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1 エダラボンによる 放 射 線 感 受 性 の 修 飾 笹 野 仲 史

2 研 究 の 背 景 高 齢 化 社 会 を 迎 えて 癌 による 死 亡 者 は 増 加 してきている 癌 の 治 療 法 には 手 術 放 射 線 治 療 化 学 療 法 があるが 近 年 は 放 射 線 治 療 や 化 学 療 法 の 占 める 割 合 が 増 えてきてお り 幅 広 く 利 用 されるようになっている 癌 の 放 射 線 治 療 においては 正 常 組 織 への 副 作 用 が 問 題 になる 場 合 があり 正 常 組 織 の 副 作 用 を 減 らしつつ 腫 瘍 組 織 の 治 療 効 率 を 上 げ ることができるように 様 々な 工 夫 がなされている その 一 つとして 照 射 装 置 を 改 善 する ことにより 達 成 される 物 理 的 方 法 がある その 中 に 定 位 照 射 があるが これは 標 的 を 正 確 に 固 定 して 三 次 元 の 多 方 向 から 照 射 することにより 病 変 部 へ 線 量 を 集 中 させる 方 法 で ある また 最 近 では IMRT(intensity modulated radiation therapy; 強 度 変 調 放 射 線 治 療 )により 病 変 部 へ 放 射 線 を 集 中 して 照 射 し 周 囲 の 正 常 組 織 への 照 射 線 量 を 極 力 減 らす 治 療 が 行 われるようになってきている(1) また 陽 子 線 のようにブラッグピークのある 放 射 線 や(2) 重 粒 子 線 などの 高 LET(linear energy transfer) 放 射 線 を 用 いることにより(3) 治 療 効 率 を 上 げることも 行 われてきている ただし 病 変 への 根 治 線 量 が 接 する 正 常 組 織 の 耐 容 線 量 を 超 える 場 合 などは 正 常 組 織 への 副 作 用 なしに 腫 瘍 を 根 治 できない このよ うな 場 合 正 常 組 織 の 放 射 線 感 受 性 を 低 下 させるか 腫 瘍 組 織 の 放 射 線 感 受 性 を 増 加 させ ることができれば 正 常 組 織 の 副 作 用 なしに 腫 瘍 を 根 治 できると 考 えられる その 一 つの 手 段 として 放 射 線 防 護 剤 放 射 線 増 感 剤 などが 考 えられている 現 在 の 放 射 線 防 護 剤 放 射 線 増 感 剤 の 現 状 を 述 べる アミフォスチンが 米 国 食 品 医 薬 品 1

3 局 (U. S. FDA; U. S. Food and Drug Administration)で 放 射 線 防 護 剤 として 唯 一 認 可 され た 薬 剤 であり 耳 下 腺 が 照 射 された 時 に 起 こる 口 腔 内 乾 燥 症 の 予 防 目 的 でのみ 保 険 使 用 が 許 可 されている(4) ただし 嘔 気 などの 副 作 用 があり 臨 床 的 に 広 く 使 用 されていないの が 現 状 である 一 方 放 射 線 増 感 剤 としては シスプラチンや 5-FU などの 抗 癌 剤 を 放 射 線 と 同 時 期 に 投 与 することにより 相 乗 効 果 があるとされており 広 く 用 いられている(5) また in vitro のレベルでは wortmannin が DNA 修 復 系 を 阻 害 することにより 放 射 線 増 感 作 用 を 示 す 薬 剤 として 知 られているが(6) 副 作 用 のため 臨 床 使 用 には 至 っていない この ように 放 射 線 防 護 剤 や 放 射 線 増 感 剤 の 開 発 は 目 覚 ましく 進 んでいるとは 言 えない 現 状 で ある 新 しい 放 射 線 防 護 剤 や 放 射 線 増 感 剤 を 開 発 するに 当 たって 放 射 線 により 細 胞 死 がどの ような 分 子 機 序 で 起 こるのか 理 解 する 必 要 があるので 現 状 で 一 般 的 に 知 られていること を 述 べる X 線 照 射 による 細 胞 死 は 直 接 効 果 間 接 効 果 の 二 つの 効 果 からなる(7) 直 接 効 果 では X 線 は 細 胞 内 の DNA などの 巨 大 分 子 を 電 離 励 起 し その 分 子 を 切 断 して 細 胞 傷 害 を 引 き 起 こす 間 接 効 果 では X 線 はまず 細 胞 内 の 水 分 子 を 励 起 させ ROS(reactive oxygen species)を 産 生 し その ROS が 細 胞 内 機 能 分 子 を 損 傷 し 細 胞 を 傷 害 する ROS は 水 があればどこでも 産 生 されるが 放 射 線 による 細 胞 死 においては 細 胞 内 で 産 生 され た ROS が 重 要 である 通 常 臨 床 的 で 放 射 線 治 療 として 使 われる 線 量 域 においては 60-70% の 細 胞 傷 害 が 間 接 効 果 によると 言 われている(8) X 線 により 引 き 起 こされる DNA 損 傷 は 2

4 1 本 鎖 切 断 2 本 鎖 切 断 塩 基 損 傷 塩 基 遊 離 架 橋 形 成 などに 分 けられる これらは 細 胞 死 や 突 然 変 異 の 原 因 となる 2 本 鎖 切 断 は 1 本 鎖 切 断 よりも 生 じにくく 10 倍 以 上 のエネ ルギーを 必 要 とするが 細 胞 にとって 致 死 的 な 障 害 となる X 線 により 致 命 的 な 傷 害 を 受 け た 細 胞 は 増 殖 死 または 間 期 死 により 細 胞 死 を 起 こす(9) 増 殖 死 は 活 発 に 細 胞 分 裂 して いる 細 胞 が 放 射 線 照 射 を 受 けた 後 に 数 回 の 分 裂 を 経 てから 死 に 至 るものであり 骨 髄 や 腸 の 幹 細 胞 腫 瘍 細 胞 培 養 細 胞 など 盛 んに 分 裂 している 細 胞 で 見 られる 間 期 死 は 間 期 にある 細 胞 が 放 射 線 照 射 を 受 けた 後 分 裂 することなく 死 に 至 るものである もはや 細 胞 分 裂 を 行 わない 神 経 細 胞 筋 細 胞 などの 分 化 した 細 胞 で 間 期 死 は 見 られ 細 胞 分 裂 してい る 細 胞 でも 分 裂 死 が 起 こる 線 量 よりもさらに 大 きな 線 量 が 与 えられると 間 期 死 が 起 こる これらを 低 感 受 性 間 期 死 という 一 方 リンパ 球 や 卵 母 細 胞 などでは 低 線 量 の 照 射 で 間 期 死 が 見 られ これを 高 感 受 性 間 期 死 として 区 別 している T 細 胞 の 大 部 分 は X 線 照 射 によ りアポトーシスと 呼 ばれる 高 感 受 性 間 期 死 を 起 こす(10, 11) アポトーシスはプログラムさ れた 細 胞 死 であり 生 体 の 恒 常 性 を 保 つために 非 常 に 重 要 であると 考 えられている ROS は 放 射 線 によるアポトーシスの 誘 導 に 重 要 であるとされており(12) 中 でもヒドロキシルラ ジカルが 最 も 重 要 であるとされている アポトーシスは 様 々な 細 胞 内 伝 達 物 質 を 介 して 起 こることが 知 られている 特 に MOLT-4 細 胞 (ヒト T 細 胞 白 血 病 細 胞 株 )においては p53 と JNK(c-Jun N-terminal kinase) の 経 路 が 放 射 線 によるアポトーシスに 関 わっていることが 示 されている (13-16) 中 でも 3

