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1 Annual Report of the Institute for Virus Research Kyoto University Volume

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3 ANNUAL REPORT OF THE INSTITUTE FOR VIRUS RESEARCH 2015

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5 ANNUAL REPORT OF THE INSTITUTE FOR VIRUS RESEARCH, KYOTO UNIVERSITY VOLUME 58 Editorial Board Sugita Masahiko (Editor in Chief) Masao Matsuoka, Toshiyuki Otsuka, Hiroki Kato 2015 THE INSTITUTE FOR VIRUS RESEARCH KYOTO UNIVERSITY

6 PUBLISHED BY THE INSTITUTE FOR VIRUS RESEARCH, KYOTO UNIVERSITY SHOGOIN-KAWAHARACHO, SAKYO-KU, KYOTO , JAPAN Cover: Inflammation-related mrnas are degraded by two proteins Regnase-1 and Roquin in a spatiotemporally distinct manner. Whereas Regnase-1 cleaves translationally active mrnas in endoplasmic reticulum (Top), Roquin degrades translationally inactive mrnas in stress granules (Bottom). Lack of Regnase-1 in mice leads to the development of severe autoimmune inflammatory diseases (Middle right) compared with wild-type control (Middle left).

7 CONTENTS Chronological Table 1 Research Activities Department of Viral Oncology(がんウイルス 研 究 部 門 ) Laboratory of Gene Analysis(がん 遺 伝 子 研 究 分 野 ) 7 Laboratory of Cell Regulation( 細 胞 制 御 研 究 分 野 ) 17 Laboratory of Tumor Biogenesis( 生 体 発 がん 機 構 研 究 分 野 ) 22 Laboratory of Human Tumor Viruses(ヒトがんウイルス 研 究 分 野 ) 29 Department of Genetics and Molecular Biology( 遺 伝 子 動 態 調 節 研 究 部 門 ) Laboratory of Molecular Genetics( 分 子 遺 伝 学 研 究 分 野 ) 42 Laboratory of Biochemistry( 情 報 高 分 子 化 学 研 究 分 野 ) 50 Department of Biological Responses( 生 体 応 答 学 研 究 部 門 ) Laboratory of Biological Protection( 生 体 防 御 研 究 分 野 ) 60 Laboratory of Infection and Prevention( 感 染 防 御 研 究 分 野 ) 67 Department of Cell Biology( 細 胞 生 物 学 研 究 部 門 ) Laboratory of Subcellular Biogenesis( 構 造 形 成 学 研 究 分 野 ) 79 Laboratory of Growth Regulation( 増 殖 制 御 学 研 究 分 野 ) 85 Laboratory of Signal Transduction( 信 号 伝 達 学 研 究 分 野 ) 96 Laboratory of Integrated Biological Information( 高 次 生 体 情 報 研 究 分 野 ) 107 Center for Human Retrovirus Research( 附 属 ヒトレトロウイルス 研 究 施 設 ) Laboratory of Viral Pathogenesis(ウイルス 病 態 研 究 領 域 ) 111 Laboratory of Virus Control(ウイルス 制 御 研 究 領 域 ) 122 Experimental Research Center for Infectious Diseases( 附 属 感 染 症 モデル 研 究 センター) Laboratory of Ultrastructural Virology(ウイルス 微 細 構 造 研 究 領 域 ) 133 Laboratory of Primate Model( 霊 長 類 モデル 研 究 領 域 ) 136 Laboratory of Evolutional Virology( 進 化 ウイルス 研 究 領 域 ) 144 Center for Emerging Virus Research( 附 属 新 興 ウイルス 研 究 センター) 155 Reproductive Engineering Team( 動 物 実 験 委 員 会 マウス 作 製 支 援 チーム) 161 Computer Network of Institute for Virus Research (ウイルス 研 究 所 コンピューターネットワークシステム) 165 Seminars of the Institute for Virus Research 168 Organization and Staff( 構 成 員 ) 170

