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1 Cell-able 上 で 形 成 したヒト 肝 細 胞 スフェロイドを 用 いた 肝 毒 性 予 測 東 洋 合 成 工 業 株 式 会 社

2 Cell-able 外 観 と 培 養 表 面 培 養 表 面 100 µm 細 胞 非 接 着 領 域 ( 水 溶 性 感 光 材 ) 細 胞 接 着 領 域 (コラーゲンコート)

3 Cell-able 外 観 と 培 養 表 面 100 µm ラット 初 代 肝 細 胞 播 種 から48 時 間 の 動 画

4 Cell-able 外 観 と 培 養 表 面 ヒト 初 代 肝 細 胞 播 種 5 日 目 100 µm 通 常 の 培 養 操 作 で 直 径 約 100µm, 厚 み20~40µmの3Dスフェロイドを 形 成

5 Cell-able 上 で 培 養 した 初 代 肝 細 胞 の 形 態 と 肝 特 異 的 機 能 維 持 Feeder cells Disse spacelike structure Hepatocyte ラット 初 代 肝 細 胞 スフェロイド 断 面 TEM 写 真

6 Cell-able 上 で 培 養 した 初 代 肝 細 胞 の 形 態 と 肝 特 異 的 機 能 維 持 ヒト 初 代 肝 細 胞 アルブミン 産 生 能 経 時 変 化 Feeder cells Disse spacelike structure Hepatoc yte 接 着 ロット 非 接 着 ロット ラット 初 代 肝 細 胞 スフェロイド 断 面 TEM 写 真

7 Cell-able 上 で 培 養 した 初 代 肝 細 胞 の 形 態 と 肝 特 異 的 機 能 維 持 Feeder cells Disse spacelike structure Hepatoc yte ラット 初 代 肝 細 胞 スフェロイド 断 面 TEM 写 真 ヒト 初 代 肝 細 胞 CYP3A4 活 性 ( 基 礎 活 性 と 誘 導 活 性 ) 誘 導 :リファンピシン アルブミン 産 生 能 経 時 変 化

8 Cell-able 上 で 培 養 した 初 代 肝 細 胞 の 形 態 と 肝 特 異 的 機 能 維 持 排 泄 トランスポーター 機 能 CDFDAは 肝 細 胞 に 取 り 込 まれ た 後 蛍 光 物 質 であるCDFに 加 水 分 解 され ABCCトランスポー ターによって 胆 汁 管 へ 排 泄 され ます 図 は Cell-able で 培 養 14 日 目 のヒト 初 代 肝 細 胞 スフェ ロイドにCDFDA 添 加 10 分 後 の 共 焦 点 レーザー 顕 微 鏡 写 真 Feeder cells Disse spacelike structure Hepatoc yte ラット 初 代 肝 細 胞 スフェロイド 断 面 TEM 写 真 CDFDA; Carboxydichlorofluorescein diacetate CDF; Carboxydichlorofluorescein CYP3A4 活 性 ( 基 礎 活 性 と 誘 導 活 性 ) アルブミン 産 生 能 経 時 変 化

9 Cell-able の の 特 徴 簡 単 な 操 作 で スフェロイド 培 養 が 可 能 均 一 サイズ 同 じ 数 のスフェロイドが 形 成 アッセイの 再 現 性 が 良 好 肝 特 異 的 機 能 を 保 持 した 状 態 で 長 期 間 培 養 可 能 肝 細 胞 以 外 の 細 胞 でもスフェロイドを 形 成 例 )ガン 細 胞 株 144 例 でスフェロイド 形 成 を 確 認 Data from EurofinsPanlabs, Inc. ( 米 国 ) がん 細 胞 を 使 ってよりin vivoに に 近 い 薬 剤 感 受 性 試 験 が 可 能

10 Cell-able 3 次 元 培 養 ヒト 肝 細 胞 を 用 いた 応 用 例 薬 物 性 肝 毒 性 (Drag induced liver injury, DILI) の 予 測

11 凍 結 ヒト 初 代 肝 細 胞 In vitor 試 験 に 使 用 する 場 合 の 問 題 点 量 が 限 られている 高 価 である 凍 結 融 解 によるダメージ 安 定 した 培 養 が 難 しい PXB-cells に に 着 目

12 PXB-cells 移 植 したヒト 初 代 肝 細 胞 が 約 1,000 倍 に 増 加 * ヒト 初 代 肝 細 胞 に 近 い 遺 伝 子 発 現 代 謝 活 性 を 保 持 * 価 格 は 凍 結 ヒト 初 代 肝 細 胞 の1/2~1/3 程 度 凍 結 していないため 長 期 間 安 定 した 培 養 が 可 能 Cell-able プレートに 播 種 して 輸 送 可 能 凍 結 ヒト 初 代 肝 細 胞 置 換 率 約 80% * * 石 田 雄 二, 山 崎 ちひろ, 立 野 知 世 (2013) ヒト 肝 細 胞 キメラマウス 由 来 新 鮮 ヒト 肝 細 胞 PXB-cells 細 胞 45,