5 p53 は 非 常 によく 研 究 されている 転 写 因 子 であり その 細 胞 内 での 動 態 により 細 胞 傷 害 後 の 細 胞 の 運 命 が 変 わってくる すなわち DNA 傷 害 が 起 こった 後 p53 はリン 酸 化 される などして 安 定 化 し 蓄 積 し 多 くの 標 的 分 子 を 活 性 化 することにより アポトーシスの 促 進 や 細 胞 周 期 の 制 御 にかかわっている p53 により 活 性 化 される 標 的 分 子 に PUMA (p53-upregulated modulator of apoptosis)(17) p21 WAF1 (18)などがある PUMA はアポト ーシスを 制 御 する BH3-only protein に 属 し p53 を 介 したアポトーシスにおいて 重 要 な 役 割 を 果 たす(17, 19-21) p21 WAF1 は サイクリン 依 存 性 キナーゼ(cyclin-dependent kinase; CDK) 阻 害 剤 で 放 射 線 照 射 後 の 細 胞 周 期 制 御 特 に G1 停 止 に 重 要 な 役 割 を 果 たす(22, 23) 細 胞 は 放 射 線 照 射 されると 分 裂 頻 度 の 低 下 や 細 胞 周 期 の 延 長 が 見 られ 分 裂 が 遅 延 する 細 胞 には 細 胞 周 期 の 進 行 状 況 や DNA 損 傷 の 有 無 をチェックするための 機 構 が 備 わってお り これを 細 胞 周 期 チェックポイントという チェックポイントは 細 胞 周 期 の 様 々な 段 階 に 備 わっており G1 期 チェックポイント S 期 チェックポイント G2 期 チェックポイン トなどがある これらのチェックポイントで 異 常 が 発 見 されると DNA 修 復 を 行 うため 細 胞 分 裂 の 進 行 が 一 時 的 に 停 止 し 細 胞 分 裂 遅 延 が 起 こる 照 射 された 腫 瘍 細 胞 で p21 WAF1 が 欠 如 していると おそらく 傷 害 負 荷 状 態 で 細 胞 周 期 を 止 めることができないために p53 を 介 したアポトーシスが 起 こることが 報 告 されている(21, 24-27) さらにこれらの 下 流 の 経 路 にはカスパーゼがある カスパーゼはシステインプロテアーゼであり 細 胞 のアポトー シスの 時 に 活 性 化 される(28) カスパーゼは 前 駆 体 として 産 生 され 分 割 されることにより 4

6 活 性 化 されることが 知 られている 中 でもカスパーゼ 3 カスパーゼ 6 カスパーゼ 7 はア ポトーシスの 実 行 分 子 (エフェクターカスパーゼ)と 言 われている(29) エフェクターカス パーゼによって 基 質 が 切 断 されることは 細 胞 の 重 要 な 構 成 要 素 を 切 断 するのに 必 要 であり その 結 果 としてアポトーシスに 特 徴 的 な 形 態 学 的 および 化 学 的 変 化 すなわち 細 胞 骨 格 の 再 編 成 核 の 凝 集 DNA の 断 片 化 などが 引 き 起 こされる また Bcl-2 は ストレスな どによるアポトーシスの 際 に ミトコンドリアの 膜 透 過 性 に 影 響 を 与 え ミトコンドリア からのチトクローム c などのたんぱく 質 の 放 出 を 抑 えることにより アポトーシスを 抑 制 す ることが 知 られている(30) ここまでの 細 胞 内 伝 達 経 路 を 纏 めると 図 1 のようになる こ の 経 路 のどこかを 遮 断 することが 出 来 れば 細 胞 のアポトーシスを 抑 制 することができ 細 胞 の 生 存 率 を 改 善 できる エダラボン(MCI-186; 化 学 名 ; 3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one; 商 品 名 ; ラジカッ ト; 分 子 量 )は 臨 床 的 に 脳 梗 塞 の 治 療 薬 として 広 く 用 いられている 薬 剤 である in vivo(31-44), in vitro(45, 46), 臨 床 (47-50)のいずれにおいても 脳 梗 塞 の 治 療 に 有 効 であ ると 報 告 されている エダラボンは 電 子 供 与 型 のフリーラジカルスカベンジャーであり (51-53) 放 射 線 防 護 に 有 効 である 可 能 性 があると 考 えられる 実 際 に 安 西 らが マウス の 腹 腔 内 にエダラボンを 投 与 することにより マウスの LD50/30(lethal dose; 照 射 30 日 以 内 に 50%の 個 体 が 死 ぬ 線 量 )が 増 加 し エダラボンに 放 射 線 防 護 効 果 があることを 報 告 した (54) その 報 告 では 実 験 に 使 われた X 線 線 量 は 10 Gy 以 下 であることから エダラボン 5

7 の 放 射 線 防 護 効 果 は 恐 らく 主 に 骨 髄 細 胞 の 死 を 抑 えることによって 達 成 されていると 考 え られている 放 射 線 による 骨 髄 細 胞 の 死 は 主 にアポトーシスによって 起 こるため(55) エ ダラボンは 骨 髄 細 胞 のアポトーシスを 抑 制 していると 予 想 される しかし エダラボンの 放 射 線 防 護 効 果 の 詳 細 な 分 子 機 構 などは 解 明 されていない 詳 細 な 分 子 機 構 を 解 明 して エダラボンがいずれ 臨 床 的 に 放 射 線 防 護 剤 として 使 用 される 手 助 けになるような 研 究 を 行 いたいと 考 えた 特 にエダラボンは 実 際 に 臨 床 使 用 されている 薬 剤 であることから 放 射 線 防 護 剤 としての 臨 床 使 用 の 実 現 可 能 性 も 高 いと 考 えた 今 回 の 実 験 では エダラボン 投 与 が 放 射 線 による 細 胞 のアポトーシスに 与 える 影 響 を in vitro で 解 析 した 今 回 は 主 に MOLT-4 細 胞 を 用 いて 実 験 を 行 った MOLT-4 細 胞 を 選 ん だのは X 線 に 非 常 に 感 受 性 が 高 く 照 射 後 に DNA の 断 片 化 と 核 の 濃 縮 で 特 徴 づけられる アポトーシスを 高 率 に 起 こすので(56-59) 今 回 の 実 験 に 使 う 細 胞 として 適 切 であると 考 え たためである 今 回 の 実 験 で エダラボンが MOLT-4 細 胞 のアポトーシス 経 路 ( 図 29)にお いて どの 部 分 に 作 用 してアポトーシスに 影 響 を 与 えているのかについても 実 験 し 解 析 した 6

8 材 料 と 方 法 細 胞 培 養 ヒト T 細 胞 白 血 病 細 胞 株 MOLT-4 および sirna(short-interfering RNA)により short hairpin type の p53 を 過 剰 発 現 させた MOLT-4 細 胞 (p53 ノックダウン MOLT-4) および p53-luc1 プラスミドを 過 剰 発 現 させた MOLT-4 細 胞 (MOLT/p53-Luc-1) およびヒト 前 B 細 胞 白 血 病 細 胞 株 Nalm-6 は 5%FBS (fetal bovine serum; Hyclone 社 )と 抗 生 物 質 (ペニ シリン/ストレプトマイシン)を 含 む RPMI-1640 を 培 地 として 37 で 5%CO2 と 95% 空 気 の 混 合 気 体 の 中 で 培 養 した ヒト 肝 細 胞 癌 細 胞 株 HepG2 は 5% FBS (Hyclone 社 ) と 抗 生 物 質 (ペニシリン/ストレ プトマイシン)を 含 む Dulbecco s Modified Eagle Medium (Sigma 社 ) を 培 地 として 37 で 5%CO2 と 95% 空 気 の 混 合 気 体 の 中 で 培 養 した p53 ノックダウンの MOLT-4 細 胞 を 産 生 するために エレクトロポレーション (Gene Pulsar Ⅱ, Bio-Rad; 0.25 kv, 950 マイクロファラド) により MOLT-4 細 胞 に ApaLI-linearized ベクター (Gene Suppressor System, p53 sirna プラスミドとネガティ ヴコントロールの p53 shrna プラスミド, IMGENEX) を 導 入 し 0.8 mg/ml の G418 を 含 む 0.16% 寒 天 培 地 で 3 週 間 かけて 目 的 の 細 胞 を 選 択 した MOLT/p53-Luc1 細 胞 を 産 生 するために エレクトロポレーション (Gene Pulsar Ⅱ, Bio-Rad; 0.25kV, 950 マイクロフ ァラド) により MOLT-4 細 胞 に p53-luc1 プラスミドとネオマイシン 耐 性 遺 伝 子 ベクター 7

9 (pcdna3.1, Invitrogen)を 共 に 導 入 し 0.4 mg/ml の G418 を 含 む 0.16% 寒 天 培 地 で 3 週 間 かけて 目 的 の 細 胞 を 選 択 した 化 学 薬 品 エダラボンは 田 辺 三 菱 製 薬 株 式 会 社 ( 東 京 )から 原 末 を 提 供 された 52.5 mg のエダラボ ン 原 末 を μl の 2 M の NaOH で 溶 解 した 後 1.05 ml の 蒸 留 水 を 加 え 約 52.5 μl の 2 M の HCl で ph を 約 8.8 に 調 製 した 後 生 理 食 塩 水 で 30 mg/ml の 濃 度 になるように 調 製 したものを 用 いた ロスコビチン(Roscovitine)は 薬 剤 性 の CDK 阻 害 剤 である(60) ロスコビチンは Calbiochem 社 (サンディエゴ)から 購 入 した DMSO(dimethylsulfoxide)を 溶 媒 として 10 μm の 濃 度 で 照 射 前 に 投 与 した X 線 照 射 X 線 照 射 は 島 津 社 の Pantak HF 350 で 200 kvp 200 ma で 0.5 mm の Cu と 1 mm の Al のフィルター 使 って cgy/min の 線 量 率 で 行 った 色 素 排 除 試 験 100 μl の 細 胞 培 養 液 ( 約 細 胞 /ml)と 25 μl の 1%エリスロシン B を 含 む 8

