あるいは 細 胞 核 のような 形 状 のオブジェクトを 認 識 するのに 使 用 します Object や Vesicle と 同 じように 周 辺 領 域 よりも 相 対 的 にシグナル 強 度 の 高 い 領 域 を 認 識 する 方 法 です 31

32 Minimum target area - 認 識 する 核 の 面 積 を 入 力 します 正 確 に 最 小 値 を 入 力 する 必 要 はあ りません 比 較 的 小 さい 核 の 面 積 を 入 れてください Sensitivity - Sensitivity でバックグラウンドと 認 識 する 領 域 の 閾 値 を 設 定 します Sensitivity range イメージのシグナル 強 度 に 対 する 閾 値 設 定 のレンジが 変 更 できます この 値 を 大 きくすると Sensitivity で 設 定 される 相 対 的 な 認 識 感 度 が 低 くなります Sensitivity が 同 じ 50 でも Sensitivity range を 2 にした 場 合 設 定 しない 場 合 に 比 べて 認 識 される 領 域 は 少 な くなります Low background Target の 識 別 アルゴリズムを 低 バックグラウンド 画 像 に 合 わせます IN Cell Analyzer 2000 で 撮 影 した 2D Deconvolution イメージや IN Cell Analyzer 6000 で 撮 影 した 共 焦 点 イメージなどのバックグラウンドが 低 いイメージの 場 合 わずかなノイズでもコントラスト 差 が 大 きいために 認 識 されることがあります そのような 場 合 にこのオプションを 選 択 すると 認 識 が 改 善 されます Use octagonal morphology/precise mask いずれも 識 別 アルゴリズムを 改 善 するオプショ ンです チェックを 入 れてください - Cytoplasm Segmentation Cytoplasm はイメージ 中 の 比 較 的 大 きく 均 一 な 形 状 の 明 るい( 強 度 の 高 い) 領 域 の 検 出 に 効 果 的 で 細 胞 の 細 胞 質 領 域 を 認 識 するのに 適 した 方 法 です Noise suppression option - 認 識 の 正 確 性 はイメージに 存 在 するノイズの 量 に 影 響 を 受 けま す Noise suppression option パラメータは シグナル/ノイズ 比 を 改 善 するためのイメージ 処 理 フィルタが 選 択 できます ドロップダウンリストからノイズ 除 去 の 処 理 度 合 いを 選 択 してください まず Standard を 試 し 必 要 に 応 じて 変 更 してください Remove shading artifacts with area greater than - カメライメージには 一 般 に 不 均 一 な 励 起 光 の 照 射 や 蛍 光 の 捕 集 により 視 野 全 体 での 強 度 のかたよりがあります オリジナルイメージ から 補 正 フィルタをかけた 各 イメージの 陰 影 パターンを 差 し 引 いてこのばらつきを 均 一 化 します チェックボックスをクリックして 最 小 の Target サイズを 入 力 してください Use octagonal morphology 識 別 アルゴリズムを 改 善 するオプションです チェックを 入 れて ください 32

33 Preprocessing Preprocessing は Source Image に 対 して Segmentation を 行 う 前 に Target が 認 識 しやすくするた めに 行 うイメージ 処 理 です ノイズ 減 少 不 均 一 なバックグラウンドの 補 正 などを 行 います Preprocessing は 必 須 の 処 理 ではなく 各 Target Set で 必 要 に 応 じて 設 定 します Segmentation のアルゴリズムと 同 様 に Preprocessing も 解 析 するイメージスタックに 合 せてパラメ ータを 最 適 化 します Preprocessing を 行 った 結 果 は Preprocessing に 追 加 した 処 理 をダブルクリック すると Image View Preview ウィンドウに 表 示 されます - Preprocessing の 追 加 Component Overview パネルで 処 理 を 施 す Target Set を 開 きます Preprocessing ノードを 右 ク リックして ポップアップメニューの Insert as First Preprocess から 実 行 する 処 理 を 選 択 します 選 択 した 操 作 の 設 定 がパネルの 下 に 表 示 されます 同 じ Target Set に 対 して Preprocessing を 追 加 するには その 前 に 行 う Preprocessing を 右 クリ ックして ポップアップメニューの Insert After Current Preprocess を 選 択 します Flat Field Correction Shading Removal QSM Shading Removal Denoise (gradient) Denoise (isotropic diffusion) Denoise (anisotropic diffusion) Denoise (CWT) Dilation Erosion Pseudo Fluorescence Texture Transformation Flat Filed Image を 参 照 して 明 るさの 不 均 一 さ 補 正 します 視 野 全 体 のバックグラウンドのばらつきを 補 正 します 視 野 全 体 のバックグラウンドのばらつきを 均 一 にして バックグラウ ンドとのコントラストを 大 きくします Kernel size で 規 定 される 局 所 的 な 不 均 一 さを 除 去 します イメージ 内 で 相 対 的 にシグナル 変 化 が 少 ない 領 域 を 平 滑 にして 変 化 が 大 きい 領 域 (エッジ)は 残 します 処 理 の 反 復 回 数 (Iteration)により 効 果 が 大 きくなります イメージ 内 で 相 対 的 にシグナル 変 化 が 少 ない 領 域 を 平 滑 にして 変 化 が 大 きい 領 域 (エッジ)は 残 します Kernel Size と Iteration に より 効 果 が 大 きくなります ウェーブレット 変 換 によりノイズを 除 去 します 明 るい 領 域 を 拡 張 します 明 るい 領 域 を 縮 小 します 透 過 光 イメージから 疑 似 的 な 蛍 光 イメージを 作 成 します GCLM(Gray Level Co-occurrence Matrix)テクスチャ 変 換 します 33

34 Preprocessing で 設 定 した 処 理 は その Target の Source Image に 対 して 上 から 順 番 に 実 行 さ れます 順 番 を 変 更 するには Component Overview パネルの をクリックしてください - Flat Field Correction Flat Field Correction はシグナルが 均 一 なサンプルから 得 たリファレンスイメージを 基 に 行 う 補 正 です リファレンスイメージは 補 正 したいイメージと 同 じフィルタ/ダイクロイックミラー/ 対 物 レン ズで サンプルと 同 じ 波 長 の 蛍 光 色 素 溶 液 を 入 れたウェルを 撮 影 した 画 像 を 使 用 します リファ レンスイメージは C Program Files GE Healthcare IN Cell Developer Toolbox 1.9 IMG フォル フダに 保 存 してください Flat Field Correction を 行 うには プロトコールエクスプローラで 補 正 する Target Set の Preprocessing ノードを 右 クリックして ポップアップメニューの Insert as First Processing から Flat Field Correction を 選 択 します プロトコールエクスプローラのコンポーネント 設 定 パネルで Flat Field Image の... ボタンをクリックします Retrieve Image ダイアログで 使 用 する Flat Field Image を 選 択 して Open をクリックします Flat Field Correction をダブルクリックすると 補 正 した 結 果 が Image View Preview ウィンドウ に 表 示 されます サンプルイメージと Flat Filed Image のシグナル 強 度 が 大 きく 異 なるなど Flat Field Correction しても 補 正 が 十 分 にできない 場 合 は Offset を 10 ~ 100 を 目 安 に 入 力 してくだ さい 34

35 - Shading Removal QSM Shading Removal QSM は 各 イメージから それぞれのバックグラウンドレベルを 見 積 もり 均 一 に するフィルタです Shading Removal QSM は Flat Field Correction と 異 なりリファレンスイメージ を 必 要 としません Model シグナル 不 均 一 を 見 積 もる 方 法 として multiplicative( 乗 法 モデル)か additive( 加 法 モデル)を 選 択 します 初 期 設 定 では multiplicative が 選 択 されています Offset Value 補 正 するのに 差 し 引 かれるグレーレベルです 初 期 設 定 は 100 です % Pixels for Initial Estimation イメージ 内 のバックグラウンドピクセルの 割 合 です 初 期 設 定 は 100%で 全 てのピクセルをバックグラウンドと 見 做 して 補 正 パラメータを 評 価 します Maximum # Iterations 補 正 処 理 の 繰 り 返 し 回 数 です Save output images 補 正 したイメージを 保 存 します 保 存 先 はオリジナルイメージのイメー ジスタックフォルダ 内 の FFCQSM_Corrected フォルダです Exclude Outer-Well Area 低 倍 率 レンズでウェル 壁 を 含 めた 1 ウェル 全 体 を 撮 影 したイメー ジを 補 正 する 場 合 に 使 用 します チェックした 場 合 ウェル 内 の 領 域 を 補 正 します Differential Well Radius イメージに 写 ったウェル 壁 の 外 側 と 内 側 の 間 のピクセル 数 を 入 力 します Fill Non-Mask Region with Mean BG Intensity Exclude Outer-Well Area オプションが 選 択 されているときに ウェル 外 領 域 をバックグラウンドの 平 均 シグナル 強 度 に 置 き 換 えます 35

36 - Shading Removal Shading Removal は 各 イメージに 強 いスムージングフィルタをかけてシグナルの 強 弱 を 均 したも のから 陰 影 パターンを 除 きます Flat Field Correction と 異 なりリファレンスイメージを 必 要 としま せん 500 pixels pixels - Denoising (gradient) Denoising (gradient) は 隣 接 するピクセルの 強 度 差 ( 勾 配 )によって 加 重 してスムージングを 実 行 します オブジェクトの 境 界 部 分 のようにシグナル 強 度 の 勾 配 が 急 な 領 域 よりも バックグラウ ンド 部 分 のように 勾 配 が 緩 やかな 領 域 でより 強 くスムージングがかかります Denoising (gradient) のパラメータの Kernel Size はスムージング 処 理 するときの 平 均 するピクセル 数 を 指 定 します Kernel Size を 大 きくすると スムージングの 効 果 が 大 きくなります (a) オリジナルイメージ (b) Kernel Size = 3 (C) Kernel Size = 15 36

37 - Denoise (isotropic diffusion) Denoising (isotropic diffusion) は Iteration で 指 定 した 回 数 のスムージングを 繰 り 返 すことによ ってノイズを 除 去 します オブジェクトの 境 界 部 分 のようにシグナル 強 度 の 勾 配 が 急 な 領 域 より も バックグラウンド 部 分 のように 勾 配 が 緩 やかな 領 域 でより 強 くスムージングがかかります (a) オリジナルイメージ (b) Iteration = 9 (c) Iteration = 36 - Denoising (anisotropic diffusion) Denoising (anisotropic diffusion) はエッジのような 特 徴 のある 部 分 を 強 調 します この 操 作 で はまず Kernel Size よりも 細 かい 陰 影 をノイズとしてスムージングを 実 行 します さらにそのスムー ジングを Iteration で 指 定 した 回 数 繰 り 返 します Kernel size - Kernel Size を 大 きくするほどスムージングが 強 くかかります Iteration - スムージングの 繰 り 返 し 回 数 です (a) オリジナルイメージ (b) Kernel Size = 9, Iterations = 9 (c) Kernel Size = 9, Iterations = 36 37

38 - Denoising (CWT) ウェーブレット 変 換 によってオブジェクトのエッジを 保 ったままイメージからノイズを 除 去 します 主 要 な 部 分 には 大 きく 影 響 することなく 微 細 な 強 弱 を 取 り 除 くことで 結 果 としてオブジェクトの 境 界 のようなはっきりした 構 造 は 残 したままイメージのざらつきが 改 善 されます - Dilation Dilation はグレーイメージの 明 るい 部 分 を 広 げて 暗 いディテールを 減 少 あるいは 除 きます 結 果 としてシグナルの 高 いピクセルの 領 域 (Target)が 大 きくなり Target 領 域 内 のシグナルが 低 い 部 分 は 縮 小 します Kernel Shape Kernel の 形 状 を Circle と Square から 選 択 します Kernel Size Kernel Size を 大 きくするほど Dilation の 効 果 が 大 きくなります (a) オリジナルイメージ (b) Kernel Size = 3 (c) Kernel Size = 9 38