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9 CHRONOLOGICAL TABLE 1956 April Institute for Virus Research, Kyoto University, was founded with two departments (Pathology and Biophysics) April Scientific Lectures for the Public were presented commemorating the opening of the Institute (the successive Memorial Lecture Series have been presented annually hereafter) April Department of Biochemistry and Department of Serology and Immunology were established April Department of Prevention and Therapeutics was established December "Advances in Virology", Vol. 1 (in Japanese) was published as collection of the Memorial Lectures (the successive volumes were published annually hereafter until 1960) December "Annual Report of the Institute for Virus Research", Vol. 1, was published (the successive volumes have been published annually hereafter) July Virus Diagnosis Center was established October The 1st Symposium of the Institute for Virus Research was held under the auspices of the Institute with the nationwide participants. The proceedings of the Symposium were published as the first issue of the new series of "Advances in Virology" in Japanese (the successive Symposia have been held and their proceedings published annually hereafter) April Department of Tumor Virus was established October Several staff members were appointed academic staff of the Graduate School of Medicine, and students of the School were first admitted to the Institute December Several staff members were appointed academic staff of the Graduate School of Science, and students of the School were first admitted to the Institute April Virus Diagnosis Center was renamed Virological Diagnosis Center September Construction of the new building for the Institute commenced March Construction of the new building was completed April Department of Genetics was established April Department of Molecular and Cellular Virology was established April Department of Neurological Virus Disease was established as such that Visiting Staff be appointed April Animal Laboratory for Experimental Virus Infection was established March Construction of extension of the main building was completed. Thus the main building now constitutes five floors with a basement occupying the aggregate area of 5,410m 2.

10 The major part (ca. 481m 2 ) of the extended area serves for researches involving radioisotope labelling and in vitro DNA recombination experiments requiring the P3 facilities May The memorial events for the 30th anniversary of foundation of this Institute were held on May November Professor Yorio Hinuma was honoured as "Person of Cultural Merits (Bunkakorosha)" 1987 May Department of Biophysics and Department of Tumor Virology were reorganized to form Department of Viral Oncology which consists of 4 Laboratories April Virological Diagnosis Center was reorganized to become Research Center for Immunodeficiency Virus which consists of Laboratory for AIDS Immunology and Laboratory of Viral Pathogenesis April Department of Biochemistry and Department of Genetics were reorganized to form Department of Genetics and Molecular Biology which consists of 3 Laboratories March Construction of a new building was partly completed April Department of Pathology and Department of Molecular and Cellular Virology were reorganized to form Department of Cell Biology which consists of 3 Laboratories, while Department of Serology and Immunology, Department of Prevention and Therapeutics and Department of Neurological Virus Disease were reorganized to form Department of Biological Responses which consists of 2 laboratories and one for visiting staff April Laboratory of Regulatory Information was established within the Department of Cell Biology to host a visiting professor as well as a research group December Construction of the new building which accommodates three laboratories from this Institute as well as some from the Medical School and the Center for Molecular Biology and Genetics of the University was completed October Construction of a new animal facility with some laboratories was completed April One stuff member was appointed academic staff of the Graduate School of Pharmaceutical Sciences, and students of the school were first admitted to the Institute April Research Center for Immunodeficiency Virus was reorganized to become Research Center for Acquired Immunodeficiency Syndrome April Laboratory of Virus Control in Research Center for Immunodeficiency Virus was established as such that Visiting Stuff be appointed April Several staff members were appointed academic staff of the Graduate School of Biostudies, and students of the school were first admitted to the Institute.