10 PBS(phosphate-buffered saline)を 混 合 して 2 分 後 に 生 細 胞 ( 染 色 +)と 死 細 胞 ( 染 色 -) を 顕 微 鏡 下 で 計 数 した 生 存 率 は 以 下 の 式 で 求 めた 生 存 率 (%) = ( 生 細 胞 数 ) / ( 総 細 胞 数 ) 100 AnnexinⅤ-PI 染 色 アポトーシスを AnnexinⅤ-FITC(fluorescein isothiocyanate)と PI(propidium iodine)の 二 重 染 色 にて 測 定 した 測 定 は MBL 社 の MEBCYTO アポトーシスキットを 用 いて 行 わ れた 第 1 象 限 ( 低 FITC/ 高 PI)は 二 次 ネクローシス 第 2 象 限 ( 高 FITC/ 高 PI)は 一 次 ネク ローシス 第 3 象 限 ( 低 FITC/ 低 PI)は 生 存 第 4 象 限 ( 高 FITC/ 低 PI)は 早 期 アポトーシス の 細 胞 として EPICS フローサイトメーター(XL System Ⅱ; Beckman Coulter)で 計 数 さ れた 5000 個 以 上 の 細 胞 が 計 数 された 細 胞 内 ROS の 測 定 細 胞 内 ROS の 測 定 は Molecular Probe 社 の CM-H2-DCFDA (chloromethyl-2,7 -dichlorodihydrofluorescein diacetate) を 用 いて 行 われた(61) CM-H2-DCFDA は 細 胞 内 で 産 生 された ROS を 調 べるために 開 発 された 化 合 物 である この 化 合 物 は 非 蛍 光 物 質 であるが 細 胞 内 に 入 り 細 胞 内 エステラーゼにより 脱 アセチル 9

11 化 され さらに ROS 存 在 下 で 酸 化 されると 蛍 光 物 質 に 変 化 する この 蛍 光 をフローサイト メトリーにて 検 出 することにより 細 胞 内 ROS を 間 接 的 に 定 量 することができる MOLT-4 細 胞 は 約 5 μg/ml の CM-H2-DCFDA プローブとともに 暗 所 で 約 1 時 間 培 養 され EPICS フローサイトメーター(XL System Ⅱ; Beckman Coulter)で 励 起 波 長 nm 消 退 波 長 nm で 測 定 された ウエスタンブロット 細 胞 を SDS(sodium dodecyl sulfate) サンプルバッファー(1% SDS, 3% β -mercaptoethanol, 5% glycerol, 62.5 mm Tris-HCl, ph 6.8)で 溶 解 した タンパク 質 は 10% または 15%の SDS-ポリアクリルアミドゲル 電 気 泳 動 (SDS-PAGE)により 分 離 し polyvinylidene difluoride 転 写 膜 (Immobilon, Millipore 社 )に 転 写 した この 転 写 膜 を 5% スキムミルクを 含 む TBS (Tris-buffered saline, 29 mm Tris-HCl, 0.9% NaCl, ph 7.6)に 0.05%の Tween-20 を 混 ぜたもの(TBS-T)で 30 分 ブロッキングした 後 4 で 5%スキムミ ルクを 含 む TBS-T に 一 次 抗 体 を 加 えたもので 一 晩 インキュベートした 一 次 抗 体 は 抗 p53 抗 体 (clone DO-1, Santa Cruz Biotechnology) 抗 p53 リン 酸 化 抗 体 Serine15 (Calbiochem) Serine6, 9, 20, 392 (Cell Signaling) 抗 分 割 カスパーゼ 3 抗 体 (Cell Signaling) 抗 カスパーゼ7 抗 体 (MBL) 抗 p21 WAF1 抗 体 (Calbiochem) 抗 Bcl-2 抗 体 (Pharmingen) 抗 βアクチン 抗 体 (Sigma, AC-15) 抗 PUMA 抗 体 (Calbilchem)を 用 いた 10

12 TBS-T で 抗 体 を 3 回 洗 った 後 5%スキムミルク 入 り TBS-T に horseradish peroxidase (DAKO)を 接 合 した 二 次 抗 体 を 加 えたもので 室 温 で 2 時 間 インキュベートした 転 写 膜 は その 後 TBS-T で 3 回 TBS で 1 回 洗 った 後 ECL-plus キット(GE Healthcare)で 蛍 光 標 識 した シグナルは X 線 フィルム(Hyperfilm MP; GE Healthcare)に 焼 きつけて 画 像 化 した 本 来 であればβアクチンをコントロールたんぱく 質 としてすべての 実 験 について 用 いるべ きであったが 一 部 のサンプルについては 用 いていないため 細 胞 量 が 合 うように すべ てのサンプル 作 成 を 慎 重 に 行 った 少 なくとも 3 回 ずつ 実 験 を 行 い いずれも 同 様 の 傾 向 であることを 確 認 し 代 表 的 な 結 果 を 示 した p53 の 蓄 積 と Serine15 のリン 酸 化 について は 画 像 解 析 ソフト ImageJ を 用 いて 3 回 の 実 験 のタンパク 量 を 解 析 して グラフ 化 した DNA 断 片 化 の 解 析 約 個 の 細 胞 を 解 析 に 用 いた DNA は Apoptosis Ladder Detection Kit (WAKO) を 用 いて 使 用 説 明 書 を 参 考 にして 抽 出 した DNA ペレットは 洗 浄 後 に 1.5%アガロースゲ ル 上 で 100 ボルトで 30 分 電 気 泳 動 した ゲルは 1 μg/ml のエチジウムブロマイドにより 染 色 され UV トランスイルミネーターにより 観 察 され 写 真 化 された 3 回 実 験 を 行 い 代 表 的 な 結 果 を 示 した ルシフェラーゼアッセイ 11

13 Promega 社 の Dual Luciferase assay system を 用 いて 業 者 の 説 明 書 を 参 考 にしてルシフェ ラーゼアッセイを 行 った ルシフェラーゼアッセイについて 説 明 する MOLT-4 細 胞 の p53 の p21 に 対 するプロモーターにルシフェラーゼ 遺 伝 子 を 結 合 させることにより p53 の 転 写 活 性 に 比 例 してルシフェラーゼが 産 生 される このルシフェラーゼはルシフェリンという 非 蛍 光 物 質 を 蛍 光 物 質 に 変 化 させることができる よって その 蛍 光 量 を 調 べることによ り p53 の p21 に 対 する 転 写 活 性 を 調 べることができる ATTO 社 の luminescencer-psn AB-2200 を 用 いて 10 秒 間 蛍 光 量 を 測 定 した 未 処 置 の 細 胞 との 蛍 光 量 の 比 を 測 定 し グ ラフ 化 した 統 計 処 理 すべての 実 験 は 最 低 でも 3 回 ずつ 行 った 実 験 の 結 果 は 平 均 ± 標 準 偏 差 で 表 示 した す べての 実 験 データは Excel2000 などを 使 い 標 準 的 な 統 計 処 理 方 法 で 処 理 された 統 計 的 有 意 差 は T 検 定 により 検 定 した すべての 実 験 において p 値 が 0.05 以 下 の 場 合 を 統 計 的 有 意 差 があるとした 12