13 Cell-able 上 で 培 養 したヒト 肝 細 胞 スフェロイドを 用 いた イメージングによるDILI 試 験 凍 結 ヒト 初 代 肝 細 胞 キメラマウス 由 来 新 鮮 ヒト 肝 細 胞 (PXB-cells ) Cell-able 18 薬 物 を2 週 間 暴 露 後 蛍 光 染 色 ; 核 GSH ミトコンドリア 膜 電 位 ImageXpressMicro High content screening assay system 3T3 swissalbino と 共 培 養

14 Vehicle (0.1% DMSO) AA 暴 露 濃 度 低 位 相 差 Acetaminophen The cells were exposed to acetaminophen for 14 days. ヒト 初 代 肝 細 胞 Nuclei DRAQ5 GSH mbcl MMP TMRM 200 µm 位 相 差 PXB-cells Nuclei DRAQ5 GSH mbcl 核 GSH ミトコンドリア 膜 電 位 MMP TMRM 200 µm 画 像 解 析 により 数 値 データを 取 得 3マーカーのうち1つ でもCut off 値 * 以 下 のシグナルを 示 した 場 合 その 薬 物 をDILI 陽 性 と 判 定 した 高 * Cut off; Vehicle 値 を 基 準 に 設 定

15 LTKB*を を 参 考 に 判 定 基 準 を 決 定 薬 物 のDILI 判 定 基 準 Status/ label NM DILI Severity score 2,3 4,5 6-8 N AR +/- WP +/- P P D BW WD P P P Drugs of no concern for DILI ; N Drugs of less concern for DILI ; +/- Drugs of most concern for DILI; P LTKBに に 記 載 が 無 い 薬 物 につい ては 2008 年 Xuらの 論 文 の Clinical DILIの の 判 定 に 従 った * Liver Toxicity Knowledge Base FDA で 承 認 されている 薬 物 がDILIを 引 き 起 こす 度 合 いを 示 す 指 標 の 知 識 基 盤

16 各 試 験 結 果 の 比 較 ID 判 定 LTKB+ Clinical DILI Xu, 2008, 1-d, Matrigel, 100x Cmax Khetani, 2013, 16-d, co-culture, 1-100x Cmax Human hepatocyte, 14-d, co-culture Cell-able, 1-30x Cmax PXB-cells, 14-d, co-culture Cell-able, 1-60x Cmax Aspirin Lidocaine Prednisone Bupropion HCl +/- Cyclophosphamide +/- Imipramine HCl +/- Propranolol HCl +/- Nifedipine +/- Acetaminophen Benzbromarone CIprofloxacin HCl Clomiplamine HCl Diclofenac Na Estrone Isoniazid Phenacetin Troglitazone Ketoconazol NA NA, N, N, N, N, N, N 1) Xuet al. (2008) Cellular Imaging Predictions of Clinical Drug-Induced Liver Injury. Toxicological Sciences 105, ) Khetaniet al. (2013) The Use of MicropatternedCo-cultures to Detect Compounds that Cause Drug induced Liver Injury in Humans. Toxicological Sciences 132, GSH

17 薬 物 によって 引 き 起 こされる 肝 毒 性 (DILI) 予 測 系 特 異 性 と 感 度 Cell-ble で 行 った2つのDILI 予 測 試 験 は 感 度 特 異 性 とも 2008 年 Xuら 1) 2013 年 Khetaniら 2) の 報 告 と 同 等 以 上 であった Human hepatocyte Cell-able Xu, ) Khetani, ) PXB-cells Human hepatocyte Human hepatocyte 特 異 性 * 100% 100% 100% 67% 感 度 ** 90% 80% 56% 90% * 特 異 性 ;DILI 陰 性 薬 物 を 陰 性 と 判 定 した 割 合 ** 感 度 ;DILI 陽 性 薬 物 を 陽 性 と 判 定 した 割 合 1) Xuet al. (2008) Cellular Imaging Predictions of Clinical Drug-Induced Liver Injury. Toxicological Sciences 105, ) Khetaniet al. (2013) The Use of MicropatternedCo-cultures to Detect Compounds that Cause Drug induced Liver Injury in Humans. Toxicological Sciences 132,

18 Cell-able PXB-cells ImageXpress for DILI 少 ない 細 胞 数 ( 従 来 法 の1/3) Cell-able 384 plateなら なら1/8の 細 胞 数 でOK 1well 多 項 目 測 定 (multiplex) 良 好 な 特 異 性 感 度 PXB-cells により 初 代 肝 細 胞 の 希 少 性 からくる 問 題 点 などを 解 決

19 謝 辞 国 立 成 育 医 療 研 究 センター 絵 野 沢 伸 先 生 モレキュラーデバイスジャパン 株 式 会 社 鈴 木 真 帆 海 様 株 式 会 社 フェニックスバイオ 松 見 達 也 様 石 田 雄 二 様

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