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1 第 28 回 山 﨑 賞 3 分 解 者 のキチナーゼ 活 性 に 関 する 研 究 1. はじめに 夏 にはいろいろなところでセミの 抜 け 殻 を 見 つけることができる しかし 夏 以 降 になると 発 見 できなくなる 何 がぬけがらを 分 解 しているのだろう これが 先 輩 が 疑 問 に 思 ったことであ り この 研 究 の 始 まりだった 文 献 を 調 べ セミの 抜 け 殻 のキチン 質 を 分 解 しているのは 放 線 菌 であると 予 想 を 立 て 1 年 目 の 研 究 を 始 めた 2.キチンについて 1 セミの 抜 け 殻 はキチンという 物 質 でできている 2 甲 殻 類 貝 類 及 び 昆 虫 類 の 殻 酵 母 椎 茸 などの 真 菌 類 等 自 然 界 に 広 く 分 布 している 3 地 球 上 での 生 産 量 はセルロースに 次 いで 多 く 年 間 約 1 千 億 トンと 推 測 されている 4 キチンから 生 成 されるキトサンは 医 療 素 材 衣 類 化 粧 品 食 品 などに 広 く 利 用 できる 5 キトサンの 生 成 に 大 量 のアルカリ 廃 液 が 発 生 するため 現 在 は 数 千 トンしか 使 われておらず そのため 世 界 最 大 の 未 使 用 バイオマスともいわれている 本 研 究 で 探 索 しているキチナーゼの 酵 素 活 性 をもつ 分 解 者 は キチンのバイオマスとしての 安 全 利 用 につながる 可 能 性 も 持 っている 3.1 年 目 の 研 究 の 要 約 抜 け 殻 の 分 解 をしているのは 放 線 菌 であると 予 想 し その 培 養 を 試 みた 温 浴 の 温 度 や 抗 生 物 質 の 代 わりの 界 面 活 性 剤 の 添 加 植 え 付 け 方 法 等 を 変 えて 高 校 の 実 験 室 で 行 うことのできる 培 養 条 件 を 探 った その 結 果 胞 子 の 状 態 でいるものを 目 覚 めさせるため 温 浴 を 行 い 洗 剤 を 添 加 した 方 が 一 般 細 菌 のコロニーの 数 が 減 り 放 線 菌 などの 菌 類 が 観 察 しやすくなることがわかった 放 線 菌 の 同 定 に 当 たっては 国 立 沼 津 高 等 工 業 専 門 学 校 の 蓮 實 文 彦 教 授 にご 協 力 いただいた 培 地 は 菌 類 用 の Yeast-Starch-Agar 培 地 を 用 いた 培 地 の 組 成 は 表 1に 示 す 表 1 Yeast-Starch-Agar 培 地 組 成 表 酵 母 エキス 1g 可 溶 性 デンプン 5g 蒸 留 水 500ml 寒 天 7.5g Ph で 15 分 間 滅 菌 4.2 年 目 の 研 究 の 要 約 2 年 目 はまず 培 地 の 改 良 を 行 った Yeast-Starch-Agar 培 地 では 養 分 が 多 すぎることを 教 えてい ただき 腐 食 酸 培 地 を 用 いることとした 腐 食 酸 培 地 の 組 成 を 表 2 に 示 す 腐 食 酸 としてフミン 酸 を 加 えている 腐 食 酸 培 地 の 方 が Yeast-Starch-Agar 培 地 よりも 細 菌 が 少 なく 放 線 菌 の 観 察 が しやすいことがわかった 次 に 放 線 菌 は 常 に 土 の 中 に 多 く 存 在 するわけではないと 考 え 放 線 菌 を 増 やすために 学 校 の 裏 に 実 験 区 をつくり 図 1の Aにすり 潰 した 抜 け 殻 を 撒 き 土 の 中 にキ チンが 多 い 状 態 を 作 り B には 何 も 撒 かなかった A 区 の 土 を で 温 浴 したものから それぞれ 放 線 菌 を 培 養 することができた このことから 実 験 区 に 抜 け 殻 を 撒 くという 方 法 で 土 の 中 の 放 線 菌 を 増 やせることがわかった