14 結 果 エダラボンは 高 濃 度 (2.7-3 mg/ml)では 放 射 線 防 護 効 果 があり 低 濃 度 ( mg/ml) では 放 射 線 増 感 効 果 がある まずは エダラボンの 細 胞 毒 性 を 色 素 排 除 試 験 で 調 べた MOLT-4 細 胞 に 0.15, 0.75, 1.5, 3, 6 mg/ml の 濃 度 のエダラボンを 投 与 して 20 時 間 後 に MOLT-4 細 胞 の 生 存 率 を 調 べた 3 mg/ml までの 濃 度 のエダラボンを 投 与 した 時 には 細 胞 の 生 存 率 は 60% 以 上 であり エダ ラボンの 毒 性 は 実 験 する 上 で 許 容 範 囲 内 であると 考 えた しかし 濃 度 を 6 mg/ml まで 上 げると 細 胞 の 生 存 率 は 30% 以 下 に 低 下 し 毒 性 が 強 すぎると 判 断 された( 図 2) よって 以 下 の 実 験 はすべて 3 mg/ml 以 下 の 濃 度 のエダラボンを 用 いて 行 った エダラボンを 放 射 線 照 射 5 分 前 に MOLT-4 細 胞 に 投 与 し その 後 2 Gy の X 線 を 照 射 し 20 時 間 後 に 細 胞 の 生 存 率 を 調 べた エダラボンの 濃 度 をいろいろに 変 えて 濃 度 によりエ ダラボンの 効 果 がどのように 変 わるかを 調 べた エダラボンを 投 与 せずに MOLT-4 細 胞 を 照 射 したときには MOLT-4 細 胞 の 生 存 率 は 36.2 ± 6.3%であった エダラボンを 0.15, 0.75, 1.5, 1.8, 2.1, 2.4, 2.7, 3 mg/ml の 濃 度 で 投 与 し 照 射 したときには MOLT-4 細 胞 の 生 存 率 は それぞれ 9.7 ± 2.1%, 5.7 ± 3.5%, 7.2 ± 6.3%, 27.5 ± 8.5%, 44.0 ± 8.9%, 59.3 ± 11.0%, 59.8 ± 4.0%, 49.2 ± 10.6%であった( 図 3) エダラボンの 濃 度 が 2.7, 3 mg/ml の 時 は エダラボンを 投 与 し ない 時 に 比 べて 細 胞 の 生 存 率 が 有 意 に 改 善 し(p < 0.05) エダラボンの 放 射 線 防 護 効 果 が 認 め られた 逆 に エダラボンの 濃 度 が 0.15, 0.75, 1.5 mg/ml の 時 は 細 胞 の 生 存 率 が 有 意 に 低 13

15 下 し(p < 0.05) エダラボンの 放 射 線 増 感 効 果 が 認 められた それ 以 外 の 濃 度 では 照 射 単 独 と 比 べて 有 意 差 は 見 られなかった 以 後 の 実 験 では 前 半 部 分 では 3 mg/ml のエダラボンを 用 いて 放 射 線 防 護 効 果 を 研 究 した 後 半 部 分 では 0.75 mg/ml のエダラボンを 用 いて 放 射 線 増 感 効 果 を 研 究 した その 中 間 の 濃 度 については 今 回 は 検 討 を 行 わなかった まず 放 射 線 防 護 効 果 について 詳 しく 調 べるために エダラボン 濃 度 を 3 mg/ml として 実 験 を 続 けた X 線 線 量 を 2 Gy から 5 Gy に 上 げて 3 mg/ml のエダラボンを 5 分 前 に 投 与 し て 20 時 間 後 に MOLT-4 細 胞 の 生 存 率 を 調 べたところ やはり 有 意 な 放 射 線 防 護 効 果 を 認 めた(p < 0.05)( 図 4) しかも 5 Gy の 時 の 方 が 2 Gy の 時 に 比 べて 防 護 効 果 が 際 立 っていた ので 以 後 の 放 射 線 防 護 効 果 の 実 験 は 主 に 5 Gy で 行 った 放 射 線 防 護 効 果 の 時 間 経 過 を 調 べるために 3 mg/ml エダラボンを 5 Gy の X 線 照 射 5 分 前 に 投 与 し 4, 8, 12, 16, 20 時 間 後 に 色 素 排 除 試 験 にて 細 胞 の 生 存 率 を 調 べ エダラボンを 投 与 せずに 5 Gy の X 線 を 照 射 した 場 合 の 時 間 経 過 と 生 存 率 を 比 較 した 図 5 のように エダラボンを 投 与 して 照 射 した 方 が 8 時 間 後 から 20 時 間 後 に 細 胞 の 生 存 率 が 有 意 に 改 善 した エダラボンの 放 射 線 防 護 効 果 は MOLT-4 細 胞 のアポトーシスを 抑 制 することにより 起 こっ ている このエダラボンの 放 射 線 防 護 効 果 がアポトーシスを 抑 えることによるものかどうかを 調 べるために AnnexinⅤ-PI 染 色 を 行 った AnnexinⅤ(-)PI(-)の 細 胞 (アポトーシスを 起 こ 14

16 さず 生 存 していると 考 えられる 細 胞 )は 5 Gy の X 線 照 射 単 独 の 16 時 間 後 では 10.6 ± 0.8% であったが 照 射 5 分 前 に 3 mg/ml のエダラボンを 投 与 することにより 74.2 ± 2.1%と 著 明 に 増 加 した(p < 0.05)( 図 6-8) 高 濃 度 エダラボンは 放 射 線 による 細 胞 内 ROS の 増 加 を 抑 制 する ROS は 放 射 線 誘 発 アポトーシスに 重 要 とされているため CM-H2-DCFDA のキットを 用 いて 細 胞 内 で 産 生 される ROS を 間 接 的 に 測 定 した(61) MOLT-4 細 胞 を 20 Gy の X 線 照 射 することにより 細 胞 内 ROS は 約 11 倍 に 増 加 したが 3 mg/ml のエダラボンを 照 射 5 分 前 に 投 与 することにより 当 検 査 上 はこの ROS がほぼ 完 全 に 抑 えられることが 分 かった (p < 0.05) また 照 射 5 分 後 に 投 与 した 場 合 にも 細 胞 内 ROS はかなり 抑 えられるが 照 射 前 に 投 与 した 時 ほどは 抑 えられないことが 分 かった( 図 9) 高 濃 度 エダラボンは p53 の 蓄 積 とリン 酸 化 を 抑 制 する アポトーシスの 抑 制 がどのような 細 胞 内 の 変 化 によって 起 こっているのかを 調 べるため に ウエスタンブロット 法 でエダラボンのアポトーシス 関 連 分 子 に 与 える 影 響 を 調 べた 5 Gy の X 線 を 照 射 し 3 mg/ml のエダラボンを 照 射 前 に 投 与 した 場 合 としない 場 合 で p53 の 蓄 積 と p53 の Serine15 残 基 のリン 酸 化 がどう 変 化 するかを 調 べた p53 の 蓄 積 もリン 酸 化 も 照 射 単 独 では 照 射 1-4 時 間 後 にかけて 増 えていたが エダラボン 投 与 により 増 え 方 が 15

17 抑 制 されることが 分 かった( 図 10) この 時 のタンパク 発 現 量 を 画 像 解 析 ソフト ImageJ を 用 いて 定 量 した p53 の 蓄 積 は 照 射 2, 4, 8 時 間 後 で p53 の Serine15 残 基 のリン 酸 化 は 照 射 4, 8 時 間 後 で 照 射 単 独 に 比 べて 照 射 前 にエダラボンを 加 えた 方 が 有 意 にタンパク 量 が 抑 制 されることが 分 かった( 図 11) また p53 の 標 的 遺 伝 子 である p21 WAF1 ( 図 12)および PUMA( 図 13)の 発 現 も X 線 照 射 単 独 ではともに 増 加 していたが エダラボン 投 与 により 抑 制 されることが 分 かった また アポトーシスの 実 行 分 子 であるカスパーゼ 3 カスパー ゼ 7(29)の 活 性 化 は 照 射 単 独 では X 線 照 射 8-16 時 間 後 に 増 加 していたが エダラボン 投 与 により 抑 制 されていた( 図 14, 15) また 抗 アポトーシスタンパク 質 である Bcl-2 の 総 量 は 照 射 単 独 でもエダラボン 投 与 後 の 照 射 でも 変 化 は 見 られなかった ただし Bcl-2 の 分 割 は 照 射 単 独 により 起 こっていたのが エダラボン 投 与 により 抑 制 されていることが 分 か った( 図 16) 高 濃 度 エダラボンは DNA 断 片 化 を 抑 制 する DNA の 断 片 化 は アポトーシスの 指 標 でもある(62) DNA 断 片 化 がエダラボンによりど のように 変 化 するかを 電 気 泳 動 法 により 調 べた 5 Gy の X 線 照 射 8 時 間 後 から DNA の 断 片 化 に 対 応 すると 考 えられるスメアが 明 らかであったが 照 射 5 分 前 に 3 mg/ml のエダラ ボンを 投 与 することにより そのスメアがほぼ 完 全 に 抑 制 されることが 分 かった( 図 17) これまでの 結 果 から 3 mg/ml のエダラボンを X 線 照 射 5 分 前 に 投 与 することにより 16