39 - Erosion グレーイメージの 暗 い 部 分 を 広 げて 明 るいディテールを 減 少 あるいは 除 きます 結 果 としてシグ ナルの 高 いピクセルの 領 域 (Target)が 小 さくなり ごく 小 さい Target は 除 かれます Kernel Shape Kernel の 形 状 を Circle と Square から 選 択 します Kernel Size Kernel Size を 大 きくするほど Erosion の 効 果 が 大 きくなります (a) オリジナルイメージ (b) Kernel Size = 3 (c) Kernel Size = 9 - Pseudo Fluorescence 明 視 野 イメージは 蛍 光 イメーとは 逆 に オブジェクトがある 領 域 が 暗 くなり 何 も 無 い 領 域 が 明 るくなります Segmentation アルゴリズムはシグナルが 高 い 領 域 を 認 識 するので そのままでは Segmentation 処 理 することができません 明 視 野 イメージから Target の 認 識 を 行 うには オブ ジェクトの 領 域 が 明 るい 蛍 光 タイプのイメージに 変 換 する 必 要 があります(Pseudo Fluorescence = 擬 似 蛍 光 ) Pseudo Fluorescence で Preprocessing した 明 視 野 イメージは 通 常 の 蛍 光 イメージのように Segmentation できます Pseudo Fluorescence は 透 過 光 イメージのコントラストの 傾 きを 反 転 した 擬 似 蛍 光 イメージを 作 成 します 39

40 Method - ドロップダウンリストから この 処 理 の 後 に 行 う Segmentation で 認 識 したいオブジェ クトの 種 類 に 応 じて 選 択 します Nuclear 核 のような 円 形 のオブジェクトを 強 調 します Edge オブジェクトの 境 界 を 強 調 します Texture オブジェクトの 粗 さ 滑 らかさの 違 いを 強 調 します Note: Pseudo Fluorescence 処 理 したイメージの Segmentation は Object segmentation が 有 効 です 元 のイメージ(A)に 対 して Object segmentation を 適 用 した 場 合 の 認 識 結 果 (B)と Pseudo Fluorescence を 行 った 後 で Object segmentation を 適 用 した 場 合 の 認 識 結 果 (C)です A B C Sensitivity - 処 理 したイメージのコントラストが 増 減 します Deshading radius アーティファクト( 上 の 図 のような 黒 いスジなど そのイメージから 除 かれる) の 大 きさを 増 減 します この 値 を 大 きくすると イメージのノイズは 除 かれますが ソフトウェアの 処 理 時 間 は 長 くなり 小 さいオブジェクトは 無 視 されます Edge filter radius オブジェクトのエッジを 識 別 するためにシグナル 強 度 のコントラストを 検 出 するフィルタの 設 定 です 値 を 小 さくすると エッジがはっきりしますが イメージのノイズに 対 する 感 度 が 高 くなります Neighborhood radius 隣 接 するオブジェクトのエッジ 識 別 の 設 定 です 値 を 小 さくするとイメ ージは 詳 細 なものになり 大 きくすると 大 まかになります - Texture Transformation GCLM(Gray Level Co-occurrence Matrix)テクスチャで 変 換 します 下 の 9 種 類 の 変 換 タイプが あります それぞれの 変 換 効 果 は Kernel Size で 調 整 します GLCM P_max GLCM Contrast GLCM Homogeneity GLCM Mean GLCM Energy GLCM Entropy Standard Deviation Coefficient of Variation <cos2> 40

41 Postprocessing Postprocessing は Segmentation ステップで 2 値 化 したイメージに 対 して 行 う 処 理 です Postprocessing で 利 用 できるアルゴリズムは Clump Breaking Dilation Erosion Sieve などです Postprocessing は 必 要 に 応 じて 全 ての Target Set に 対 して 行 うことができます また 1 つの Target Set に 対 して 複 数 の Postprocessing を 行 うことも 可 能 です Postprocessing を 行 った 結 果 は Postprocessing に 追 加 した 処 理 をダブルクリックすると Image View Preview ウィンドウに 表 示 されます 複 数 の Postprocessing が 設 定 されている 場 合 その 処 理 は 上 から 順 番 に 行 われます Target Set の 最 終 的 な 認 識 は Postprocessing の 最 後 に 行 っている 処 理 の 結 果 です - Postprocessing の 追 加 Target Set の 認 識 に Postprocessing ステップを 組 み 込 むには Component Overview に 表 示 さ れるプロトコールプロトコールツリーで その 処 理 を 行 う Target Set の 下 の Postprocessing ノード を 右 クリックします 表 示 されるポップアップメニューの Insert as First Postprocess から 実 行 する 処 理 を 選 択 します Component Overview の 下 に 選 択 した 操 作 の 設 定 パネルが 表 示 されます 必 要 に 応 じてパラメ ータの 変 更 を 行 ってください Postprocessing を 追 加 する 場 合 は 既 に 設 定 されている 操 作 を 右 クリックしてポップアップメニ ューの Insert After Current Postprocess から 追 加 する 操 作 を 選 択 します また 複 数 の Postprocessing が 設 定 されている 場 合 ノードを 選 択 して Component Overview パネル 内 にあ る アイコンで 実 行 する 順 番 を 変 更 できます Dilation (Binary) Erosion (Binary) Sieve (Binary) Clump Breaking Watershed Clump Breaking Watershed Clump Breaking (With Seed) Fill Holes Border Object Removal 認 識 した 領 域 を 拡 張 します 認 識 した 領 域 を 縮 小 します 認 識 した Target の 面 積 でふるいをかけます 認 識 した 領 域 を 他 の Target の 情 報 で 分 割 します 認 識 した 領 域 をシグナル 強 度 で 分 割 します 認 識 した 領 域 を 他 の Target とシグナル 強 度 の 情 報 で 分 割 します 認 識 領 域 で 囲 まれたバックグラウンド 領 域 を 穴 埋 めします フィールドの 端 にかかった Target を 除 きます 41

42 - Dilation (Binary) Dilation は 認 識 された 領 域 の 境 界 線 の 外 側 のピクセルを 認 識 領 域 に 変 換 します Dilation を 行 うことにより 認 識 領 域 は 大 きくなります Kernel Size - Dilation のパラメータ Kernel Size は Dilation で 広 げる 領 域 の 大 きさを 規 定 します Kernel Size を 大 きくするほど 認 識 された Target の 領 域 は 大 きくなります (a) オリジナル (b) Kernel size = 3 (c) Kernel size = 9 - Erosion (Binary) Erosion は 認 識 された 領 域 の 境 界 線 の 内 側 のピクセルを 認 識 領 域 から 除 きます Erosion を 行 うことにより 認 識 領 域 は 小 さくなります Kernel Size - Erosion のパラメータ Kernel Size は Erosion で 縮 める 領 域 の 大 きさを 規 定 します Kernel Size を 大 きくするほど 認 識 された Target の 領 域 は 小 さくなります (a) オリジナル (b) Kernel size = 3 (c) Kernel size = 9 42

43 - Sieve Sieve は 認 識 されたオブジェクトの 中 から ノイズやアーティファクトを 除 くために 使 用 します Sieve 処 理 することにより 設 定 した 面 積 に 含 まれないオブジェクトは 除 かれます Keep targets with an area - Target として 残 す 認 識 オブジェクトの 条 件 を 設 定 します 面 積 (μm 2 )を 入 力 して less than less than or equal to greater than greater than or equal to のいずれかを 選 択 します 不 必 要 な 小 さいオブジェクトを 除 く 場 合 は Keep target with an area で greater than を 選 択 して 面 積 を 入 力 します Before Sieve process After Sieve process - Clump Breaking 細 胞 が 密 集 したイメージから 細 胞 ごとの 数 値 を 解 析 するためには 個 々の 細 胞 を 分 けて 認 識 す ることが 必 要 です Clump Breaking は 2 つ 以 上 の Target がある 場 合 に 一 方 の Target の 認 識 領 域 を もう 一 方 の 認 識 領 域 の 情 報 で 分 割 します 例 えば 核 染 色 と 細 胞 質 染 色 を 行 ったサン プルで つながった 領 域 を 核 を 基 点 として 分 割 することで 個 々の 細 胞 領 域 に 分 割 します この 細 胞 領 域 はそれぞれの 核 から 等 距 離 にある 線 で 分 割 されます Before process After process 43

44 Clump Breaking 設 定 パネルには 以 下 のパラメータがあります: Second Segmentation - Clump Breaking の 基 点 となる Target Set を 選 択 します Include secondary targets Clump Breaking で 分 割 した 領 域 に 基 点 とした Target の 領 域 を 含 める 場 合 にチェックします Radius - Include secondary targets をチェックしている 場 合 に 基 点 の Target の 領 域 を Radius で 設 定 した 分 だけ 拡 大 した 領 域 を 含 めます - Watershed Clump Breaking Clump Breaking が 2 つ 以 上 の Target の 一 方 を Seed にして もう 一 方 の Target の 認 識 領 域 を 分 割 するのに 対 して Watershed Clump Breaking は 1 つの Target 内 で 相 対 的 にシグナルが 低 い 部 分 (シグナルの 谷 間 )で 分 割 します - Watershed Clump Breaking (With Seed) 2 つ 以 上 の Target がある 場 合 に 一 方 を Seed にしてもう 一 方 の Target の 認 識 領 域 を 分 割 しま す 分 割 はシグナル 強 度 を 反 映 して 行 われます - Fill Holes 認 識 領 域 で 囲 まれた 領 域 を 穴 埋 めします - Border Object Removal フィールドの 端 の Target を 除 きます Remove object touching borders フィールドの 端 に 接 した Target を 除 きます Remove object within distance from borders フィールド 端 から 一 定 範 囲 の Target を 除 き ます 端 からの 距 離 は Distance にピクセル 数 で 設 定 します(1 100 ピクセル) All borders フィールドのすべての 辺 を 処 理 対 象 にします Left/Top/Right/Bottom - フィールドの 指 定 した 辺 を 処 理 対 象 にします 44

45 Target Linking Target Linking は 各 Target Set を 関 連 付 ける 操 作 です 例 えば 細 胞 体 と 顆 粒 を Target Set として 認 識 している 場 合 細 胞 体 と 顆 粒 をリンクさせることによってそれぞれを 1 つの 細 胞 の 中 の 細 胞 体 / 顆 粒 領 域 として 解 析 できます Target Linking していないと 各 Target は 独 立 したオブジェクトとして 扱 われるため 細 胞 あたりの 顆 粒 の 数 などを 測 定 することができません - Target linking の 作 成 プロトコールエクスプローラの Target Linking ノードを 右 クリックして ポップアップメニューの Create a Link between Targets からリンクの 方 法 を 選 択 します Target Linking を 設 定 するには 少 なくとも 2 つの Target Set が 定 義 されている 必 要 があります One to one 核 と 細 胞 体 などのように 1 対 1 で 対 応 する Target Set をリンクさせます One to many 細 胞 質 の 中 にある 複 数 の 細 胞 内 小 器 官 のように 1 つ Target とその 中 に 含 まれる 複 数 の Target をリンクします Composed one to one 2 つの Target Linking を 組 み 合 わせます 例 えば 核 と 細 胞 質 のリンク 細 胞 質 と 細 胞 内 小 器 官 のリンクを 組 み 合 わせることによって 核 と 細 胞 質 と 細 胞 内 小 器 官 の 3 つの Target Set をリンクできます 少 なくとも 2 つの Target Linking が 設 定 されている 必 要 があります 45