2 図 1 実 験 区 の 様 子 表 2 腐 食 酸 培 地 組 成 Ph で 15 分 間 滅 菌 CaCO3 0.04g FeSO4 7H2O O 0.02g KCl 3.42g MgSO4 7H2O 0.1g Na2HPO4 1.0g 蒸 留 水 2l 寒 天 36g フミン 酸 2.0g アリナミン 10ml 5. 今 年 の 研 究 の 目 的 昨 年 までの 研 究 から 浮 かび 上 がってきた 放 線 菌 以 外 にもキチンを 分 解 できる 分 解 者 がいるの ではないか という 疑 問 から 放 線 菌 に 限 らず 抜 け 殻 に 付 着 する 分 解 者 を 探 すこととした また 培 養 された 放 線 菌 は 本 当 にキチンを 分 解 しているのか という 疑 問 については 培 養 された 分 解 者 のキチナーゼ 活 性 の 強 さを 調 べることとした 6. 実 験 Ⅰ 土 の 中 に 生 息 している 分 解 者 の 培 養 (1) 目 的 放 線 菌 に 限 らず 抜 け 殻 に 付 着 する 分 解 者 を 探 す (2) 方 法 ア 学 校 裏 の 松 林 に 抜 け 殻 を 埋 め 土 の 中 の 分 解 者 に 抜 け 殻 を 分 解 させる 埋 めた 場 所 は 4 か 所 で 常 緑 樹 の 下 で 薄 暗 く 地 面 は 一 面 落 ち 葉 が 覆 っているところの 2 地 点 を A,B 地 点 ( 図 2) 松 の 下 で 日 当 たりがよく 草 がたくさん 生 えているところの 2 地 点 を C,D 地 点 ( 図 3)とした イ 2 週 間 後 抜 け 殻 を 掘 り 出 す( 図 4) ウ 胞 子 の 状 態 でいるものを 目 覚 めさせるため 抜 け 殻 の 温 浴 を 行 う エ 培 地 に 植 えつける 培 養 という 方 法 は その 培 地 で 生 育 できる 微 生 物 しか 得 られない という 指 摘 をいただい たので 多 くの 微 生 物 を 得 るため 1 年 目 に 使 用 した Yeast-Starch-Agar 培 地 と 2 年 目 に 使 用 した 腐 食 培 地 の2 種 類 の 培 地 を 用 いた オ 培 養 条 件 は 抜 け 殻 の 埋 めないもの 埋 めたもの 温 浴 の 温 度 は 温 浴 培 養 温 度 37 とし 恒 温 器 で 培 養 した 埋 めた 場 所 周 辺 の 土 も 同 じ 条 件 で 培 養 した カ 対 照 実 験 として 何 も 植 えつけていない 培 地 も 37 に 保 った 図 2 A,B 地 点 図 3 C,D 地 点 図 4 掘 り 出 した 様 子 (3) 結 果 ア 掘 り 出 した 抜 け 殻 の 状 態 B 地 点 の 抜 け 殻 を 掘 り 出 したところ 抜 け 殻 は 形 を 残 しておらず 黒 っぽくなっていた C 地 点 の 抜 け 殻 は 白 っぽくなっており 形 は 残 っていたがもろく ピンセットで 摘 むとす ぐに 崩 れた イ 腐 食 酸 培 地 で 培 養 されたコロニーの 数 培 養 されたカビ 細 菌 放 線 菌 のコロニー 数 の 一 例 を 表 3に 示 す コロニーとして 数 を 数 えられなかったものは 広 がりの 大 きさを+の 数 で 示 した A,B 地 点 は 近 いため 土

3 はB 地 点 で 採 集 したものを 培 養 した C,D 地 点 は 埋 めた 抜 け 殻 を 見 つけられなかったた め 結 果 の 記 載 がない 埋 めてない 抜 け 殻 は カビが+++と 多 かったが 細 菌 放 線 菌 は 培 養 できなかった 埋 めた 抜 け 殻 からは 主 にカビと 放 線 菌 が 培 養 され 細 菌 はほとんど 培 養 されなかった 温 浴 の 条 件 では 放 線 菌 のコロニーは 土 に 埋 めた 抜 け 殻 のA 地 点 で 12 個 B 地 点 で 11 個 土 で 12 個 培 養 されたが カビは 培 養 されないか +だった 100 温 浴 の 条 件 では 放 線 菌 はA 地 点 で 5 個 他 では 培 養 されなかったが カビは と 多 かった このように 放 線 菌 は 温 浴 しないほうが 多 く 得 られ カビは 100 温 浴 の ほうが 多 く 得 られた 表 3 腐 食 酸 培 地 で 培 養 した 分 解 者 のコロニーの 数 (8 月 27 日 植 え 付 け9 月 16 日 観 察 ) 温 浴 の 培 養 したもの 温 度 埋 めていない 1 抜 け 殻 2 土 に 埋 めた 3 50 抜 け 殻 土 培 養 されたもの A 地 点 B 地 点 カビ 細 菌 放 線 菌 カビ 細 菌 放 線 菌 カビ 細 菌 放 線 菌 ウ B 地 点 の 培 養 後 の 培 地 の 様 子 ( 図 5,6,7,8) 図 5の 矢 印 で 示 した 白 くて 粉 っぽいコロニーが 放 線 菌 のコロニーである 図 6は 腐 食 酸 培 地 で 培 養 されたカビであり 抜 け 殻 の 上 や 周 辺 に 広 がっているのがよく 分 かる 図 7 8 は Yeast-Starch-Agar 培 地 で 培 養 されたもので 図 7の 円 で 囲 まれたもののように カビも 培 養 することができた 図 8の 抜 け 殻 の 周 りにある 乳 白 色 で 光 沢 のあるものが 細 菌 である 以 上 のように 腐 食 酸 培 地 では 主 に 放 線 菌 カビが 培 養 され Yeast-Starch Starch-Agar 培 地 で は 細 菌 カビが 培 養 された 図 6 腐 食 酸 培 地 のカビの 様 子 図 7 カビの 様 子 図 5 放 線 菌 の 様 子 図 8 細 菌 の 様 子

4 (4) 考 察 温 浴 では 抜 け 殻 土 ともにカビは 発 生 せず 放 線 菌 が 多 く 培 養 できたが 100 温 浴 ではカビが 多 く 発 生 し 放 線 菌 は 見 られなかった 2 年 目 の 研 究 では 100 温 浴 で も 放 線 菌 が 培 養 でき 異 なる 結 果 となった これは 培 養 したものの 違 いによると 考 えられる 2 年 目 は 抜 け 殻 を 撒 いた 実 験 区 の 土 を 温 浴 し その 上 澄 みを 培 養 した 上 澄 みの 中 の 放 線 菌 は 胞 子 の 状 態 であり 100 温 浴 によ って 発 芽 が 促 されたため 培 養 できた 一 方 今 年 は 松 林 の 土 に 埋 めた 抜 け 殻 そのものを 培 養 した 放 線 菌 は 菌 糸 の 状 態 で 抜 け 殻 を 分 解 中 であり 100 温 浴 では 破 壊 されてしまい 培 養 できなかった つまり 放 線 菌 は 抜 け 殻 を 分 解 していたと 考 えられる また カビの 胞 子 は 熱 に 強 く 完 全 に 死 滅 させるには 200 の 乾 熱 滅 菌 が 用 いられる カ ビは 胞 子 の 状 態 のものがあり 温 浴 によって 発 芽 が 促 されて 100 温 浴 で 多 くなったと 考 えられる 7. 実 験 Ⅱ 分 解 者 のキチナーゼ 活 性 の 測 定 (1) 目 的 培 養 された 分 解 者 のキチナーゼ 活 性 の 強 さを 調 べる (2) 方 法 ア グリコールキチンがコンゴーレッドでどの 程 度 染 色 されるのかを 確 かめるためグリコールキチン 0.05% 0.01% 寒 天 のみの 培 地 を 作 り コンゴーレッド 0.1% 溶 液 で 染 色 した( 図 9) グリコールキチンはキチンを 水 溶 性 にした 物 質 であり 培 地 に 混 ぜることができる 図 9 染 色 の 様 子 イ グリコールキチンを 滅 菌 水 に 溶 かし( 図 10) グリコールキチンを 0.01% 濃 度 で 含 む Yeast-Starch-Agar 培 地 を 作 る ウ 培 養 された 分 解 者 をディスポループですくい 取 り 作 成 した 培 地 上 に 塗 布 する( 図 