18 ROS の 除 去 p53 経 路 の 抑 制 を 介 して MOLT-4 細 胞 のアポトーシスが 抑 制 されることが in vitro で 示 された 低 濃 度 エダラボンは 放 射 線 増 感 効 果 を 示 す これ 以 降 は 低 濃 度 のエダラボンの 放 射 線 増 感 効 果 について その 分 子 機 構 などを 解 析 した 0.15, 0.75, 1.5 mg/ml のエダラボンでは 放 射 線 増 感 効 果 が 見 られたが 中 でも 0.75mg/ml の 時 が 最 も 増 感 効 果 が 際 立 っていたので 以 後 の 実 験 は 0.75 mg/ml で 行 うこと とした この 放 射 線 増 感 効 果 は X 線 の 照 射 線 量 を 1 Gy 5 Gy としても 同 様 に 認 められた(p < 0.05)( 図 18) また 照 射 後 の 時 間 経 過 を 調 べるために 線 量 を 2 Gy として 照 射 4, 8, 12, 16, 20 時 間 後 に 色 素 排 除 試 験 にて MOLT-4 細 胞 の 生 存 率 を 調 べた 照 射 8-20 時 間 後 にお いて エダラボン 投 与 により 有 意 な 放 射 線 増 感 効 果 が 認 められた(p < 0.05)( 図 19) また この 放 射 線 増 感 効 果 はヒト 前 B 細 胞 白 血 病 細 胞 株 Nalm-6 (p < 0.05)( 図 20) ヒト 肝 細 胞 癌 細 胞 株 HepG2 (p < 0.05)( 図 21)でも 認 められた ただし その 増 感 効 果 は MOLT-4 細 胞 ほ ど 際 立 ってはいなかった エダラボン 以 外 のフリーラジカルスカベンジャーでも 同 様 の 放 射 線 増 感 効 果 が 認 められ るかどうか 確 認 するために DMSO を 用 いて 同 様 の 実 験 を 行 った すなわち 2 mg/ml お よび 10 mg/ml DMSO を 照 射 5 分 前 に MOLT-4 細 胞 に 投 与 し 2 Gy の X 線 を 照 射 し 20 時 間 後 に 色 素 排 除 試 験 を 行 った 10 mg/ml DMSO を 投 与 して 照 射 した 時 には 細 胞 の 生 存 17

19 率 は 照 射 単 独 の 時 に 比 べて 有 意 に 改 善 し(p < 0.05) DMSO の 放 射 線 防 護 効 果 によるものと 考 えられた 一 方 で 2 mg/ml DMSO を 投 与 して 照 射 した 時 には 細 胞 の 生 存 率 は 照 射 単 独 の 時 と 比 べて 有 意 差 は 見 られなかった( 図 22) エダラボンの 放 射 線 増 感 効 果 はアポトーシスの 亢 進 により 起 こる 低 濃 度 エダラボンによる 放 射 線 増 感 効 果 がアポトーシスによって 起 こるかどうかを 確 認 するために AnnexinⅤ-PI 染 色 を 行 った MOLT-4 細 胞 を 2 Gy の X 線 照 射 単 独 または 0.75 mg/ml のエダラボン 単 独 またはその 両 方 で 処 理 して 8 時 間 後 に AnnexinⅤ-PI 染 色 を 行 った AnnexinⅤ(+) PI(-)の 早 期 アポトーシスの 細 胞 はそれぞれ ± 1.96% 2.04 ± 0.21% ± 4.48%であった エダラボンと X 線 照 射 の 組 み 合 わせにより 相 乗 効 果 的 に MOLT-4 細 胞 のアポトーシスが 増 えていることが 分 かった(p < 0.05)( 図 23, 24) この 結 果 から エダラボンによる 放 射 線 増 感 効 果 は アポトーシスの 亢 進 によって 起 きているこ とが 分 かった 次 に アポトーシスの 実 行 因 子 であり アポトーシスの 指 標 ともなるカス パーゼの 一 つであるカスパーゼ 7(29)がエダラボン 投 与 と 照 射 によりどのような 影 響 を 受 け るかを ウエスタンブロット 法 で 調 べた 2 Gy X 線 照 射 単 独 では 照 射 8 時 間 後 までカス パーゼ 7 の 活 性 化 ははっきりしなかったが 照 射 5 分 前 に 0.75 mg/ml のエダラボンを 投 与 した 場 合 には カスパーゼ 7 は 切 断 され 活 性 化 が 見 られた( 図 25) このことからも エダ ラボンによる 放 射 線 増 感 効 果 はアポトーシスによって 起 こっていることが 分 かった 18

20 低 濃 度 エダラボンにより ROS は 抑 制 される エダラボンが 細 胞 内 ROS に 与 える 影 響 を 調 べるために 再 び CM-H 2 -DCFDA キットを 用 いた 20 Gy X 線 照 射 により 約 11 倍 に 増 えた 細 胞 内 ROS は 照 射 前 に 低 濃 度 エダラボンを 投 与 することにより 有 意 に 抑 制 されていることが 分 かった (p < 0.05)( 図 26) ただし エ ダラボン 濃 度 が 3 mg/ml の 時 ほどは 抑 制 されていなかった よって エダラボンにより 放 射 線 誘 発 性 アポトーシスが 増 感 している 時 ROS は 抑 制 されていることが 分 かった 低 濃 度 エダラボンの 放 射 線 増 感 効 果 には p53 が 強 く 関 与 している MOLT-4 細 胞 のアポトーシス 経 路 において 重 要 とされる p53 の 変 化 について ウエスタン ブロット 法 で 調 べた 2 Gy X 線 照 射 5 分 前 に 0.75 mg/ml のエダラボンと 投 与 した 場 合 とし ない 場 合 で 1-4 時 間 後 に p53 の 蓄 積 Serine6, 9, 15, 20, 392 残 基 のリン 酸 化 について ウエ スタンブロット 法 で 調 べた p53 の Serine15, 20 残 基 のリン 酸 化 は エダラボン 投 与 により 増 加 していることが 分 かった 一 方 p53 の 蓄 積 Serine6, 9, 392 のリン 酸 化 については エダラボン 投 与 により 増 加 していないことが 分 かった( 図 27) これらから エダラボンの 放 射 線 増 感 効 果 について p53 が 何 らかの 役 割 を 果 たしている 可 能 性 が 示 唆 された エダラボンの 放 射 線 増 感 効 果 における p53 の 関 与 をよりはっきりさせるために p53 の sirna を 過 剰 発 現 したベクターを 使 って 作 られた p53 ノックダウン MOLT-4 細 胞 を 用 いて 19

21 エダラボンの 放 射 線 増 感 効 果 を 研 究 した 2 つの p53 ノックダウンクローンのうち(63) よ りしっかり p53 がノックダウンされているクローンを 用 いて エダラボンを 投 与 した 場 合 と 投 与 しない 場 合 で 細 胞 の 生 存 率 の 推 移 を 調 べた このクローンについて X 線 照 射 前 に 0.75 mg/ml のエダラボンを 投 与 した 場 合 としない 場 合 と 何 も 処 理 しない 場 合 で p53 の 蓄 積 が 抑 えられていることを 確 認 した( 図 28) このクローンを 2 Gy の X 線 照 射 単 独 で 治 療 した 場 合 と 0.75 mg/ml のエダラボンを 5 分 前 に 投 与 し 2 Gy の X 線 を 照 射 した 場 合 の 20 時 間 後 の p53 ノックダウン MOLT-4 細 胞 の 生 存 率 はそれぞれ ± 2.02% ± 4.75% であり 統 計 的 有 意 差 は 見 られなかった( 図 29) すなわち p53 のノックダウンによりエダ ラボンによる 放 射 線 増 感 効 果 が 打 ち 消 されていた よって エダラボンの 放 射 線 増 感 効 果 には p53 が 深 く 関 与 していることが 分 かった エダラボンの 放 射 線 増 感 効 果 において p21 WAF1 は 抑 制 され PUMA は 亢 進 した 次 に p53 の 転 写 活 性 と p53 標 的 分 子 の 変 化 について 調 べた まずは p53 の 標 的 分 子 の 一 つであり CDK 阻 害 作 用 のある p21 WAF1 (18)について エダラボンの 放 射 線 増 感 効 果 の 時 にどのような 変 化 が 見 られるか 調 べた MOLT-4 細 胞 において 2 Gy X 線 照 射 単 独 により 8 時 間 後 にはっきりと 出 現 する p21 WAF1 の 増 加 が 0.75 mg/ml のエダラボンを 5 分 前 に 投 与 することにより 大 部 分 が 抑 制 されることが 分 かった( 図 30) 次 に p53 の 転 写 活 性 をルシフェラーゼアッセイにより 調 べた 2 Gy または 5 Gy の X 線 20