11 2002 April The Experimental Research Center for Infected Animals was abolished and the Experimental Research Center for Infectious Diseases was established instead April Research Center for Emerging Virus was established June The Institute commenced service as a Joint Usage / Research Center for fusion of advanced technologies and innovative approaches to viral infections and life science April Center for Acquired Immunodeficiency Syndrome Research was reorganized to become Center for Human Retrovirus Research April Research Center for Emerging Virus was reorganized to become Center for Emerging Virus Research October Laboratory of Evolutional Virology was established in Experimental Research Center for Infectious Diseases September Laboratory of Ultrastructural Virology was established in Experimental Research Center for Infectious Diseases.

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13 Research Activities

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15 Department of Viral Oncology Laboratory of Gene Analysis I. First Group Members Professor Associate Professor Assistant Professor (Spe.) Research Fellow Graduate Student Technical assistant Yoshinori Akiyama Hiroyuki Mori Yohei Hizukuri (Center for Emerging Virus Research) Eiji Ishii Yasushi Daimon, Ryoji Miyazaki, Koichiro Akiyama, Kohei Yoshitani, Sohei Sakashita, Ayumi Ga, Naomi Myougo, Yutaro Yamagata, Taiga Yoneshige Michiyo Sano Introduction The research projects carried out in this group are concerned with post-translational events in the expression of genetic information. Specifically, processes of protein translation, protein translocation across and integration into the membrane, membrane protein proteolysis and extracytoplasmic stress responses are investigated by combined molecular genetic, biochemical biophysical and structural approaches. Topics 1) A novel SRP recognition sequence in the homeostatic control region of heat shock transcription factor σ 32 : R. MIYAZAKI, T. YURA 1, T. SUZUKI 2, N. DOHMAE 2, H. MORI and Y. AKIYAMA ( 1 Kyoto Sangyo University, 2 RIKEN) Heat shock response plays a major role in sustaining protein homeostasis in all organisms. In Escherichia coli, the activity and amount of transcription factor σ 32, which is responsible for expression of heat shock genes, elevate transiently upon heat shock. The initial induction is followed by negative feedback to inactivate and degrade σ 32. Previous work revealed that, in addition to the molecular chaperones (DnaK/DnaJ and GroEL/GroES) and a membrane protease (FtsH), signal recognition particle (SRP) plays a critical role in this feedback control through targeting σ 32 to the membrane 1). Here we identified in vivo nearest neighbor proteins of σ 32 to decipher their molecular interaction properties. The results of in vivo photo-cross-linking experiments indicate that the homeostatic control region of σ 32 interacts with Ffh (the protein subunit of SRP) and the molecular chaperones DnaK, DnaJ and HtpG at multiple positions. Importantly, the σ 32 Ffh

16 interaction observed was significantly affected by mutations in the control region that compromise the feedback regulation but not by a total deletion of DnaK and DnaJ. Furthermore, photo- and disulfide-crosslinking experiments demonstrated that Ffh uses its signal peptide binding site to associate with the homeostatic control region of σ 32. On the basis of these findings, we propose that SRP delivers σ 32 to the membrane by directly recognizing its control region, which lacks a continuous hydrophobic stretch but could form an amphipathic helix. Homeostatic regulation of the heat shock response thus requires a novel type of SRP recognition mechanism. 1) Lim, B., Miyazaki, R. et al. (2013). Heat shock transcription factor σ 32 co-opts the signal recognition particle to regulate protein homeostasis in E. coli. PLoS Biology, 11, e ) Marine Vibrio features alternative cation-dependence of SecDF paralogs regulated by a nascent polypeptide for salinity adaptation:e. ISHII, S. CHIBA 2, S. SAKASHITA, N. HASHIMOTO, S. KOJIMA 1, M. HOMMA 1, K. ITO 2, Y. AKIYAMA and H. MORI ( 1 Nagoya University, 2 Kyoto Sangyo University) The translocation of proteins across biological membranes is universally conserved from bacteria to animals. In bacteria, the translocation machinery is composed of SecYEG, the polypeptide-conducting channel, SecA, the essential motor ATPase, and SecDF, the membrane integrated complex. SecDF interacts with the SecYEG translocon in bacteria and enhances protein export in a proton-motive-force-dependent manner. Vibrio alginolyticus, a marine-estuarine bacterium, contains two SecDF paralogs, V.SecDF1 and V.SecDF2. We showed that the export-enhancing function of V.SecDF1 requires Na + instead of H +, whereas V.SecDF2 is Na + -independent, presumably requiring H +. In accord with the cation-preference difference, V.SecDF2 was only expressed under limited Na + concentrations whereas V.SecDF1 was constitutive. However, it is not the decreased concentration of Na + per se that the bacterium senses to up-regulate the V.SecDF2 expression, because marked up-regulation of the V.SecDF2 synthesis was observed irrespective of Na + concentrations under certain genetic/physiological conditions: (i) when the secdf1 VA gene was deleted and (ii) whenever the Sec export machinery was inhibited. VemP (Vibrio export monitoring polypeptide), a secretory polypeptide encoded by the upstream ORF of secdf2 VA, plays the primary role in this regulation by undergoing regulated translational elongation arrest, which leads to unfolding of the Shine Dalgarno sequence for translation of secdf2 VA. Genetic analysis of V. alginolyticus established that the VemP-mediated regulation of V.SecDF2 is essential for the survival of this marine bacterium in low-salinity environments. These results reveal that a class of marine bacteria exploits nascent-chain ribosome interactions to optimize their protein export pathways to propagate efficiently under different ionic environments that they face in their life cycles.