46 - Target Linking の 設 定 Primary target set プルダウンリストから 1 つ 目 の Target Set を 選 びます One to many リンクの 場 合 は Primary target set が One に 該 当 します Secondary target set プルダウンリストから 2 つ 目 の Target Set を 選 びます One to many リンクの 場 合 は Secondary target set が Many に 該 当 します Criteria Overlap( 認 識 領 域 が 重 なっていること)している Target をリンクします Output Target Set リンクした Target Set の 名 称 です デフォルトでは New Linking となっています 例 えば 核 と 細 胞 では Nuc_Cell などの 名 称 にします What is overlap Target リンクでは 2 つの Target が 認 識 した 領 域 が Overlap している 場 合 に その Target をリンクさせます ここでは Overlap の 条 件 を 設 定 します Find any matched target/find any matched secondary target via the following in order One to One Link で 1 つの Primary target set に 対 して 2 つ 以 上 の Secondary target set がオーバーラップした 場 合 Secondary target set の 内 の 1 つを 選 択 してリンクします Find any matched target 最 初 に Primary target に 接 した Target をリンクします Find any matched secondary target via the following in order 選 択 した 反 転 基 準 に 従 ってリンクします 判 定 基 準 は 次 の 3 つです 46

47 Full overlap vs partial overlap: 重 なった 領 域 の 割 合 が 高 い Target Large overlap area vs tiny overlap area: 重 なった 領 域 の 面 積 が 大 きい Target Big target vs small overlap: Target の 面 積 が 大 きい Target Allow multiple primary targets to share the same secondary targets 1 つの Secondary target に 対 して 2 つ 以 上 の Primary target がオーバーラップしている 場 合 このボックスがチェックされていれば その Secondary target は 複 数 の Primary target にリンクできます チェックを 外 すと その Secondary target はオーバーラップした Primary target の 中 で 最 初 に 認 識 されたものとリンクします Display measures within primary target set Target table で Primary target set で 選 択 した Target に 関 する 測 定 値 と Target Linking に 関 する 測 定 値 を 並 べて 表 示 します リンクを 作 成 すると Target Sets にリンク 設 定 の Output Target Set に 入 力 した 名 称 で 新 しい Target Set が 追 加 されます この Target には Segmentation などの 項 目 はなく Measures ノー ドだけが 設 定 可 能 です Target リンクを 設 定 し たことで 追 加 された Target Set Target リンクの 設 定 47

48 Measure IN Cell Developer Toolbox は 予 め 設 定 されている 数 値 化 項 目 から 選 ぶだけでなく 目 的 のアプリケ ーションに 合 せて 自 分 で 数 式 を 設 定 することによって 極 めて 柔 軟 性 の 高 い 数 値 化 を 実 行 できます Measures は 設 定 されている 各 Target Set に 対 して 行 うことができます 例 えば Nuclei と Cell という Target Set があり これらをリンクした Nuc_Cell が 設 定 されている 場 合 Target Set Cell の Measures で 設 定 をすると Cell で 認 識 された Target が 対 象 になり Nuc_Cell で 設 定 をすると Nuc と Cell 両 方 の Target がある 領 域 が 対 象 になります - Measures の 設 定 User defined measure の 設 定 数 値 化 をする Target Set の Measures ノードをクリックします ユーザー 定 義 の 計 算 式 を 作 成 するには Measurement パネルの 空 白 部 分 を 右 クリックして ポップアップメニューから Add User Defined を 選 択 します Edit User Defined Measure ダ イアログで 数 式 を 設 定 します 48

49 Edit User Defined Measure ダイアログ Measure name 数 式 の 名 称 を 入 力 します Description には 必 要 に 応 じてコメントを 記 入 します Measures/Functions - このセクションには 数 式 に 組 み 込 むことができる 既 定 の Measures/Functions がリストアップされています Measures/Functions と 数 字 / 数 学 記 号 のボタンを 使 って 数 式 を 構 築 していきます 構 築 した 数 式 は Measure Equation フィールド に 表 示 されます 数 式 に 組 み 込 むには Measures/Functions のリスト 中 から 目 的 のものを 選 んでダブルクリックします Measures/Functions フィールドの 上 にある Advanced をチェッ クすると リストに 表 示 される Measures/Functions の 種 類 が 増 えます Label/SPath 計 算 を 実 行 するチャネルや Target を 指 定 します 数 式 内 では< >で 表 わ されます Label: 数 式 内 で 測 定 するチャネルを 指 定 します Target Path: Target Set を 指 定 します Target Linking を 設 定 していて リンクした Target に 対 して 計 算 を 行 う 場 合 は Label/SPath フィールドの Advanced をチェックします 例 えば Cell と Granules を One to many リンクし て Target リンク Cell_Granules が 設 定 されている 場 合 は 次 のように 表 示 されます 49

50 Granules を 持 つ Cell に 対 して Measure を 設 定 する 場 合 の Target path は <\Cell_Granules\Cell> Cell に 含 まれる Granules に 対 して Measure を 設 定 する 場 合 の Target path は <\Cell_Granules\Granules> もしくは <\Cell_Granules\All:Granules> と なります Summary の 設 定 Measurements パネルにリストアップされた 数 式 から Count( 個 数 ) Sum( 合 計 ) Max( 最 大 値 ) Min( 最 小 値 ) Mean( 平 均 値 ) Median( 中 央 値 ) Std( 標 準 偏 差 )を 計 算 します 何 も 設 定 しない 場 合 は Summary は 計 算 されず Target が 個 々に 数 値 化 されます 設 定 するには Summary を 計 算 する 数 式 をクリックして その 行 の Statistical Function の 列 をクリックします ドロップダウンリストから 計 算 する Summary を 選 択 します 解 析 を 行 うと Summary が 計 算 されて 結 果 が Summary table に 表 示 されます Summary と 個 々の Target のデータの 両 方 が 必 要 な 場 合 または 複 数 の 異 なるサマリーデ ータが 必 要 な 場 合 は Measurements パネルに 同 じ 数 式 を 必 要 なだけ 加 えます 50

51 - Basic Measures Densities Dens Target の 平 均 シグナル 強 度 Target 領 域 に 含 まれるピクセルの 平 均 シグナル 強 度 です - Dens - Levels: グレーレベル イメージの 明 るい 部 分 が 高 い 値 となります 蛍 光 イメージの 強 度 を 表 わします - Dens - ROD: 相 対 的 な 光 学 密 度 グレーレベルの 逆 数 で イメージの 暗 い 部 分 が 高 い 値 となります 透 過 光 イメージの 吸 光 度 の 強 さを 表 わします DxA シグナル 強 度 面 積 Target 領 域 内 の 平 均 シグナル 強 度 に Target の 面 積 (ピクセル 数 )をかけたもので Target の 総 蛍 光 量 を 表 わします Spatial Area Target の 面 積 認 識 された Target の 境 界 線 の 内 側 にあるピクセル 数 によって 面 積 を 計 算 します 境 界 線 上 のピクセルは 面 積 に 含 まれません Length Target の 長 さ Target の 境 界 線 から もう 一 方 の 境 界 線 をつなぐ 直 線 で 最 も 長 い 横 断 線 の 長 さです S 字 の Target では 先 端 から 先 端 をつないだ 直 線 の 長 さになります Form factor Target の 真 円 率 Form factor は 真 円 度 の 指 標 となる 値 で 面 積 に 対 する 周 囲 の 長 さに 関 連 します 複 雑 な ( 長 い) 形 状 の Target は 真 円 度 が 小 さくなります Form factor は 0 から 1 の 値 をとり 完 全 な 円 の 場 合 は 1 となります Avg Diameter Target の 平 均 直 径 曲 線 の 弦 に 垂 直 な 線 の Target 内 の 長 さの 平 均 値 です Pos X Target の 位 置 (X 軸 ) イメージの 左 端 を 基 点 とした Target の 重 心 の 水 平 方 向 (X 軸 )の 位 置 です Pos Y Target の 位 置 (Y 軸 ) イメージの 下 端 を 基 点 とした Target の 重 心 の 垂 直 方 向 (Y 軸 )の 位 置 です Fiber length - 繊 維 状 の 形 態 の Target の 長 さ Branch Nodes - 繊 維 状 の 形 態 の Target の 分 岐 点 の 数 Crossing Points - 繊 維 状 の 形 態 の Target の 交 差 点 の 数 Count Count Target の 数 - Advanced Measures Density, Median Density, Mode Density 51

52 Dens シグナル 強 度 ( 平 均 値 ) 認 識 された Target 内 ピクセルのシグナル 強 度 の 平 均 値 です Median Dens シグナル 強 度 ( 中 央 値 ) 認 識 された Target 内 ピクセルのシグナル 強 度 の 中 央 値 です Mode Dens シグナル 強 度 ( 最 頻 値 ) 認 識 された Target 内 ピクセルのシグナル 強 度 の 最 頻 値 です - Levels: グレーレベル イメージの 明 るい 部 分 が 高 い 値 となります 蛍 光 イメージの 強 度 を 表 わします - ROD: 相 対 的 な 光 学 密 度 グレーレベルの 逆 数 で イメージの 暗 い 部 分 が 高 い 値 となります 透 過 光 イメージで 吸 光 度 の 相 対 的 強 さ 表 わします Std Dev (Standard Deviation) 認 識 された Target 内 ピクセルのシグナル 強 度 の 標 準 偏 差 です Median of Absolute Deviation シグナル 強 度 の 絶 対 偏 差 中 央 値 中 央 値 前 後 のばらつきを 測 定 します Density Related Measures DxA 平 均 シグナル 強 度 (Density) 面 積 (Area) 平 均 シグナル 強 度 は 認 識 された Target 内 ピクセルのシグナルの 平 均 値 なので DxA は Target の 合 計 シグナルを 表 わします Basic Morphometry Measures Area Target の 面 積 認 識 された Target の 境 界 線 の 内 側 にあるピクセル 数 によって 面 積 を 計 算 します 境 界 線 上 のピクセルは 面 積 に 含 まれません Perimeter Target の 周 囲 長 認 識 された Target の 境 界 線 の 長 さです 通 常 Target の 境 界 線 は 滑 らかではなく またデ ジタル 処 理 によるアーティファクトにより 実 際 よりも 長 くなります そのため Perimeter の 測 定 ではスムージング 補 正 した 境 界 線 の 長 さを 測 ります Form factor Target の 真 円 率 Form factor は 真 円 度 の 指 標 となる 値 で 面 積 に 対 する 周 囲 の 長 さに 関 連 します 複 雑 な ( 長 い) 形 状 の Target は 真 円 率 が 小 さくなります Form factor は 0 から 1 の 値 をとり 完 全 な 円 の 場 合 は 1 となります Feret X X( 水 平 ) 方 向 の 最 大 長 Feret Y Y( 垂 直 ) 方 向 の 最 大 長 Length Target の 長 さ Target の 境 界 線 から もう 一 方 の 境 界 線 をつなぐ 直 線 で 最 も 長 い 横 断 線 の 長 さです S 字 の Target では 先 端 から 先 端 をつないだ 直 線 の 長 さになります 52