22 照 射 により 増 加 していた p53 の 転 写 活 性 が 照 射 5 分 前 にエダラボンを 投 与 することによ り 大 部 分 が 抑 制 されることが 分 かった( 図 31) Yu らは p21 WAF1 が 発 現 していない 細 胞 で は p53 を 介 したアポトーシスが 強 く 誘 発 されることを 報 告 している(21) これは CDK 阻 害 作 用 により 細 胞 周 期 を 止 める 役 割 のある p21 WAF1 が 存 在 しないことにより 傷 害 を 受 けた 細 胞 が 細 胞 周 期 を 止 めることができず 細 胞 修 復 が 不 完 全 になり アポトーシスが 誘 発 さ れるためとされている エダラボンの 放 射 線 増 感 効 果 に p21 WAF1 の 発 現 の 低 下 が 影 響 してい るかどうかを 調 べるために 薬 剤 性 の CDK 阻 害 剤 であるロスコビチンの 影 響 を 調 べた(60) MOLT-4 細 胞 にエダラボンとロスコビチンを 同 時 に 投 与 して 2 Gy の X 線 照 射 をし 20 時 間 後 に 色 素 排 除 試 験 にて 細 胞 の 生 存 率 を 調 べたところ 31.6 ± 4.5%であった すなわち エ ダラボンのみを 投 与 して 照 射 した 場 合 より 有 意 に 生 存 率 が 改 善 した(p < 0.05) また 照 射 単 独 と 比 べて 有 意 差 が 見 られなかった( 図 32) この 時 溶 媒 の DMSO の 濃 度 は 1 mg/ml 以 下 であり MOLT-4 細 胞 の 生 存 率 に 影 響 しないと 考 えられた p21 WAF1 が 抑 制 されている 状 態 でも ロスコビチンが 存 在 すれば CDK 活 性 が 抑 制 され アポトーシスが 抑 制 されること が 示 唆 された この 結 果 から エダラボンの 放 射 線 増 感 効 果 において p21 WAF1 の 抑 制 がア ポトーシス 増 感 に 寄 与 している 可 能 性 が 示 唆 された 次 に 別 の p53 標 的 分 子 である PUMA(17)について 調 べた MOLT-4 細 胞 に 2 Gy の X 線 照 射 した 後 の PUMA の 発 現 は 時 間 とともに 増 えていったが 照 射 5 分 前 に 0.75 mg/ml のエ ダラボンを 投 与 することにより その 増 え 方 はより 際 立 った( 図 30) また sirna で p53 21

23 をノックダウンした MOLT-4 細 胞 は 野 生 型 の MOLT-4 細 胞 に 比 べて X 線 照 射 後 の PUMA の 発 現 はエダラボンを 投 与 した 時 もしない 時 も 目 立 たなくなっていた( 図 28) PUMA はア ポトーシス 促 進 型 の BH3-only protein と 言 われており PUMA の 発 現 の 亢 進 がエダラボンに よるアポトーシスの 増 感 に 関 与 している 可 能 性 が 示 唆 された 22

24 考 察 以 上 の 結 果 から 高 濃 度 (3 mg/ml)のエダラボンには 放 射 線 防 護 効 果 低 濃 度 (0.75 mg/ml) のエダラボンには 放 射 線 増 感 効 果 があることが 分 かった エダラボンはフリーラジカルス カベンジャーであることから 放 射 線 防 護 効 果 は 予 想 されていたが 放 射 線 増 感 効 果 につ いては 予 想 外 であった 放 射 線 防 護 効 果 は MOLT-4 細 胞 において 照 射 前 に 3 mg/ml のエダラボンを 投 与 すること により 起 こった( 図 3-5) AnnexinⅤ-PI 染 色 の 結 果 から この 防 護 効 果 はアポトーシスの 抑 制 により 起 こっていることが 分 かった( 図 6-8) 照 射 前 のエダラボン 投 与 により 細 胞 内 ROS が 抑 制 されていた( 図 9) エダラボンは 血 球 細 胞 内 に 移 行 することが 知 られており(64) エ ダラボンは 細 胞 内 に 入 って 細 胞 内 で 発 生 した ROS を 抑 制 したと 考 えられた 照 射 後 にエ ダラボンを 投 与 した 場 合 でも 細 胞 内 ROS は 減 る 傾 向 にあり これは 長 寿 命 フリーラジカル や 照 射 後 の 細 胞 内 酸 化 ストレスなどを 抑 制 していることによる 所 見 と 考 えられた( 図 9) 照 射 前 にエダラボンを 投 与 した 時 p53 の 蓄 積 Serine15 残 基 のリン 酸 化 の 抑 制 ( 図 10, 11) および p53 標 的 分 子 の 発 現 の 抑 制 が 起 こっており( 図 12, 13) アポトーシスの 抑 制 に 深 く 関 与 していると 思 われた もし p53 を sirna でノックダウンした 細 胞 を 作 製 したとすると その 細 胞 自 体 が 放 射 線 抵 抗 性 になってしまうため 放 射 線 防 護 効 果 を 調 べる 実 験 には 不 適 当 であると 考 えられた このため 今 回 は p53 ノックダウンで p53 の 放 射 線 防 護 効 果 への 関 与 を 調 べることはしなかった またその 下 流 のカスパーゼ 3 カスパーゼ 7 の 抑 制 も 起 こ 23

25 っていた( 図 14, 15) さらに DNA の 断 片 化 の 抑 制 ( 図 17)により アポトーシスの 抑 制 が 再 確 認 された 色 素 排 除 試 験 の 結 果 をみると 照 射 16 時 間 後 以 降 はエダラボンを 投 与 した 場 合 にも MOLT-4 細 胞 の 生 存 率 は 低 下 してきているが( 図 5) これについては ROS を 介 さない 経 路 すなわち 直 接 効 果 などの 経 路 を 介 して 細 胞 死 が 起 こっていると 推 測 することができる 今 回 の 実 験 結 果 は 安 西 らの in vivo での 報 告 でマウスの LD 50/30 がエダラボンの 腹 腔 内 投 与 により 増 加 するという 実 験 結 果 に 一 致 していた(54) ROS はエダラボンの 照 射 前 投 与 によ り 抑 制 されており ROS が 放 射 線 誘 発 性 アポトーシスに 重 要 であるという 他 の 研 究 者 らの 報 告 からも(65, 66) ROS の 抑 制 が MOLT-4 細 胞 の 放 射 線 誘 発 性 アポトーシスの 抑 制 に 繋 が った 可 能 性 が 考 えられた 照 射 5 分 後 のエダラボン 投 与 でも ROS は 抑 制 される 傾 向 にあっ たが 照 射 前 投 与 の 時 ほど 抑 制 はされなかった 照 射 後 投 与 では 効 果 が 弱 いことは ROS の 中 でも 放 射 線 誘 発 性 アポトーシスに 重 要 とされるヒドロキシルラジカルの 半 減 期 が 非 常 に 短 いことから 説 明 できるかもしれない また 安 西 らの 報 告 で マウスの 腹 腔 内 投 与 の 時 に 照 射 後 では 放 射 線 防 護 効 果 がなかったという 実 験 結 果 とも 合 致 する(54) p53 は 重 要 な 転 写 因 子 であり 放 射 線 によるアポトーシスにおいて 非 常 に 重 要 であるとさ れている DNA 傷 害 が 起 こると p53 の 安 定 性 はリン 酸 化 されることにより 増 し その 結 果 として 起 こる p53 の 蓄 積 (15)によりその 標 的 因 子 の 転 写 が 起 こるが(67) その 標 的 因 子 に は 細 胞 周 期 制 御 にかかわる p21 WAF1 (18)やアポトーシスにかかわる PUMA(17)がある 24