17 List of Publications Akiyama, K. a, Mizuno, S. a, Hizukuri, Y., Mori, H., Nogi, T., and Akiyama, Y. (2015). Role of membranereentrant β-hairpin-like loop of RseP protease in selective substrate cleavage. elife 4, e a equally contributed Ishii, E., Chiba, S., Hashimoto, N., Kojima, S., Homma, M., Ito, K., Akiyama, Y., and Mori, H. (2015). Nascent chain-monitored remodeling of the Sec machinery for salinity adaptation of marine bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 112, E5513 E5522. Daimon, Y., Narita, S.-i., and Akiyama, Y. (2015). Activation of TA system toxins suppresses lethality caused by the loss of σ E in Escherichia coli. J. Bacteriol. 197, 檜 作 洋 平 秋 山 芳 展 (2015). 膜 内 部 でのタンパク 質 分 解 とストレス 応 答 制 御 別 冊 医 学 のあゆみ レドックス UPDATE ストレス 制 御 の 臨 床 医 学 健 康 医 学 ( 監 修 : 平 家 俊 男 淀 井 淳 司 ) 医 歯 薬 出 版 株 式 会 社 pp Akiyama, K., Mizuno, S., Hizukuri, Y., Mori, H., Nogi, T., Akiyama, Y.: Analysis of the conserved membrane-reentrant loop of RseP, an intramembrane-cleaving protease. The 13th International Student Seminar, Kyoto, Japan, March 3-7, Mori, H., Ishii E., Chiba, S., Hashimoto, N., Kojima, S., Homma, M., Ito, K. and Akiyama, Y.:Nascent chain-mediated regulation of a SecDF paralog optimizes sodium dependence of protein export for environmental adaptation of a marine-estuarine bacterium, Vibrio alginolyticus. Progress 100: Kyushu-U and Stanford-U Joint Research and Education Program, First Symposium: From Genes to Human Diseases, Fukuoka, March 16-17, 2015 秋 山 芳 展 : 大 腸 菌 膜 内 切 断 プロテアーゼ RseP の 特 徴 的 な 膜 内 挿 入 ループ 領 域 の 機 能 解 析 年 度 国 立 遺 伝 学 研 究 所 研 究 会 単 細 胞 の 増 殖 メカニズムの 先 端 的 研 究 三 島 2015 年 3 月 23 日 - 24 日 森 博 幸 : 新 生 鎖 VemP による V.SecDF2 の 発 現 制 御 を 利 用 した Vibrio 菌 の 環 境 適 応 年 度 国 立 遺 伝 学 研 究 所 研 究 会 単 細 胞 の 増 殖 メカニズムの 先 端 的 研 究 三 島 2015 年 3 月 23 日 - 24 日