53 Clipped Perimeter Clipped Perimeter ではイメージの 端 に 接 しているピクセルを 含 まな い Target の 周 囲 長 (Perimeter) tperimeter 総 周 囲 長 (Total Perimeter) ドーナツ 状 のオブジェクトを 認 識 したときなど Target の 内 部 に 穴 空 間 がある 場 合 に 内 部 の 境 界 線 も 含 んだ 長 さを 測 定 します Clipped tperimeter イメージの 端 に 接 しているピクセルを 含 めない Target の 総 周 囲 長 (Total Perimeter) Weighted Relative Moment of Inertia 円 形 の Target のシグナル 強 度 (グレーレベル) の 均 一 性 の 指 標 数 値 が 1 より 大 きい 場 合 は 明 るいピクセルの 割 合 が Target の 中 心 で 高 く 1 より 小 さい 場 合 は Target の 周 辺 部 で 高 くなります Major Axis Length Target の 長 軸 の 長 さ Minor Axis Length Target の 短 軸 の 長 さ Major Axis Angle 水 平 面 に 対 する 長 軸 の 角 度 Chord Chord( 弦 )は Target の 内 側 を 横 切 る 最 長 の 線 です 直 線 と 屈 曲 に 沿 った 線 の 両 方 が 利 用 できます Max chord - straight 弦 の 長 さ( 直 線 ) 円 形 などの 単 純 な 形 状 の Target の 弦 の 長 さを 測 定 する 場 合 は Max chord - straight を 選 択 します S 字 や U 字 形 Target の 弦 の 測 定 には 不 向 きです Max chord curved 弦 の 長 さ( 曲 線 ) S 字 や U 字 など 曲 がりくねった 形 状 の Target の 弦 を 測 定 する 場 合 に 使 用 します Target の 屈 曲 に 沿 った 弦 の 長 さを 測 定 できます Chord Angle - 水 平 面 に 対 する 直 線 の 弦 の 角 度 です Diameter Diameter( 直 径 )は 屈 曲 弦 に 垂 直 な 直 線 を 引 いた 場 合 の 弦 から 境 界 線 までの 距 離 です 真 円 形 の Target では Chord と Diameter の 値 は 一 致 します Avg Diameter 直 径 ( 弦 の 垂 線 )の 平 均 値 Median Diameter 直 径 ( 弦 の 垂 線 )の 中 央 値 Max Diameter 直 径 ( 弦 の 垂 線 )の 最 大 値 Circ Diameter Target と 同 じ 面 積 の 円 の 直 径 Position Target の 位 置 情 報 を 基 点 からの 距 離 ( 例 えば m)で 表 わします ピクセルのキャリブレーシ ョン 情 報 が 無 い 場 合 はピクセル 数 で 表 わされます 53

54 Pos X イメージの 左 端 を 基 点 とした Target の 重 心 の 水 平 方 向 (X 軸 )の 位 置 Pos Y イメージの 下 端 を 基 点 とした Target の 重 心 の 垂 直 方 向 (Y 軸 )の 位 置 wpos X シグナル 強 度 の 重 心 の 水 平 方 向 (X 軸 )の 位 置 wpos Y シグナル 強 度 の 重 心 の 垂 直 方 向 (Y 軸 )の 位 置 wpos X min 領 域 内 で 最 も 低 いシグナル 強 度 を 引 いた 後 の wposx wpos Y - min 領 域 内 で 最 も 低 いシグナル 強 度 を 引 いた 後 の wposy Scan Area Count Target の 数 Fiber Related Measures Fiber length - 繊 維 状 の 形 態 の Target の 長 さ End Nodes - 繊 維 状 の 形 態 の Target の 末 端 の 数 Branch Nodes - 繊 維 状 の 形 態 の Target 分 岐 点 の 数 Crossing Points - 繊 維 状 の 形 態 の Target の 交 差 点 の 数 Total Area Fiber Length - 繊 維 状 の 形 態 の Target の 長 さの 合 計 Total Area End Nodes - 繊 維 状 の 形 態 の Target の 総 末 端 数 Total Area Branch Nodes - 繊 維 状 の 形 態 の Target の 総 分 岐 点 数 Total Area Crossing Points - 繊 維 状 の 形 態 の Target の 総 交 差 点 数 Fiber Relative Moment of Inertia - 繊 維 状 形 態 の Target の 分 散 の 想 定 測 定 値 が 1 の 場 合 は Target の 中 心 からの 分 岐 が 無 い あるいはわずかであることを 示 します 値 が 1 よりも 小 さい 場 合 中 心 近 くで 分 岐 があることを 示 します 1 よりも 大 きい 場 合 は 中 心 から 離 れた 箇 所 で 分 岐 があり 値 が 大 きいほど 距 離 が 離 れていることを 示 します 54

55 Measure の 設 定 例 - Target をカウントする 核 のカウント Target Set Nuclei をカウントしてフィールドごと ウェルごとの 合 計 を 算 出 します 1. Target Set Nuclei の Measures ノードをクリックします 2. Measurements for Nuclei 設 定 パネルで 空 白 部 分 を 右 クリックして Add User Defined を 選 択 します 3. Edit User Defined Measure ダイアログで Measure name に 任 意 の 名 称 例 えば Nuclei count と 入 力 します 4. Measures/Functions の Count の 項 目 にある [Count] をダブルクリックします 5. Label/SPath の Target Path の 項 目 にある <\Nuclei> をダブルクリックします 55

56 6. Measure Equation には [Count<\Nuclei>] と 入 力 されます 7. OK をクリックして Edit User Defined Measure ダイアログを 閉 じます 8. Measurements for Nuclei パネルに 設 定 した Measure Nuclei count が 加 わります 9. Nuclei count をクリックしてから その 行 の Statistical Function の 列 をクリックして プ ルダウンリストから Sum を 選 択 します 核 を 持 つ 細 胞 のカウント Target Set Nuclei と Cell を One to one リンクした Nuc_Cell を 設 定 して Nuclei 領 域 と Cell 領 域 の 一 部 が 重 なっている Target をカウントしてフィールドごと ウェルごとの 合 計 を 算 出 します リンクした Target を 対 象 とすることにより Nuclei と Cell のどちらか 一 方 で 認 識 されたノイズを 解 析 対 象 から 省 くことができます One to One リンクした Target を 数 える 場 合 は Nuclei と Cell のどちらを 数 えても 同 じ 値 になります 1. Target Set Nuc_Cell の Measures ノードをクリックします 2. Measurements for Nuc_Cell 設 定 パネルで 空 白 部 分 を 右 クリックして Add User Defined を 選 択 します 3. Edit User Defined Measure ダイアログで Measure name に 任 意 の 名 称 例 えば Cell count と 入 力 します 56

57 4. Measures/Functions の Count の 項 目 にある [Count] をダブルクリックします 5. Label/SPath の Advanced にチェックを 入 れて Target Path の 項 目 にある <\Nuc_Cell\Cell> をダブルクリックします この 場 合 は <\Nuc_Cell\Nucleil> としても 同 じ 値 が 出 ます <\Nuc_Cell\Cell> は \Nuc_Cell が Target Linking Nuc_Cell を 表 す Path \Cell が Nuc_Cell に 含 まれる Cell を 表 す Path です 6. Measure Equation には [Count<\Nuc_Cell\Cell>] と 入 力 されます 7. OK をクリックして Edit User Defined Measure ダイアログを 閉 じます 8. Measurements for Nuclei パネルに 設 定 した Measure Cell count が 加 わります 9. Cell count をクリックしてから その 行 の Statistical Function の 列 をクリックして プル ダウンリストから Sum を 選 択 します 細 胞 内 のグラニュールのカウント Target Set Nuclei と Cell を One to One リンクした Nuc_Cell と Cell と Granules を One to Many リンクした Cell_Granules を Composed One to One リンクし て Nuc_Cell_Granules を 設 定 します 3 つの Target をリンクすることにより 核 と 細 胞 体 と 顆 粒 がセットになった Target のみが 対 象 になります 1. Target Set Nuc_Cell_Granules の Measures ノードをクリックします 57

58 2. Measurements for Nuc_Cell_Granules 設 定 パネルで 空 白 部 分 を 右 クリックして Add User Defined を 選 択 します 3. Edit User Defined Measure ダイアログで Measure name に 任 意 の 名 称 例 えば Granules count と 入 力 します 4. Measures/Functions の Count の 項 目 にある [Count] をダブルクリックします 5. Label/SPath の Advanced にチェックを 入 れて Target Path の 項 目 にある <\Nuc_Cell_Granules\All:Granules> をダブルクリックします One to Many で Target Linking すると Target Linking の Path の 後 の Secondary target の Path が 2 つでき ます( 例 では Granules と All:Granules) Primary target に 含 まれる 複 数 の Secondary target を 計 算 対 象 にするには All:~を 選 択 します 6. Measure Equation には [Count<\Nuc_Cell_Granules\All:Granulesl>] と 入 力 されます Target Linking Nuc_Cell_Granules に 含 まれる Cell の 中 のすべての Granules の 数 を 数 える 数 式 です 7. OK をクリックして Edit User Defined Measure ダイアログを 閉 じます 58

59 8. Measurements for Nuclei パネルに 設 定 した Measure Granules count が 加 わりま す この 状 態 で 細 胞 ごとの Granules の 個 数 が 算 出 されます 9. フィールドごととウェルごとの Granules 合 計 数 を 算 出 するには Measurements for Nuc_Cell_Granules 設 定 パネルで 空 白 部 分 を 右 クリックして Add を 選 択 します 10. Measures Selection ダイアログで User Defined の 項 目 にある Granules count を 選 択 して Add をクリックします 11. OK をクリックすると 同 じ 内 容 の Measure が 2 つ 設 定 されることになるため Duplicate Measure Information ダイアログが 表 示 されます ここで Statistical Function のプル ダウンリストから Sum を 選 んで OK をクリックします 細 胞 あたりの 平 均 グラニュールカウント Target Set Nuclei と Cell を One to One リンクした Nuc_Cell と Cell と Granules を One to Many リンクした Cell_Granules を Composed One to One リンクし て Nuc_Cell_Granules を 設 定 します 3 つの Target をリンクすることにより 核 と 細 胞 体 と 顆 粒 がセットになった Target のみが 対 象 になります 細 胞 あたりの Granules の 平 均 個 数 といった 場 合 分 母 を 総 細 胞 数 とするか Granules を 含 む 細 胞 数 とするかで Measure の 設 定 方 法 が 異 なります 59

60 Granules 数 /Granules を 持 つ 細 胞 数 1. Target Set Nuc_Cell_Granules の Measures ノードをクリックします 2. Measurements for Nuc_Cell_Granules 設 定 パネルで 空 白 部 分 を 右 クリックして Add User Defined を 選 択 します 3. Edit User Defined Measure ダイアログで Measure name に 任 意 の 名 称 例 えば Granules count per positive cell と 入 力 します 4. Measures/Functions の Count の 項 目 にある [Count] をダブルクリック 次 に Label/SPath の Advanced にチェックを 入 れて Target Path の 項 目 にある <\Nuc_Cell_Granules\All:Granules> をダブルクリックします 5. Measure Equation には [Count<\Nuc_Cell_Granules\All:Granulesl>] と 入 力 されます カーソルを[]の 右 側 に 移 動 させて 数 字 / 記 号 のボタンにある / を クリックします 6. OK をクリックして Edit User Defined Measure ダイアログを 閉 じます 7. Measurements for Nuclei パネルに 設 定 した Measure Granules count per positive cell が 加 わります これをクリックしてから その 行 の Statistical Function の 列 をクリッ クして プルダウンリストから Mean を 選 択 します Granules 数 / 総 細 胞 数 Granules 数 は Target Linking Nuc_Cell_Granules で 総 細 胞 数 は Target Linking Nuc_Cell で 計 算 します 1 つの 数 式 の 中 に 複 数 の 異 なる Target path が 含 まれる 場 合 Summary のみ 計 算 が 可 能 です 1. 数 式 は 分 母 にあたる Target で 設 定 します Target Set Nuc_Cell の Measures ノード をクリックします 2. Measurements for Nuc_Cell_Granules 設 定 パネルで 空 白 部 分 を 右 クリックして Add User Defined を 選 択 します 3. Edit User Defined Measure ダイアログで Measure name に 任 意 の 名 称 例 えば Granules count per total cell と 入 力 します 4. Measures/Functions の Count の 項 目 にある [Count] をダブルクリック 次 に Label/SPath の Advanced にチェックを 入 れて Target Path の 項 目 にある <\Nuc_Cell_Granules\Granules> をダブルクリックします 5. Label/SPath の Grouping の 項 目 にある Sum をダブルクリックします Measure Equation には [Count<\Sum:Nuc_Cell_Granules\Granulesl>] と 入 力 されます カーソルを [ ] の 右 側 に 移 動 させて 数 字 / 記 号 のボタンにある / をクリックします 6. Measures/Functions の Count の 項 目 にある [Count] をダブルクリック 次 に Label/SPath の Target Path の 項 目 にある <\Nuc_Cell\Cell> をダブルクリックします 60