26 カスパーゼはアスパラギン 酸 特 異 的 なシステインプロテアーゼであり アポトーシスの 時 に 活 性 化 されることが 知 られている カスパーゼは ICAD (inhibitor of caspase-activated DNAse) を 不 活 性 化 し CAD (caspase-activated DNAse) を 活 性 化 することにより DNA を 切 断 し アポトーシスを 起 こす また カスパーゼは 活 性 化 されることにより その 酵 素 活 性 により 多 くの 基 質 を 分 割 して 細 胞 をアポトーシスへと 導 く 今 回 の 実 験 では その カスパーゼが 抑 制 されていることからもアポトーシスが 抑 制 されていることが 分 かる( 図 14, 15) その 基 質 の 一 つが Bcl-2 である(68, 69) Bcl-2 は 様 々なストレスによる 細 胞 のアポトーシ スを 抑 制 する 膜 タンパク 質 である(70) 榎 本 らは マウスの Bcl-2 を 強 制 発 現 させた MOLT-4 細 胞 は 放 射 線 抵 抗 性 であり 放 射 線 誘 発 性 アポトーシスが 抑 制 されることを 報 告 した(13) 今 回 の 実 験 では Bcl-2 の 発 現 量 はエダラボン 投 与 によって 変 化 が 見 られないことが 分 かっ た( 図 16) この 結 果 は これまでの in vivo(39, 71)や in vitro(72)での 脳 梗 塞 モデルなどによる エダラボン 投 与 の 実 験 結 果 の 報 告 と 異 なる これらは 実 験 に 使 われた 細 胞 も 異 なり 細 胞 刺 激 も 異 なるために 結 果 が 異 なったのかもしれない また in vitro と in vivo の 条 件 の 違 いによるのかもしれない また Bcl-2 はカスパーゼ 3 により アスパラギン 34 で 切 断 され Bcl-2 の 分 解 産 物 はア ポトーシス 促 進 に 働 くことが 報 告 されている(73) 今 回 の 実 験 では カスパーゼ 3 の 活 性 化 が 抑 制 されたことにより Bcl-2 の 切 断 も 抑 制 されたと 考 えられる 25

27 図 17 では DNA の 断 片 化 が 抑 制 されていることが 確 認 された DNA 断 片 化 では 通 常 電 気 泳 動 法 はラダー 状 になることが 知 られているが MOLT-4 の DNA 断 片 化 の 場 合 は ス メア 状 になるとの 報 告 もあり(74) 今 回 の 所 見 は X 線 照 射 により DNA が 断 片 化 され スメ ア 状 となったものが エダラボン 投 与 により 断 片 化 が 抑 制 され スメアが 消 失 したと 考 え ることができる エダラボンは 抗 酸 化 剤 としても 知 られている(35, 43, 75, 76) エダラボンと 似 た 作 用 を 持 つ 薬 剤 として アミフォスチン アルファリポ 酸 グルタチオン ビタミン C トロロック スなどの 様 々な 抗 酸 化 剤 が 知 られており これらは in vivo で ROS を 抑 制 することが 示 され ている(77) 例 えば アミフォスチンは 放 射 線 治 療 や 化 学 療 法 による 正 常 組 織 の 細 胞 防 護 作 用 があって 臨 床 的 にも 使 われている 薬 剤 であり その 放 射 線 防 護 作 用 はフリーラジカル 除 去 作 用 (78)や 抗 突 然 変 異 作 用 (79)によるとされている また トロロックスは 脂 質 抗 酸 化 作 用 があるビタミン E のアナログであり(80) 放 射 線 による MOLT-4 細 胞 のアポトーシスを カスパーゼ 3 の 経 路 を 抑 えることにより 抑 制 したと 報 告 されている(81) これらの 作 用 はエ ダラボンと 類 似 点 が 多 く 今 後 も 研 究 の 余 地 があると 思 われる 以 上 ここまでを 纏 めると 3 mg/ml のエダラボンは 放 射 線 による MOLT-4 細 胞 のアポト ーシスを ROS の 抑 制 p53 の 抑 制 を 介 して 抑 えることが in vitro で 示 された これを 図 33 に 図 示 した ただし MOLT-4 細 胞 は 白 血 病 の 細 胞 であり 実 際 の 臨 床 上 は 防 護 されてしま っては 困 る 細 胞 である 臨 床 上 は 正 常 組 織 を 防 護 したいところであるが in vivo では 違 った 26

28 効 果 が 見 られる 可 能 性 もあるので さらに 研 究 が 必 要 と 思 われる 様 々な 抗 酸 化 剤 やフリーラジカルスカベンジャーが 知 られているが 低 濃 度 にすると 放 射 線 増 感 効 果 を 示 す 薬 剤 は 知 られていない 今 回 の 実 験 でも 高 濃 度 で 放 射 線 防 護 効 果 を 示 す DMSO を 低 濃 度 にして 実 験 したが 放 射 線 増 感 効 果 は 認 められなかった( 図 22) p53 野 生 型 である MOLT-4 Nalm-6 HepG2 細 胞 において 放 射 線 照 射 前 にエダラボンを 低 濃 度 ( mg/ml)で 投 与 すると エダラボンを 投 与 せずに 照 射 した 場 合 に 比 べて 細 胞 の 生 存 率 が 有 意 に 低 下 し エダラボンによる 放 射 線 増 感 効 果 が 観 察 された( 図 3, 18-21) こ の 放 射 線 増 感 効 果 は エダラボンの 細 胞 毒 性 を 考 えても エダラボンと 放 射 線 の 効 果 の 単 純 な 足 し 算 よりは 高 い 効 果 があると 思 われた この 放 射 線 増 感 効 果 はアポトーシスを 亢 進 させることにより 起 こっていた( 図 23-25) この 時 の ROS は 抑 制 されていたが 防 護 効 果 を 示 すエダラボンの 濃 度 の 時 ほどは 抑 制 されていなかった( 図 26) p53 がこの 放 射 線 増 感 効 果 に 深 く 関 与 していた( 図 29) 照 射 前 に 低 濃 度 のエダラボンを 投 与 することにより p53 のリン 酸 化 状 態 が 変 化 し( 図 27) p53 標 的 分 子 の 発 現 も 変 化 していた( 図 30, 31) 即 ち PUMA の 発 現 は 亢 進 し p21 WAF1 の 発 現 は 抑 制 されていた p21 WAF1 の 抑 制 は 転 写 レベルでも 確 認 され た( 図 31) CDK 阻 害 剤 であるロスコビチンを 投 与 することにより エダラボンによる 放 射 線 増 感 効 果 は 打 ち 消 された( 図 32) 今 回 の 実 験 では 0.75 mg/ml のエダラボンを 照 射 前 に 投 与 することにより p53 の Serine15, 20 残 基 のリン 酸 化 が 亢 進 したが( 図 27) エダラボンが p53 に 直 接 どのような 影 響 を 与 えて 27

29 いるのかは 今 回 の 実 験 では 不 明 であった 例 えば タンパクリン 酸 化 酵 素 である ATM (ataxia telangiectasia mutated)は Serine1981 残 基 のリン 酸 化 により 活 性 化 され p53 の Serine15 残 基 を 直 接 リン 酸 化 することが 報 告 されている(82) さらに ATM により 活 性 化 された Chk2 が p53 の Serine20 残 基 をリン 酸 化 して p53 を 安 定 化 させることも 報 告 されている(83) エ ダラボンがこれらのプロテインキナーゼなどを 介 して p53 のリン 酸 化 を 制 御 しているのか p53 に 直 接 影 響 を 及 ぼしてリン 酸 化 を 制 御 しているのかは 今 回 の 実 験 からは 不 明 であり さらなる 検 討 課 題 である p53 のリン 酸 化 部 位 によるアポトーシスに 与 える 影 響 については Unger らが(84)ヒト 非 小 細 胞 肺 癌 細 胞 株 H1299 において Serine6, 9, 15, 20, 33, 37 残 基 のうち Serine15, 20 残 基 がアポトーシスに 深 くかかわっていることを 報 告 しており 今 回 の 実 験 結 果 と 同 様 である Chehab らは DNA 傷 害 の 際 に Serine20 残 基 のリン 酸 化 が p53 の 安 定 化 に 重 要 であると 報 告 している(85) また Serine15 残 基 のリン 酸 化 はアポトーシスには 重 要 で あるものの(84) p53 の 安 定 化 に 必 要 不 可 欠 であるというわけではないようだ(86, 87) ただ し p53 のリン 酸 化 部 位 の 違 いによるアポトーシスに 与 える 影 響 の 違 いや 転 写 活 性 に 与 える 影 響 の 違 いについてはまだ 定 説 はなく 現 在 も 議 論 の 的 である p21 WAF1 が 抗 アポトーシス 分 子 として 働 いているという 証 拠 は 多 い Yu らは p21 WAF1 が 破 壊 されたヒト 大 腸 癌 細 胞 HCT-116 で p53 を 介 したアポトーシスが 多 く 誘 導 されることを 報 告 している(21) Wendt らは ヒト 乳 癌 細 胞 MCF-7 細 胞 において DNA 損 傷 による p21 WAF1 の 発 現 を 抑 制 すると 放 射 線 誘 発 性 アポトーシスを 亢 進 させるが p21 WAF1 を 過 剰 発 現 させ 28