18 大 門 康 志 成 田 新 一 郎 : 大 腸 菌 の 表 層 ストレス 応 答 に 関 わる σ E の 必 須 性 は TA システムにおける toxin の 活 性 化 により 解 消 される. 第 88 回 日 本 細 菌 学 会 総 会 岐 阜 2015 年 3 月 26 日 - 28 日 大 門 康 志 成 田 新 一 郎 秋 山 芳 展 :σ E の 欠 失 による 大 腸 菌 の 致 死 性 は TA システムトキシンの 活 性 化 により 抑 制 される 年 度 農 芸 化 学 会 大 会 岡 山 2015 年 3 月 26 日 - 30 日 檜 作 洋 平 秋 山 芳 展 : 表 層 ストレス 応 答 制 御 に 関 与 する RseP プロテアーゼの 基 質 切 断 反 応 の 細 胞 内 蛍 光 イメージングに 向 けた 取 り 組 み. 第 12 回 21 世 紀 大 腸 菌 研 究 会 大 津 2015 年 6 月 4 日 - 5 日 大 門 康 志 成 田 新 一 郎 秋 山 芳 展 :TA システムのトキシンの 活 性 化 や 低 濃 度 の 抗 生 物 質 による 大 腸 菌 の 生 育 における σ E の 必 須 性 の 解 消 機 構. 第 12 回 21 世 紀 大 腸 菌 研 究 会 大 津 2015 年 6 月 4 日 - 5 日 宮 﨑 亮 次 由 良 隆 鈴 木 健 裕 堂 前 直 森 博 幸 秋 山 芳 展 : 熱 ショック 転 写 因 子 σ 32 とシグナル 認 識 粒 子 の 相 互 作 用 機 構 の 解 析. 第 12 回 21 世 紀 大 腸 菌 研 究 会 大 津 2015 年 6 月 4 日 - 5 日 秋 山 光 市 郎 水 野 慎 也 檜 作 洋 平 森 博 幸 禾 晃 和 秋 山 芳 展 :S2P ファミリー 膜 内 切 断 プロ テアーゼ RseP の 膜 内 挿 入 ループ 領 域 を 介 した 基 質 選 別. 第 12 回 21 世 紀 大 腸 菌 研 究 会 大 津 2015 年 6 月 4 日 -5 日 檜 作 洋 平 : 細 菌 表 層 ストレス 応 答 の 制 御 機 構 と 生 体 イメージング 解 析. 第 2 回 生 命 理 学 研 究 会 名 古 屋 2015 年 8 月 29 日 檜 作 洋 平 秋 山 芳 展 :Live-cell imaging of a proteolytic event by an intramembrane protease RseP that regulates extracytoplasmic stress response. 第 53 回 日 本 生 物 物 理 学 会 年 会 金 沢 2015 年 9 月 13 日 - 15 日 森 博 幸 :タンパク 質 分 泌 を 駆 動 する 反 復 モーターの 駆 動 原 理. 第 53 回 生 物 物 理 学 会 年 会 シンポ ジウム 生 体 マシナリーにおける 力 発 生 と 進 化 の 共 通 原 理 金 沢 2015 年 9 月 13 日 -15 日 石 井 英 治 : 翻 訳 アレストを 介 したビブリオ 属 細 菌 の 低 食 塩 環 境 適 応 機 構 新 生 鎖 の 生 物 学 第 2 回 若 手 ワークショップ 山 形 2015 年 9 月 28 日 -30 日 秋 山 光 市 郎 : 大 腸 菌 膜 内 切 断 プロテアーゼ RseP の 膜 内 挿 入 ループ 領 域 を 介 した 基 質 選 別. 新 生 鎖 の 生 物 学 第 2 回 若 手 ワークショップ 山 形 2015 年 9 月 28 日 - 30 日