61 7. Label/SPath の Grouping の 項 目 にある Sum をダブルクリックします Measure Equation には [Count<Sum: \Nuc_Cell_Granules\Granulesl>] / [Count<Sum: \Nuc_Cell\Cell>] と 入 力 されます 8. OK をクリックして Edit User Defined Measure ダイアログを 閉 じます Measurements for Nuclei パネルに 設 定 した Measure Granules count per total cell が 加 わります これをクリックしてから その 行 の Statistical Function の 列 をクリックし て プルダウンリストから Mean を 選 択 します - Target の 面 積 を 出 す 核 や 細 胞 の 面 積 Target Set Nuclei と Cell を One to one リンクした Nuc_Cell を 設 定 して Nuclei 領 域 と Cell 領 域 の 一 部 が 重 なっている Target の Nuclei や Cell の 面 積 を 算 出 します リンク した Target を 対 象 とすることにより Nuclei と Cell のどちらか 一 方 で 認 識 されたノイズを 解 析 対 象 から 省 くことができます 1. Target Set Nuc_Cell の Measures ノードをクリックします 続 いて Measurements for Nuc_Cell 設 定 パネルで 空 白 部 分 を 右 クリックして Add User Defined を 選 択 します 2. Edit User Defined Measure ダイアログで Measure name に 任 意 の 名 称 例 えば Nuc area や Cell area と 入 力 します 3. Measures/Functions の Spatial の 項 目 にある [Area] をダブルクリックします 4. Label/SPath の Advanced にチェックを 入 れます 核 領 域 の 面 積 の 場 合 は Target Path の 項 目 にある <\Nuc_Cell\Nuclei> をダブルクリックします 細 胞 領 域 の 面 積 の 場 合 は <\Nuc_Cell\Cell> をダブルクリックします 61

62 5. Measure Equation には [Area<\Nuc_Cell\Nuclei>] もしくは [Area<\Nuc_Cell\Cell>] と 入 力 されます 6. OK をクリックして Edit User Defined Measure ダイアログを 閉 じます 7. Measurements for Nuclei パネルに 設 定 した Measure Nuc area もしくは Cell area が 加 わります 8. フィールドごととウェルごとの 平 均 面 積 を 算 出 するには Measurements for Nuc_Cell 設 定 パネルで 空 白 部 分 を 右 クリックして Add を 選 択 します 9. Measures Selection ダイアログで User Defined の 項 目 にある Nuc area や Cell area を 選 択 して Add をクリックします 10. OK をクリックすると 同 じ 内 容 の Measure が 2 つ 設 定 されることになるため Duplicate Measure Information ダイアログが 表 示 されます ここで Statistical Function のプル ダウンリストから Mean を 選 んで OK をクリックします 62

63 細 胞 内 のグラニュールの 面 積 Target Set Nuclei と Cell を One to One リンクした Nuc_Cell と Cell と Granules を One to Many リンクした Cell_Granules を Conmpsed One to One リンクし て Nuc_Cell_Granules を 設 定 します 3 つの Target をリンクすることにより 核 と 細 胞 体 と 顆 粒 がセットになった Target のみが 対 象 になります 1. Target Set Nuc_Cell_Granules の Measures ノードをクリックします 続 いて Measurements for Nuc_Cell_Granules 設 定 パネルで 空 白 部 分 を 右 クリックして Add User Defined を 選 択 します 2. Edit User Defined Measure ダイアログで Measure name に 任 意 の 名 称 例 えば Granule area と 入 力 します 3. Label/SPath の Advanced にチェックを 入 れます Measures/Functions の Spatial の 項 目 にある [Area] をダブルクリックして 続 けて Target Path の 項 目 にある <\Nuc_Cell_Granules\All:Granules> をダブルクリックします 63

64 4. Measure Equation には [Area<\Nuc_Cell_Granules\All:Granules>] と 入 力 されます All:~ は One to Many リンクしている Target パスで 現 れる 選 択 項 目 で 1 つの Primary target set に 含 まれるすべての Secondary target set を 意 味 します この 例 では Target Set Cell と Granules を One to Many リンクしているので All:Granules は 1 つの Cell に 含 まれる Granules を 表 し この 式 で 算 出 されるのは 1 つの Cell に 含 まれ る Granules の 平 均 面 積 です 5. 1 つの Cell に 含 まれる Granules の 総 面 積 を 算 出 するには 上 の 式 に Cell に 含 まれる Granules の 個 数 を 乗 じます カーソルを [ ] の 右 側 に 移 動 させて 数 字 / 記 号 のボタン にある * をクリックします 6. Measures/Functions の Count の 項 目 にある [Count] をダブルクリックして 続 けて Target Path の 項 目 にある <\Nuc_Cell_Granules\All:Granules> をダブルクリックしま す 7. Measure Equation には [Area<\Nuc_Cell_Granules\All:Granules>] * [Count<\Nuc_Cell_Granules\All:Granules] と 入 力 されます 8. OK をクリックして Edit User Defined Measure ダイアログを 閉 じます 9. Measurements for Nuclei パネルに 設 定 した Measure Granules area が 加 わります 10. フィールドごととウェルごとの 平 均 面 積 を 算 出 するには Measurements for Nuc_Cell_Granules 設 定 パネルで 空 白 部 分 を 右 クリックして Add を 選 択 します 11. Measures Selection ダイアログで User Defined の 項 目 にある Granules area を 選 択 して Add をクリックします 64

65 12. OK をクリックすると 同 じ 内 容 の Measure が 2 つ 設 定 されることになるため Duplicate Measure Information ダイアログが 表 示 されます ここで Statistical Function のプル ダウンリストから Mean を 選 んで OK をクリックします - Target のシグナル 強 度 を 出 す Density と DxA 蛍 光 シグナルの 強 さを 表 す 数 値 には 主 に Dens Levels と DxA の 2 つが 用 いられます Dens Levels は Target の 1 ピクセルあたりの 平 均 グレーレベルです グレーレベルはシグナ ル 強 度 のスケールで イメージの 表 示 ビット 数 により 異 なります 12 ビットでは ビットでは の 範 囲 になります DxA は[Dens Level] x [Area]で Target の 蛍 光 量 を 表 します 核 領 域 のシグナル 強 度 Target Set Nuclei の Dens Levels を 算 出 します 1. Target Set Nuclei の Measures ノードをクリックします 続 いて Measurements for Nuclei 設 定 パネルで 空 白 部 分 を 右 クリックして Add を 選 択 します 65

66 2. Measures Selection の Densities の 項 目 にある Dens Levels を 選 択 して Add をク リックします 3. フィールドごととウェルごとの 平 均 シグナル 強 度 を 算 出 するには Measurements for Nuclei 設 定 パネルで 空 白 部 分 を 右 クリックして Add を 選 択 します 4. Measures Selection の Densities の 項 目 にある Dens Levels を 選 択 して Add をク リックします 5. OK をクリックすると 同 じ 内 容 の Measure が 2 つ 設 定 されることになるため Duplicate Measure Informationダイアログが 表 示 されます Statistical Functionのプルダウンリ ストから Mean を 選 んで OK をクリックします 6. Measurements for Nuclei パネルの Dens Levels の From Image の 列 は 通 常 その Target の Source Image が 選 択 されています この 状 態 では 核 染 色 した 蛍 光 色 素 の 蛍 光 強 度 が 数 値 化 されます 7. 例 えばすべての 細 胞 核 を Hoechst で 染 色 して 特 定 の 核 にあるタンパク 質 を FITC 標 識 抗 体 で 染 色 していたり 死 細 胞 の 核 を PI 染 色 していたりする 場 合 に Hoechst イメ ージで 認 識 した Nuclei 領 域 の FITC や PI の 蛍 光 強 度 を 求 めることができます 8. Measurements for Nuclei パネルの Dens Levels の 行 を 選 択 して From Image のカ ラムをクリックします プルダウンリストから 蛍 光 強 度 を 算 出 したいイメージを 選 択 しま す 66

67 細 胞 領 域 の 蛍 光 量 Target Set Nuclei と Cell を One to One リンクした Nuc_Cell で Cell 領 域 の 蛍 光 量 (DxA)を 数 値 化 します 1. Target Set Nuc_Cell の Measures ノードをクリックします 続 いて Measurements for Nucl_Cell 設 定 パネルで 空 白 部 分 を 右 クリックして Add User Defined を 選 択 します 2. Edit User Defined Measure ダイアログで Measure name に 任 意 の 名 称 例 えば Cell intensity x area と 入 力 します 3. Label/SPath の Advanced にチェックを 入 れます Measures/Functions の Densities の 項 目 にある [DxA] をダブルクリックして 続 けて Label/SPath の Target Path の 項 目 にある <\Nuc_Cell\Cell> をダブルクリックします 4. Measures Equation には [DxA<\Nuc_Cell\Cell>] と 入 力 されます 5. この Measure で 算 出 されるのは Target ごとの 蛍 光 量 です Target ごとの 値 と Summary の 両 方 が 必 要 な 場 合 は Measurements for Nuc_Cell 設 定 パネルで 空 白 部 分 を 右 クリックして Add を 選 択 します 6. Measures Selection ダイアログで User Defined の 項 目 にある Cell intensity x area を 選 択 して Add をクリックします Duplicate Measure Information ダイアログで Statistical Function のプルダウンリストから Mean や Sum などを 選 択 します 7. Summary のみ 必 要 な 場 合 は Measurements for Nuc_Cell の Cell intensity x area を 選 択 して その 行 の Statistical Function カラムのプルダウンから Mean や Sum などを 選 択 します 67