30 ると 逆 に 放 射 線 誘 発 性 アポトーシスが 抑 制 されることを 報 告 した(26) また 野 生 型 の HCT-116 において p21 WAF1 を 抑 制 することにより in vitro およびヌードマウスへの 異 種 移 植 片 の 両 方 で 放 射 線 感 受 性 が 高 くなることが 報 告 されている(88, 89) さらには Sohn らは p21 WAF1 が 欠 損 している HCT-116 細 胞 において X 線 によるカスパーゼ 3 の 活 性 化 がロスコ ビチンにより 効 果 的 に 抑 制 され CDK 活 性 の 抑 制 が 放 射 線 によるアポトーシスの 抑 制 に 繋 がることを 示 した(90) 一 方 で PUMA は p53 誘 発 性 アポトーシスを 起 こさせるという 報 告 も 多 い Villunger ら は PUMA を 破 壊 したマウスの 線 維 芽 細 胞 やリンパ 球 において DNA 損 傷 によるアポトー シスが 抑 制 されることを 報 告 した(19) Yu らは p21 と PUMA 遺 伝 子 の 両 方 を 破 壊 した HCT-116 細 胞 は p53 の 外 因 性 過 剰 発 現 によるアポトーシスに 抵 抗 性 になることを 示 した(21) 以 上 のことから エダラボンによる 放 射 線 増 感 効 果 は 少 なくとも 部 分 的 には PUMA の 発 現 の 亢 進 と p21 WAF1 の 抑 制 によって 起 こっていることが 示 唆 された 同 じ p53 の 標 的 分 子 であるのに p21 WAF1 の 発 現 は 抑 制 され PUMA の 発 現 は 亢 進 するの は 矛 盾 しているように 思 われる 標 的 遺 伝 子 のプロモーター 内 の p53 の 結 合 部 位 のヌクレ オチドの 配 列 とプロモーターへの p53 の 結 合 力 はストレス 応 答 の 重 要 な 決 定 因 子 である(89) p53 とその 転 写 コアクティベーターの 相 互 作 用 はそのプロモーターとの 結 合 力 に 影 響 する と 報 告 されている(91) エダラボンは 標 的 遺 伝 子 のプロモーターと p53 の 結 合 力 に 影 響 を 与 え p21 WAF1 PUMA の 発 現 の 程 度 に 影 響 を 与 えているのかもしれない 29

31 また 低 濃 度 のエダラボンは 放 射 線 による 細 胞 内 ROS の 増 加 を 抑 制 するのに 放 射 線 増 感 効 果 を 示 すということも 矛 盾 しているように 見 える 高 濃 度 (3 mg/ml)のエダラボンは 放 射 線 による 細 胞 内 ROS の 増 加 をほぼ 完 全 に 抑 制 したが 低 濃 度 (0.75 mg/ml)では 部 分 的 にし か 抑 制 できなかった この ROS の 抑 制 が 不 完 全 であったため p53 の 蓄 積 や Serine15 のリ ン 酸 化 を 抑 制 させるには 不 十 分 であったため 潜 在 的 な 放 射 線 増 感 効 果 が 現 われてきたの かもしれない 以 上 放 射 線 増 感 効 果 について 纏 めると 0.75 mg/ml のエダラボンは p53 経 路 を 介 して 放 射 線 増 感 効 果 を 示 すことが 分 かった p21 WAF1 の 抑 制 PUMA の 亢 進 が 起 こっており こ れらも 増 感 効 果 に 寄 与 している 可 能 性 があると 思 われた 図 34 に 放 射 線 増 感 効 果 について 纏 めた 30

32 結 語 エダラボンは 高 濃 度 においては MOLT-4 細 胞 において 放 射 線 防 護 効 果 を 示 し 低 濃 度 においては 放 射 線 増 感 効 果 を 示 した 臨 床 的 なエダラボンの 血 中 濃 度 は 今 回 の 実 験 の 血 中 濃 度 よりも 遥 かに 低 いとされてお り(92) 実 際 の 臨 床 で 使 用 した 場 合 にどのような 効 果 があるのかは 分 からない 理 想 的 には 悪 性 腫 瘍 組 織 に 増 感 効 果 が 働 き 正 常 組 織 に 防 護 効 果 が 働 くとよいが 投 与 方 法 の 工 夫 な どにより 達 成 できる 可 能 性 もあると 考 えられる エダラボンはそのような 魅 力 的 な 潜 在 能 力 を 秘 めた 化 合 物 であることは 間 違 いないだろう 31

33 謝 辞 本 研 究 は 東 京 大 学 大 学 院 医 学 系 研 究 科 生 体 物 理 医 学 専 攻 放 射 線 分 子 医 学 教 室 にて 行 っ た 御 指 導 御 高 閲 を 賜 りました 放 射 線 分 子 医 学 教 室 の 宮 川 清 教 授 細 井 義 夫 前 准 教 授 松 本 義 久 前 助 教 榎 本 敦 助 教 東 京 大 学 大 学 院 医 学 系 研 究 科 生 体 物 理 医 学 専 攻 放 射 線 医 学 講 座 放 射 線 治 療 学 の 中 川 恵 一 准 教 授 井 垣 浩 前 講 師 白 石 憲 史 郎 助 教 に 深 甚 なる 敬 意 を 表 します また 多 数 の 助 言 を 頂 きました 東 京 大 学 大 学 院 工 学 系 研 究 科 原 子 力 国 際 専 攻 の 勝 村 庸 介 教 授 富 山 大 学 大 学 院 医 学 薬 学 研 究 部 放 射 線 基 礎 医 学 講 座 の 近 藤 隆 教 授 に 深 謝 いた します 32

34 参 考 文 献 1. Goffman, T. E. and Glatstein, E. (2002) Intensity-modulated radiation therapy. Radiat. Res. 158: Loffler, J. S., Smith, A. R. and Suit, H. D. (1997) The potential role of proton beams in radiation oncology. Semin. Oncol. 24: Tsujii, H. (1997) Clinical evaluation and perspective of charged particle therapy. Nippon Rinsho 55: Kouvaris, J. R., Kouloulias, V. E. and Vlahos, L. J. (2007) Amifostine: the first selective-target and broad-spectrum radioprotector. Oncologist 12: Rotman, M., Aziz, H. and Wasserman, T. (1997) Chemotherapy and Irradiation. Principle and Practice of Radiation Oncology, Third Edition , Lippincot-Raven Publishers. 6. Hosoi, Y., Miyachi, H., Matsumoto, Y., Ikehata, H., Komura, J., Ishii, K., Zhao, H. J., Yoshida, M., Takai, Y., Yamada, S., Suzuki, N. and Ono, T. (1998) A phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor wortmannin induces radioresistant DNA synthesis and sensitizes cells to bleomycin and ionizing radiation. Int. J. Cancer 78: Bernhard, W. A. and Close, D. M. Charged Particle and Photon Interaction with Matter. (2004) Eds. Mozunder, A. and Hatano, Y., pp , Marcel Dekker Inc. 33

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40 Neurochir. Suppl. 86: Ikeda, T., Xia, X. Y., Kaneko, M., Sameshima, H. and Ikenoue, T. (2002) Effect of the free radical scavenger, 3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one (MCI-186), on hypoxia-ischemia-induced brain injury in neonatal rats. Neurosci. Lett. 329: Noor, J. I., Ikeda, T., Ueda, Y. and Ikenoue, T. (2005) A free radical scavenger, edaravone, inhibits lipid peroxidation and the production of nitric oxide in hypoxic-ischemic brain damage of neonatal rats. Am. J. Obstet. Gynecol. 193: Nakashima, N., Niwa, M., Iwai, T. and Uematsu, T. (1999) Involvement of free radicals in cerebral vascular reperfusion injury evaluated in a transient focal cerebral ischemia model of rat. Free Radic. Biol. Med. 26: Watanabe, T., Morita, I., Nishi, H. and Murota, S. (1988) Preventive effect of MCI-186 on 15-HPETE induced vascular endothelial cell injury in vitro. Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids 33: Yamaguchi, T., Ida, T., Kobayashi, T., Hiraga, M., Oishi, K., Uchida, M. K. and Echizen, H. (2004) Alterations of antiproliferative effects of serum obtained from patients with acute cerebral infarction treated with a radical scavenger, edaravone, with or without amlodipine using an in vitro cultured basilar artery smooth muscle cells. Yakugaku Zasshi 124: Edaravone Acute Infarction Study Group. (2003) Effect of a novel free radical scavenger, 39

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