19 宮 﨑 亮 次 : 熱 ショック 転 写 因 子 σ 32 との 膜 への 輸 送 を 介 した 新 奇 な 機 能 制 御 機 構. 新 生 鎖 の 生 物 学 第 2 回 若 手 ワークショップ 山 形 2015 年 9 月 28 日 - 30 日 米 重 大 河 :in vitro 膜 透 過 実 験 系 を 用 いた VemP の 翻 訳 アレストの 解 除 機 構 の 解 明. 新 生 鎖 の 生 物 学 第 2 回 若 手 ワークショップ 山 形 2015 年 9 月 28 日 - 30 日 坂 下 宗 平 :LacZ レポーターシステムを 使 用 した VemP アレストモチーフの 解 明 に 向 けて. 新 生 鎖 の 生 物 学 第 2 回 若 手 ワークショップ 山 形 2015 年 9 月 28 日 - 30 日 Akiyama, K., Mizuno, S., Hizukuri, Y., Mori, H., Nogi, T., Akiyama, Y.: Analysis of the conserved membrane-reentrant loop of RseP, an intramembrane-cleaving protease. The 22nd East Asia Joint Symposium on Biomedical Research, Okinawa, Japan, November 11-14, 檜 作 洋 平 秋 山 芳 展 : 細 菌 表 層 ストレス 応 答 を 制 御 する S2P ファミリー 膜 内 切 断 プロテアーゼの 細 胞 内 イメージング 解 析. 第 38 回 日 本 分 子 生 物 学 会 大 会 第 88 回 日 本 生 化 学 会 大 会 合 同 大 会 神 戸 2015 年 12 月 1 日 - 4 日 石 井 英 治 橋 本 成 祐 千 葉 志 信 小 嶋 誠 司 本 間 道 夫 伊 藤 維 昭 秋 山 芳 展 森 博 幸 :ビブリオ 属 細 菌 の 低 食 塩 環 境 への 適 応 :アレストペプチド VemP による SecDF 発 現 制 御 の 役 割. 第 38 回 日 本 分 子 生 物 学 会 大 会 第 88 回 日 本 生 化 学 会 大 会 合 同 大 会 神 戸 2015 年 12 月 1 日 - 4 日 宮 﨑 亮 次 由 良 隆 鈴 木 健 裕 堂 前 直 森 博 幸 秋 山 芳 展 : 熱 ショック 転 写 因 子 σ 32 とシグナル 認 識 粒 子 の 相 互 作 用. 第 38 回 日 本 分 子 生 物 学 会 大 会 第 88 回 日 本 生 化 学 会 大 会 合 同 大 会 神 戸 2015 年 12 月 1 日 - 4 日 秋 山 光 市 郎 水 野 慎 也 檜 作 洋 平 森 博 幸 禾 晃 和 秋 山 芳 展 :S2P ファミリー 膜 内 切 断 プロ テアーゼ RseP の 膜 内 挿 入 ループ 領 域 を 介 した 基 質 選 別. 第 38 回 日 本 分 子 生 物 学 会 大 会 第 88 回 日 本 生 化 学 会 大 会 合 同 大 会 神 戸 2015 年 12 月 1 日 - 4 日 Mori, H., Ishii, E., Chiba, S., Hashimoto, N., Kojima, S., Homma, M., Ito, K. and Akiyama, Y.: Nascent chain-monitored remodeling of the Sec machinery for salinity adaptation of marine bacteria. 第 38 回 日 本 分 子 生 物 学 会 大 会 第 88 回 日 本 生 化 学 会 大 会 合 同 大 会 Symposium Nascent chains: the ribosome as a hub for protein quality control, Kobe, Japan, December 1-4, 2015