68 8. Measurements for Nuc_Cell パネルの Cell intensity x area の 行 を 選 択 して From Image のカラムをクリックします プルダウンリストから 蛍 光 強 度 を 算 出 したいイメージ を 選 択 します 顆 粒 の 蛍 光 量 Target Set Nuclei と Cell を One to One リンクした Nuc_Cell と Cell と Granules を One to Many リンクした Cell_Granules を Composed One to One リンクし て Nuc_Cell_Granules を 設 定 します 3 つの Target をリンクすることにより 核 と 細 胞 体 と 顆 粒 がセットになった Target のみが 対 象 になります 1. Target Set Nuc_Cell_Granules の Measures ノードをクリックします 続 いて Measurements for Nuc_Cell_Granules 設 定 パネルで 空 白 部 分 を 右 クリックして Add User Defined を 選 択 します 2. Edit User Defined Measure ダイアログで Measure name に 任 意 の 名 称 例 えば Granules intensity x area と 入 力 します 3. Label/SPath の Advanced にチェックを 入 れます Measures/Functions の Densities の 項 目 にある [DxA] をダブルクリックして 続 けて Target Path の 項 目 にある <\Nuc_Cell_Granules\All:Granules> をダブルクリックします 4. Measure Equation には [DxA<\Nuc_Cell_Granules\All:Granules>] と 入 力 されます All:~ は One to Many リンクしている Target パスで 現 れる 選 択 項 目 で 1 つの Primary target set に 含 まれるすべての Secondary target set を 意 味 します この 例 では Target Set Cell と Granules を One to Many リンクしているので All:Granules は 1 つの Cell に 含 まれる Granules を 表 し この 式 で 算 出 されるのは 1 つの Cell に 含 まれ る Granules の 平 均 蛍 光 量 です 5. 1 つの Cell に 含 まれる Granules の 総 蛍 光 量 を 算 出 するには 上 の 式 に Cell に 含 まれ る Granules の 個 数 を 乗 じます カーソルを [ ] の 右 側 に 移 動 させて 数 字 / 記 号 のボ タンにある * をクリックします 6. Measures/Functions の Count の 項 目 にある [Count] をダブルクリックして 続 けて Target Path の 項 目 にある <\Nuc_Cell_Granules\All:Granules> をダブルクリックしま す 7. Measure Equation には [<DxA\Nuc_Cell_Granules\All:Granules>] * [Count<\Nuc_Cell_Granules\All:Granules] と 入 力 されます 8. OK をクリックして Edit User Defined Measure ダイアログを 閉 じます 9. Measurements for Nuclei パネルに 設 定 した Measure Granules intensity x area が 加 わります 68

69 10. この Measure で 算 出 されるのは Target ごとの 蛍 光 量 です Target ごとの 値 と Summary の 両 方 が 必 要 な 場 合 は Measurements for Nuc_Cell_Granules 設 定 パネ ルで 空 白 部 分 を 右 クリックして Add を 選 択 します 11. Measures Selection ダイアログで User Defined の 項 目 にある Granules intensity x area を 選 択 して Add をクリックします Duplicate Measure Information ダイアログで Statistical Function のプルダウンリストから Mean や Sum などを 選 択 します 12. Summary のみ 必 要 な 場 合 は Measurements for Nuc_Cell_Granules の Granules intensity x area を 選 択 して その 行 の Statistical Function カラムのプルダウンから Mean や Sum などを 選 択 します 13. Measurements for Nuc_Cel_Granules パネルの Granules intensity x area の 行 を 選 択 して From Image のカラムをクリックします プルダウンリストから 蛍 光 強 度 を 算 出 し たいイメージを 選 択 します 69

70 Classifiers Target ごとに 算 出 した 数 値 に 対 して 閾 値 を 設 定 して Target 全 体 をサブグループに 分 けることができ ます Target ごとに 算 出 した 数 値 とは 解 析 後 に Target Table に 表 示 される 数 値 のことです Summary のみ 算 出 しているプロトコールプロトコールプロトコールではこの 機 能 は 使 用 できません 例 えばマーカータンパク 質 の 発 現 ( 蛍 光 量 )が 閾 値 よりも 高 い Positive 群 と 閾 値 より 低 い Negative 群 に 分 けたり DNA 量 ( 核 染 色 の 蛍 光 量 )などから 細 胞 周 期 のフェーズ 分 けをしたり さらに 分 けたグルー プごとに 集 計 を 行 うことができます グループ 分 けのためのフィルタ 設 定 を 行 うにはコントロールウェルもしくは 全 体 の 解 析 を 行 って Target table に 数 値 が 表 示 された 状 態 で 行 ってください Protocol Explorer の Classifiers ノードをクリックし て Classifiers 設 定 パネルの 空 白 部 分 を 右 クリックします 表 示 されるメニューから 使 用 するフィルタタイプを 選 択 してください New Threshold: New Linear Discriminant: New Decision Tree: ヒストグラムに 対 して 閾 値 を 設 定 して 2 つのグループに 分 けます 散 布 図 に 対 して 閾 値 を 設 定 して 2~4 つのグループに 分 けます 2 つのグループに 分 けるフィルタ(Threshold または Scatter Plot)を 組 み 合 わせて 2 分 決 定 木 で 複 数 のグループに 分 けます - Threshold New Threshold を 選 択 すると Threshold 設 定 ウィンドウが 開 きます Title にフィルタの 名 称 を 入 力 してください デフォルトでは New Threshold です Measure: の... をクリックすると その 解 析 プロトコールプロトコールプロトコールで Target ごとに 算 出 し ている Measure の 一 覧 が 表 示 されます ヒストグラムの 横 軸 とする Measure を 選 んで Select を クリックします 横 軸 が 選 択 した Measure 縦 軸 が 細 胞 数 のヒストグラムが 表 示 されます above に 閾 値 を 入 力 して Enter キーを 押 します(above の 他 にプルダウンリストから below または in range が 選 択 できます) ヒストグラム 中 に 入 力 した 閾 値 を 表 す 直 線 が 現 れます 70

71 Graph ボタンでヒストグラムの 横 軸 の 表 示 レンジや Bin の 幅 を 変 更 できます Classes ボタンをクリックすると このフィルタで 分 けたクラスの 名 称 とテーブルやイメージ 上 でグ ループを 表 す 色 /シンボルが 変 更 できます Color の 変 更 : カラーのボックスを 右 クリックして 表 示 されるリストから 選 択 します Class の 変 更 : クラスの 名 称 部 分 をダブルクリックすると 入 力 可 能 状 態 になります Symbol の 変 更 : シンボルの 表 記 部 分 をダブルクリックすると 入 力 可 能 状 態 になります 71

72 - Linear Discriminant New Linear Discriminant を 選 択 すると Scatter Plot 設 定 ウィンドウが 開 きます Title にフィルタの 名 称 を 入 力 してください デフォルトでは New Linear Discriminant です X と Y の... をクリックすると その 解 析 プロトコールプロトコールで Target ごとに 算 出 している Measure の 一 覧 が 表 示 されます プロットの X 軸 Y 軸 とする Measure をそれぞれ 選 びます X 軸 Y 軸 で 選 択 できるのは 同 じ Target もしくは 同 一 のリンク 内 で 設 定 した Measure だけです 下 の 例 で は X: Granules area と Y: Granules intensity と い う 選 択 は で き ま す が X: Cell intensity x area と Y: Granules intensity という 選 択 はできません X 軸 Y 軸 の Measure の 数 値 でプロットされた 散 布 図 が 表 示 されます 散 布 図 中 のドットをクリックすると Target Table でその Target の 数 値 がハイライトされ Image View でアウトラインが 表 示 されます 72

73 イメージや 数 値 を 確 認 しながら 散 布 図 中 の 閾 値 の 直 前 をクリック&ドラックして 移 動 してください 直 線 の 位 置 が 決 まったら Refresh ボタンをクリックします Graph ボタンをクリックすると X 軸 Y 軸 の 表 示 を 変 更 できます Classes ボタンをクリックするとクラス 分 けの 種 類 クラスの 名 称 とテーブルやイメージ 上 でグル ープを 表 す 色 /シンボルが 変 更 できます 1/2: 1 本 の 閾 値 で 2 つのグループに 分 けます 1/2/3: 2 本 に 閾 値 で 3 つのグループに 分 けます 1/2/3/4: 交 差 する 2 本 の 閾 値 で 2~4 つのグループに 分 けます 分 け 方 は で 変 更 できます 73

74 - Decision tree New Decision tree を 選 択 すると Decision tree 設 定 ウィンドウが 開 きます Title にフィルタの 名 称 を 入 力 してください デフォルトでは New Decision Tree です パネル 内 に 2 分 するフィルタノードを 複 数 作 成 して それらを 樹 状 につなげていきます Start node T: スタートノードとして 使 用 する Threshold フィルタです Start node S: スタートノードとして 使 用 する Scatter Plot フィルタです Node T: 2 つ 目 以 降 のノードとして 使 用 する Threshold フィルタです Node S: 2 つ 目 以 降 のノードとして 使 用 する Scatter Plot フィルタです まず Start node S または Start node T で Target Set 全 体 を 2 分 します どちらかのノードのアイ コンをクリック&ドラッグしてパネル 内 にドロップします 74

75 ノードを 右 クリックして Edit node をクリックします Threshold もしくは Scatter Plot 設 定 ウィンドウ が 開 きます Measure を 選 択 して 閾 値 を 設 定 してください 次 の 図 は Start node T で P 群 と N 群 に 分 けた 状 態 です Node T または Node S で Start node で 2 分 したグループをさらに 分 割 します どちらかのノード のアイコンをクリック&ドラッグしてパネル 内 にドロップします Start node でさらに 分 割 するグループのシンボルをクリック&ドラッグして 矢 印 の 先 端 を Node 上 でドロップします ノードを 右 クリックして Edit node をクリックします Threshold もしくは Scatter Plot 設 定 ウィンドウ が 開 きます Measure を 選 択 して 閾 値 を 設 定 してください 必 要 に 応 じてノードを 追 加 してグループを 分 けてください 75

76 - Group summary Classifiers でグループ 分 けして 解 析 したデータは Group summary 機 能 を 用 いて 集 計 できま す 1. Desktop の Group Summary ショートカットアイコンをダブルクリックします Group Summary アイコン 2. Group Summary ウィンドウの File メニューから Open Analysis Data を 選 び Classifiers を 設 定 したプロトコールプロトコールで 解 析 して 保 存 した.xml ファイルを 開 きます 3. Definition タブを 開 きます Measure のカラムには そのプロトコールプロトコールで Target ごとに 算 出 した 項 目 (Target table で 表 示 される 数 値 )のリストが 表 示 されてい ます 76

77 4. Group by プルダウンリストから Classifiers で 設 定 したフィルタを 選 択 して 集 計 データが 必 要 な 項 目 にチェックをチェックします 5. Summary タブを 開 くと Definition タブの 設 定 に 従 って 集 計 されたデータが 表 示 され ます 集 計 結 果 は File メニューの Export Excel Summary でファイル 出 力 できます 77

78 Macro Transform 機 能 では Preprocessing や Postprocessing にはない 画 像 処 理 を 行 うことができます Transform ウィンドウでは Addition/Subtraction/Inversion など Segmentation の 前 後 に 適 用 できる 様 々なフィルタを 設 定 して その 処 理 設 定 を Macro として 保 存 できます 保 存 した Macro は Preprocessing もしくは Postprocessing に 組 み 込 んで 使 用 できます ここでは Target Set Cell の 認 識 領 域 から Nuclei の 認 識 領 域 を 差 し 引 いて Cytoplasm 領 域 を 認 識 する ための 設 定 を 例 に Macro の 使 用 方 法 について 説 明 します - Macro の 作 成 認 識 結 果 の 出 力 チャネルの 変 更 通 常 Target Set に 対 する 処 理 結 果 は Image View - Preview ウィンドウに 出 力 され 次 の 処 理 が 行 われると 更 新 されます 細 胞 領 域 から 核 領 域 を 差 し 引 くような 処 理 を 行 うためには Macro による 処 理 が 行 われるまで Target Set Cell と Nuclei の 認 識 結 果 を 残 しておく 必 要 があります 1. いずれかの Target Set の Image( 励 起 蛍 光 フィルタの 名 称 )をクリックします 設 定 パネルの All Images タブではプロトコールプロトコール 内 で 行 っているすべての 画 像 処 理 (Preprocessing - Segmentation - Postprocessing)のリストが 表 示 されています 2. 処 理 結 果 の Output は default(image View - Preview ウィンドウ)に 設 定 されています Target Set 'Nuclei' 領 域 の 認 識 結 果 を 変 更 する 場 合 Nuclei に 対 して 行 った 最 後 の 処 理 の Output カラムをクリックして プルダウンリストから 出 力 するチャネルを 選 択 しま す 78