11) エ 37 で1 日 培 養 する 保 温 期 間 終 了 時 には 細 菌 のコロニーができる( 図 12) オ 培 地 をコンゴーレッドの 0.1% 溶 液 で 15 分 染 色 し 0.1% 塩 化 ナトリウム 水 溶 液 で 洗 い 流 す カ コロニー 周 辺 のハローを 探 す 細 菌 の 作 ったキチナーゼが 培 地 のキチンを 分 解 すると そこは 染 色 されず 色 が 薄 くなる この 色 の 薄 い 所 をハローという ハローの ハローの 大 きさを 測 定 し キチナーゼ 活 性 の 強 さを 測 る 図 10 グリコールキチン 水 溶 液 図 11 コロニーから 塗 布 する 様 子 図 12 1 日 培 養 後

5 (3) 結 果 図 13 は C 地 点 に 埋 めた 抜 け 殻 から 得 られた 細 菌 であり 細 菌 のコロニーを 縁 取 るように 色 が 薄 くなっており ハローがよく 分 かる 図 14 は A 地 点 と 図 15 は D 地 点 に 埋 めた 抜 け 殻 か ら 培 養 された 細 菌 で やはりハローが 観 察 できる 濃 く 染 まっているところが 細 菌 のコロニー である 図 13 染 色 した 培 地 の 様 子 図 14 A 地 点 図 15 D 地 点 細 菌 ハロー (4) 考 察 今 回 培 養 によって 得 られた 細 菌 と 放 線 菌 は いずれもキチナーゼ 活 性 を 持 っていることが 確 認 できた 8. まとめ (1) 抜 け 殻 は 室 内 に 置 いておいたときは その 形 を 保 っているが 土 に 埋 めるとやわらかくぼ ろぼろになった このことから 抜 け 殻 がなくなるのは 単 なる 風 化 ではなく 土 の 中 の 分 解 者 によると 予 想 された (2) 土 に 埋 めた 抜 け 殻 から 腐 食 酸 培 地 では 放 線 菌 とカビが Yeast-Starch-Agar 培 地 では 細 菌 と カビが 培 養 され 放 線 菌 以 外 にも 抜 け 殻 に 付 着 する 分 解 者 を 発 見 することができた (3) 温 浴 で 放 線 菌 が 多 く 培 養 され 逆 に 100 温 浴 では 放 線 菌 が 少 なかったことか ら 放 線 菌 は 菌 糸 の 状 態 で 活 動 中 であり 抜 け 殻 を 分 解 していると 考 えられる (4)コンゴーレッドによる 染 色 でハローを 見 つけることで 培 養 できた 分 解 者 のキチナーゼ 活 性 を 調 べられることが 分 かった この 方 法 により 培 養 された 放 線 菌 と 細 菌 はキチナーゼ 活 性 をもつことを 確 認 した (5) 以 上 のことから 抜 け 殻 に 付 着 している 放 線 菌 や 細 菌 は 抜 け 殻 を 実 際 に 分 解 していることが 確 かめられた 9. 今 後 の 課 題 キチナーゼ 活 性 を 示 す 細 菌 放 線 菌 を 発 見 することができたので さらに 一 つ 一 つ 分 離 したコ ロニーを 作 成 し ハローの 大 きさからキチナーゼ 活 性 の 強 さを 比 較 したい また 今 回 調 べたカ ビはキチナーゼ 活 性 を 持 っていなかったので 他 のカビについてもキチナーゼ 活 性 を 持 つのか 調 べ たい さらに 乳 酸 菌 酵 母 菌 等 他 の 細 菌 類 についても 調 べていきたい 10. 謝 辞 放 線 菌 の 同 定 に 当 たっては 国 立 沼 津 高 等 工 業 専 門 学 校 の 蓮 實 文 彦 教 授 にご 協 力 いただいた 改 めてお 礼 申 し 上 げます 11. 参 考 文 献 1, 飯 村 研 - 放 線 菌 - a.html 2, 日 本 キチン キトサン 学 会 3.キチナーゼをコードするDNA 及 びキチナーゼの 製 造 方 法 味 の 素 株 式 会 社

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