79 3. 出 力 チャネルには 使 用 していないチャネルを 選 択 してください 例 えば 2 波 長 撮 影 し たデータで Fused Image を 表 示 していた 場 合 Ch1 と Ch2 は 各 波 長 のイメージ 表 示 Ch3 は Fused Image の 表 示 Ch4 は Preview の 表 示 に 使 用 されるため 出 力 チャネ ルは Ch5 以 降 に 設 定 します 4. 同 じように Target Set Cell 領 域 の 認 識 結 果 も 空 いているチャネルに 変 更 します 例 で は Nuclei の 結 果 を Ch5 Cell の 結 果 を Ch6 に 変 更 しています Transform Macro として 記 録 する Point operation/filters を 行 い 処 理 結 果 を 確 認 します パラメータ がある 処 理 の 場 合 は 設 定 を 確 認 / 変 更 します 1. Operations パネルの Transform アイコンをクリックします Transform アイコン 2. Transform で 実 行 できる 操 作 は Point operation と Filters のリストにあります いずれ かのリストから 画 像 処 理 に 使 用 する 操 作 を 選 択 してください 79

80 Point operations #Addition #Subtraction #Combine-Max #Combine-Min #Normalization #Arithmetic (One Src) #Arithmetic (Two Src) Average Coincident Average Copy Inversion Maximize Contrast Horizontal Flip Vertical Flip Remove Black Border Histogram Equalization Information Equalization Binarize Adds two images together. Subtract one image from another. Find the maximum calibrated density value of two images. Find the minimum calibrated density value of images or targets. Normalize images to density calibration values from another image. Apply arithmetic equation to density data from a single image. Click on the Modify button to define equation. Apply arithmetic equation to density data from two source images. Click on the Modify button to define equation. Averages a set of two or more images together. Specify the channel numbers for the first and last images in the set. Averages a set of two or more images acquired with the equal camera exposure times. Pixels that are more than 3.09 standard deviation from the mean are ignored. This reduces the influence of cosmic rays. Specify the channel numbers for the first and last images in the set. Copies images and/or overlays to another location. Click on the Modify button to specify which component(s) to copy. Inverts pixel gray level. Enhances image contrast. Flips images and/or overlays in horizontal axis. Flips images and/or overlays in vertical axis. Find the non-zero area of an image, and redefine the image size. Maximize image contrast by flattening the gray level histogram. Optimize image contrast by maximizing information content in gray level histogram. Converts image density values into black or white. 80

81 Filters Target Accent Detail Extractor Smooth Median Enhancement Laplacian Sobel/ Approx Sobel Prewitt/ Approx Prewitt Kirsch Max/Dilation Min/ Erosion Closing Opening Thinning Pruning No Neighbor Deblur/ Nearest Neighbor Deblur Dagenais Local Arithmetic/ Two Scale Local Arithmetic Power Spectrum Sieve Granular Segmentation Accentuates contrast between small targets and larger background objects. Enhances local detail in regions of low contrast. Removes image grain noise and smoothes sharp edges. Removes image gain noise. Enhances image detail. Detects edges. Detects edges. Detects edges. Detects edges. Erodes dark targets and dilates light targets. Erodes light targets and dilates dark targets. Dilation followed by erosion. Dilation makes light objects smoother and larger. Erosion reverts object to its original size, but smoothness is retained. Erosion followed by dilation. Erosion makes dark objects smoother and larger. Dilation reverts object to its originalsize, but smoothness is retained. Reduces bright objects to a central skeleton. Removes protrusions from the edges of objects. Remove blurring effects inherent to microscopes. Enhances local detail in regions of low contrast. Applies an arithmetic function that may use a local and/or global mean as a variable. Produces an image that depicts the energy distribution of the source image in the Fourier frequency domain. Uses a size threshold to filter segmented targets. Only those targets that pass the size requirement are included in subsequent analysis. Isolates granular or particulate objects from other image features. Output image is a binarized version of detected granules. 3. 選 択 した 処 理 の 元 イメージと 処 理 結 果 を 出 力 するチャネルを Source と Destination にそれぞれ 入 力 します この 例 の#Subtraction の 場 合 は Source1 から Source2 を 引 いた 結 果 を Destination に 出 力 します 81

82 4. Apply ボタンをクリックすると 処 理 結 果 が Destination で 指 定 したチャネルに 出 力 さ れます Image View ウィンドウのチャネル 数 よりも 大 きいチャネルを Destination にして いる 場 合 は Settings メニューの Display format で Total # of channels/total # of views を 変 更 してください 5. 変 更 可 能 なパラメータがある 処 理 は Modify ボタンをクリックして Kernel size などの 変 更 を 行 うことができます 変 更 した 場 合 は 再 度 Apply をクリックして 結 果 を 確 認 してく ださい Macro の 記 録 Transform ウィンドウで 行 う 操 作 を Macro として 記 録 します Macro の 記 録 や 編 集 はメイン メニューバーの Macro メニューで 行 うことができます Macro メニューが 表 示 されていない 場 合 は Settings メニューの More のリストにある Macro Utilities をチェックしてください 82

83 1. Macro メニューの Start Recording を 選 択 します 2. Macro recording ダイアログに 記 録 する Macro の 名 称 を 入 力 して OK をクリックします これ 以 降 に 行 った 画 像 処 理 が Macro として 保 存 されます 3. Transform ウィンドウで 実 行 する 処 理 と Source/Destination を 設 定 して Apply ボタン をクリックします 4. 複 数 の 処 理 を 連 続 して 行 う 場 合 は 処 理 の 選 択 と Source/Destination の 設 定 をして Apply ボタンをクリックしてください 5. 必 要 な 処 理 を 行 ったら Macro メニューの Stop Recording をクリックします Macro の 編 集 作 成 した Macro のチャネル 選 択 やパラメータは 必 要 に 応 じて 変 更 できます 1. Macro メニューの Edit を 選 択 して Macro Editor を 開 きます Macro recording で 記 録 した Macro は Standard グループに 保 存 されています 編 集 したい Macro をダブルク リックします 2. Macro 設 定 パネルに Macro の 内 容 が 表 示 されます いくつかの 処 理 を 組 み 合 わせて いる 場 合 は 複 数 のノードが 連 結 した 構 造 になります 83

84 3. 編 集 したい 処 理 ノードの 中 心 のシンボルマークをダブルクリックして 必 要 な 変 更 を 行 い ます 4. Macro Editor の Macro メニューの Save もしくは Save as を 選 択 して 変 更 した Macro を 保 存 します 5. Exit をクリックして Macro Editor を 閉 じます - 解 析 プロトコールプロトコールへの Macro の 追 加 作 成 した Macro は Preprocessing または Postprocessing で 行 う 処 理 としてプロトコールプロト コール 内 で 使 用 できます 1. その 処 理 を 行 う Target Set の Preprocessing/Postprocessing ノードを 右 クリックして ポップアップメニューの Add Preprocess/Postprocess Macro を 選 択 します 例 では Target Set Cytoplasm の Preprocessing で Macro を 追 加 しています 2. Preprocessing ノードの Run Preprocess Macro をクリックして Setting パネルでブラウ ズボタン... をクリックして プロトコールプロトコールに 組 み 込 む Macro を 指 定 しま す 3. Setting パネルの Channel カラムで Output のチャネルを Macro 処 理 の Destination 84

85 チャネルに 合 わせます 4. Macro の 結 果 として Preprocessing で 2 値 化 されたイメージができる 場 合 Segmentation は Intensity を 選 択 して Minimum threshold を 1 より 大 きくします 85

86 Spotfire DecisionSite Spotfire DecisionSite は 解 析 によって 算 出 された 多 数 の 数 値 を 可 視 化 するためのツールです Developer Toolbox で 解 析 したデータは Spotfire Connect を 使 って Spotfire DescisionSite に 転 送 す ることにより Spotfire DescisionSite で 作 成 したグラフと Developer Toolbox のイメージをリンクさせ ることができます Spotfire Connect Developer Toolbox で 解 析 して 出 力 された xml ファイルを 開 き Spotfire DecisionSite に 転 送 します 解 析 終 了 後 に Developer Toolbox から 起 動 する 解 析 が 終 了 したらメインツールバーの Connect Spotfire アイコンをクリックします Connect Spotfire アイコン Spotfire Connect と Spotfire DecisionSite が 起 動 します Spotfire DecisionSite のログイン パスワードが 設 定 されている 場 合 デフォルトのパスワードは spotfire( 全 て 小 文 字 ) です Spotfire Connect の Update Spotfire DecisionSite ボタンをクリックします 86

87 デスクトップのショートカットから SFConnect.exe を 起 動 する デスクトップの Connect to Spotfire ショートカットアイコンをダブルクリックします Spotfire Connect が 開 きます Connect to Spotfire Client ボタンをクリックします Spotfire DecisionCite が 起 動 します Spotfire DecisionSite のログインパスワードが 設 定 さ れている 場 合 デフォルトのパスワードは spotfire( 全 て 小 文 字 ) です Spotfire Connect の Open XML Output File ボタンをクリックして Developer Toolbox から 出 力 された 解 析 結 果 の.xml ファイルを 開 きます Spotfire Connect の Update Spotfire DecisionSite ボタンをクリックします 87

88 グラフの 作 成 Spotfire Connect から 開 いたデータは Scatter plot 表 示 されます Spotfire のユーザーインターフェースは Plot もしくは Chart が 表 示 される Visualization ウィンドウと 表 示 す る デ ー タ を 選 択 す る Query Device ウ ィ ン ド ウ 表 示 し た デ ー タ の 情 報 が 表 示 さ れ る Details-on-Demand ウィンドウに 分 かれています 新 しい 表 示 はツールバーのアイコンもしくはメニューバーの Visualization メニューから 作 成 できます 2D Scatter Plot 3D Scatter Plot Bar Chart Pie Chart Line Chart Profile Chart Heat Map Table 88

89 - 表 示 例 Plot/Chart をウェルフォーマットで 表 示 Visualization ウィンドウ 上 でマウスを 右 クリックしてメニューから Properties を 選 択 します Properties の Trellis タブをクリックします Layout セクションの Bind dimensions to conditioning variable をチェックします Conditions セクションの Add をクリックして Variable のドロップダウンリストから WellC Bind to のドロップダウンリストから Columns を 選 択 します Show empty values のチェックを 外 し ます OK をクリックすると データがプレートの Column ごとに 分 割 されます 同 じように Conditions セクションの Add をクリックして Variable のドロップダウンリストから WellR Bind to のドロップダウンリストから Rows を 選 択 します Show empty values のチェッ クを 外 します OK をクリックすると データがプレートの Row ごとに 分 割 されます 89

90 Bar Chart を 作 成 New Bar Chart アイコンをクリックします New Bar Chart アイコン 前 述 の 方 法 でデータをウェルごとに 表 示 します 縦 軸 のメニュー Chart の 縦 軸 の ボタンをクリックするとポップアップメニューに 軸 の 表 示 で 選 択 可 能 な 項 目 のリストが 表 示 されます Count: 選 択 した Measure のデータ 数 の 合 計 です Sum: 選 択 した Measure のデータ 値 を 合 計 します Average: 選 択 した Measure のデータを 平 均 値 します Multiple Columns: 縦 軸 のメニューで 選 択 した 複 数 の Measure を 表 示 します Selected Columns: Properties の Bar Chart Columns タブで 選 択 した 複 数 の Measure を 表 示 します 90

91 横 軸 のメニュー Chart の 横 軸 の ボタンをクリックするとポップアップメニューに 軸 の 表 示 で 選 択 可 能 な 項 目 のリストが 表 示 されます (None): WellC: カラム 番 号 WellR: ロー 番 号 WellF: フィールド 番 号 WellZT: 高 さ(Z)もしくは 時 間 (T)の 番 号 target_index: 各 Target のインデックス 番 号 その 他 : 解 析 プロトコールで 設 定 した Measure のリスト Classifiers でグループ 分 けしたデータで Pie Chart を 作 成 New Pie Chart アイコンをクリックします New Pie Chart アイコン 縦 軸 のメニューから WellR を 選 択 します 横 軸 のメニューから WellC を 選 択 します 91

92 チャート 上 でマウス 右 クリックして Properties を 選 択 します Pies タブの Color セクションで By: ~のプルダウンリストから Developer Toolbox の 解 析 プロ トコールで 設 定 した Classifiers を 選 択 します( 例 では Activated) Column タブの Column リストの WellR をクリックして Scale ボタンのプルダウンリストで Reverse Sorting を 選 択 して Properties を 閉 じます 92

93 Query Devices フィールドの target_name で グループ 分 けした Target Set 以 外 のチェック を 外 します 複 数 の Summary を Heat Map 表 示 New Pie Chart アイコンをクリックします New Pie Chart アイコン 横 軸 のメニューからヒートマップ 表 示 したい Summary を 選 択 します Summary は 数 式 の 名 称 の 後 に (Sum) や (Mean) と 表 示 されています ヒートマップ 上 でマウス 右 クリックして Properties を 選 択 します 93

94 Properties の Heat Map タブの Column colors セクションで Show deselected のチェック を 外 し New ボタンをクリックします Continuous Coloring ダイアログで Templates ドロップダウンリストから Individual Auto Range を 選 択 して Close します 94

95 Properties の Heat Map タブの Column colors セクションで Column に 表 示 されている Summary のリストをすべて 選 択 して Apply ボタンをクリックします Query Devices フィールドの target_name で Summary 以 外 のチェックを 外 します 95

96 - 結 果 の 保 存 ファイルの 保 存 File メニューの Save で Spotfire Analysis File (.sfs) が 保 存 できます テンプレートの 保 存 表 示 形 式 だけをテンプレートとして 保 存 できます 保 存 の 際 に Save as type のプルダウン リストから Spotfire Template File (.sft) を 選 択 して 保 存 します 次 回 以 降 Developer Toolbox の 解 析 結 果 を 開 いた 際 に File メニューの Apply Template を 選 択 して 保 存 した テンプレートファイルを 開 くことによってそのデータに 表 示 形 式 を 適 用 できます 表 示 のエクスポート File メニューの Export で Powerpoint もしくは Word ファイルにグラフ 表 示 を 出 力 できます 96

97 Image stack transformation Image stitching Image Stitching は 同 じウェル 内 を 一 部 重 複 した 複 数 フィールド 撮 影 したイメージスタックで 撮 影 した 領 域 の 全 体 もしくは 1 部 をつなげたイメージを 作 成 する 機 能 です この 機 能 を 使 用 するためには IN Cell Analyzer 1000/2000 で 撮 影 するときに 1 ウェル 内 で 撮 影 する フィールドの 数 配 置 重 複 部 分 を 設 定 したイメージスタックが 必 要 になります Image Stitching についての 注 意 点 は 以 下 の 通 りです: ノイズの 高 いイメージではスティッチング 出 来 ない もしくはイメージがずれる 可 能 性 があります イメージが 重 複 した 領 域 に 十 分 な 要 素 が 含 まれている 必 要 があります オーバーラップ 領 域 に 細 胞 が 写 らずシグナルが 均 一 ではスティッチング 出 来 ない もしくはイメージがずれる 可 能 性 があります - スティッチイメージの 作 成 Image Stitching は Developer Toolbox のプロトコールプロトコールの 内 Image Stack Transformation に 含 まれる 機 能 です 解 析 結 果 として 既 存 のイメージスタックから 新 しいイメ ージスタックを 作 成 します す: 新 しい Image Stack Transformation プロトコールプロトコールを 作 成 する 方 法 は 以 下 の 通 りで Analysis メニューから Protocol Manager を 選 択 します Analysis Protocol Manager ダイアログで New アイコンをクリックします New Protocol Wizard が 開 きます New Protocol アイコン Protocol Name 欄 にプロトコールプロトコール 名 を 入 力 して Next をクリックします Analysis / Protocol Method で Image stack transformation のラジオボタンをマークして Next をクリックします 97

98 Transformation type のドロップダウンリストから Image Stitching を 選 択 して Finish をクリックし ます Image Stitching Component Overview パネルが 表 示 されます Operation パネルの View / Analyze Image Stack ボタンをクリックして スティッチングするイメー ジスタックファイルを 開 きます View / Analyze Image Stack アイコン 98

99 λ フィールドのドロップダウンリストから 表 示 する 波 長 ( 撮 影 チャネル)を 1 つ 選 択 します イメージスタックウィンドウで 特 定 のウェルを 右 クリックして メニューから Well Layout を 選 択 する と λ で 選 択 したチャネルのウェルレイアウトが 表 示 されます 99

100 - Image stitching プロトコールプロトコールのパラメータ 設 定 Component Overview パネルの Value 欄 のドロップダウンリストから 選 択 するか 数 値 を 入 力 す ることによりプロトコールプロトコールのパラメータを 変 更 することが 出 来 ます Area: イメージスタックの 中 でスティッチングするイメージセットを 定 義 します All すべてのイメージを 合 成 します Region 取 得 したイメージの 一 部 をスティッチングします パラメータ Top Bottom Left Right 内 容 スティッチングする 領 域 の 上 端 のWell Layoutで 表 示 される 行 数 スティッチングする 領 域 の 下 端 のWell Layoutで 表 示 される 行 数 スティッチングする 領 域 の 左 端 のWell Layoutで 表 示 される 列 数 スティッチングする 領 域 の 右 端 のWell Layoutで 表 示 される 列 数 上 記 パラメータは Well Layout ウィンドウでスティッチングする 領 域 をクリック&ドラッグして 選 択 してから Well Layout ウィンドウの Update region parameters アイコンをクリックする と 変 更 できます Update region parameters 100

101 例 えば 上 のように 3 行 2 列 領 域 のスティッチングを 行 う 場 合 の Region パラメータは 以 下 のようになります Layout: 何 枚 のイメージにスティッチングするか 定 義 します One tile Area で 定 義 した 領 域 を 1 枚 のイメージにします Several tiles Area で 定 義 した 領 域 を 分 割 してスティッチングします 各 タイルの 大 きさは 行 列 数 で 定 義 します 例 えば Rows=2 Columns=2 とした 場 合 2x2=4 フィールドを 1 タイルとして 複 数 のタイル が 作 成 されます Output zoom (%): 作 成 される 合 成 イメージのファイルサイズを 縮 小 することが 出 来 ます このパラメータを 50(%)とすると 100%でスティッチングした 場 合 に 比 べて で 1/4 サイ ズになります スティッチング 後 のファイルサイズが 大 きすぎるときに 使 用 してください 解 像 度 も 1/4 になりますので 注 意 してください Reference channel: スティッチングの 基 準 となるチャネルが 指 定 できます 各 々のチャネルで 個 別 にスティッチングする 場 合 は Self 1 つのチャネルを 基 準 にする 場 合 はそのチャネルを 選 択 します Min correlation は の 間 で 設 定 できます 101

102 デフォルトで 0.2 に 設 定 されています オーバーラップ 部 分 に 細 胞 が 写 っていないなどスティ ッチングするための 情 報 が 少 なく イメージが 作 成 されない 場 合 は 値 を 大 きくします Max Output Image Size (MB)はスティッチングしたイメージの 上 限 を 規 定 します デフォルトでは 40MB と 設 定 されており スティッチングしたイメージ 1 枚 のファイルサイズが これよりも 大 きくなる 場 合 には 警 告 が 出 てファイルが 作 成 されません 作 成 するイメージファイルの 上 限 を 40MB よりも 大 きくすることは 可 能 ですが Developer Toolbox で 解 析 可 能 なイメージのファイルサイズは 解 析 プロトコールプロトコールの 内 容 に より 異 なります 作 成 されるファイルサイズで 目 的 の 解 析 が 行 えることを 確 認 してください イメージスタックに 対 してスティッチングを 行 うには Analyze アイコンをクリックして Analyze entire stack を 選 択 します Analyze アイコン プロトコールプロトコールが 実 行 されて オリジナルのイメージスタックフォルダ 内 に Stitching_ プ ロトコールプロトコール 名 のサブフォルダが 作 成 されます このサブフォルダ 内 にスティッチング されたイメージファイルとイメージスタックファイルが 保 存 されます 作 成 されたイメージスタック ファイルは Developer Toolbox もしくは IN Cell Workstation で 解 析 することが 出 来 ます 例 えば s1 というプロトコールプロトコールでスティッチングすると サブフォルダ Stitching_s1 フォ ルダに 新 しいイメージスタックファイルが 作 成 されます 同 じプロトコールプロトコールを 実 行 する と ファイルは 上 書 きされます 102

103 Extended focus Extended Focus プロトコールプロトコールは Z スタックイメージから 2-D イメージを 作 成 できます 厚 み/ 高 さのあるサンプルで 全 体 のフォーカスが 合 ったイメージが 作 成 できます - Extended Focus プロトコールプロトコールの 作 成 方 法 : 1. Analysis メニューから Protocol Manager を 選 択 します 2. Analysis Protocol Manager ダイアログで [New] アイコンをクリックします New Protocol Wizard が 開 くのでプロトコールプロトコール 名 を 入 力 して [Next] をクリック します 3. Analysis/Protocol Method で [Image stack transformation] にマークして [Next] をクリックします 4. Image Stack Transformation ダイアログの Transformation type でドロップダウンリス トから [Extended focus] を 選 択 して [Finish] をクリックします Operation バーの [View / Analyze Image Stack] アイコンをクリックして Extended Focus Transformation するイメージスタックを 開 きます 103

104 - Extended Focus プロトコールプロトコールのパラメータ 設 定 Extended focus Component Overview パネルで プロトコールプロトコールの 設 定 を 変 更 できま す パラメータ 内 容 Mask size フォーカスを 評 価 する 際 の 隣 接 する 周 囲 のピクセル 数 : 目 的 とするオブジェクトの 最 小 サイズ 程 度 の 大 きさが 適 当 です Power Combination mode Weighting のべき 乗 数 : Combination modeが Weighting の 場 合 に フォーカスの 合 っ たピクセルへかかる 重 みのべき 乗 数 です Focus measure type フォーカスを 評 価 する 関 数 の 選 択 : Variance Square of gradient Combination mode 出 力 イメージを 作 成 する 際 の 複 数 のZセクションイメージの 入 力 値 の 定 義 : Weighting - 入 力 イメージを 加 重 合 計 します 加 重 は Power のべき 乗 数 に 比 例 します Direct Value 最 もフォーカスがあった(Focus measureが 高 い)ピクセル 値 です Best image choice 入 力 イメージの 選 択 : Zセクションの 一 部 のセットだけを 用 いることで 処 理 時 間 が 短 縮 できます 入 力 イメージが 少 なくなる 分 結 果 イメージの 質 は 低 下 することがあります 1 or 2 - 結 果 のイメージを 作 成 するのに 必 要 なイメージ 数 を 定 義 します 25%, 50%, or 75% - 全 体 のイメージ 数 の 中 で 結 果 のイメー ジを 作 成 するのに 使 用 するイメージの 割 合 を 定 義 します フォー カスがあっているイメージが 優 先 的 に 使 用 されます All available - Zセクション 全 てのイメージを 使 用 します Extended focus transformation は オリジナルイメージスタックフォルダ 内 のサブフォルダに 新 しいイメージスタックを 作 成 します サブフォルダに 作 成 されるイメージスタックはオリジナルと 同 じ 名 称 ですが イメージの 数 が 少 104

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