20 II. Second Group Members Associate Professor Assistant Professor Hiroyuki Sakai Shin-ichi Yanagawa Topics 1) Analysis of Keratin-Associated Protein 13-Induced Activation of Canonical Wnt Signaling Pathway in vivo: S. YANAGAWA I found that Keratin associated protein (Krtap) 13 binds to cytoplasmic portion of LRP6, a co-receptor for Wnt. Surprisingly, Krtap13 overexpression markedly stimulates Wnt signaling. Krtap13 was found to induce co-clustering of LRP6 and Dvls, thereby inhibiting Axin mediated β-catenin destruction complex that leads to activation of Wnt signaling. To analyze effect of ectopic overexpression of Krtap13 in vivo, I generated a Krtap13-trans-gene (Krtap13-Tg) consisting of CAG-promoter, loxp-polya-loxp cassette, and 3XFLAG-tagged human Krtap13 cdna and transgenic mouse lines carrying this Tg were established. This Krtap13-Tg can express Krtap13 only after Cre-induced recombination of Tg. By crossing these Krtap13-Tg mice with another transgenic mice that express Cre in a tissue-specific way, I generated a mice system that allowed tissue specific overexpression of Krtap13. Twenty-five% of mice born from crossing between Krtap13-Tg mice and CAG- Cre-Tg mice developed Lymphoma/ Leukemia 1~1.5 year after birth. Lymphoma/ Leukemia cell typing analyses using FACS are underway. 2) Identification of Novel Function of Human Papillomavirus E4: H. SAKAI HPV infection begins in the basal cells of the epithelium, and as these cells divide, differentiate, and migrate toward the surface of the epithelium, the virus is able to complete its life cycle. The viral life cycle depends on the differentiation of the epithelium, but how the life cycle is controlled is not well understood. It is interesting that although viral oncoproteins cause the increase of cellular proliferation and/or transformation, terminally cellular differentiation of epithelium is required for completion of the viral life cycle. The expression of E1^E4 occurs in the upper layers of the HPV-infected epithelium, coordinating with the onset of viral genome amplification and the expression of viral late genes. It is known that E1^E4 disrupts the keratin networks. It is also known that E1^E4 induces G 2 /M cell cycle arrest. But it is yet to be known

21 well about the details of E1^E4. To investigate novel functions of E1^E4, we performed yeast two-hybrid assays and got several candidate proteins as which interacts with E1^E4. As the results, it is suggested that E1^E4 associates with the Aggresome compartment that is one of cellular inclusion body systems. In the future, we will ascertain the function of E1^E4 and its involvement in the viral life cycle. 3) Analysis of CAF formation mechanism using HPV positive cells: H. SAKAI In many reports, the importance of the interaction between the cancer stem cells and the microenvironments has been indicated. In the previous studies, it was suggested that HPV E6, E7, c-myc, and H-ras were the key factors for the establishment of the cancer stem cell in the cervical cancer. These factors might alter the microenvironment to be favorable for cancer development. To examine the effect of the cancer cells in fostering the cancer-associated fibroblasts (CAFs), HPV-positive cancer cells, SiHa, HeLa, and Caski, were applied to the organotypic raft culture, and the effects on the fibroblasts were analyzed by geneexpression profiling. The expressions of CD44 and α-sma were used as the markers for the CAF induction. In another experiment, the fibroblasts expressing an oncogene, myc, src, or ras were used as the transformed fibroblasts, and normal HFKs or HeLa cells were overlaid on these cells. The effect of TGFβ produced by CAFs on the EMT of normal and HPV-positive keratinocytes was also examined. These inter-cellular communications might be important for the progression of the cervical cancer. List of Publications

22 がんウイルス 研 究 部 門 がん 遺 伝 子 研 究 分 野 Department of Viral Oncology Laboratory of Gene Analysis I. First Group 教 授 准 教 授 特 定 助 教 研 究 員 大 学 院 生 秋 山 芳 展 森 博 幸 檜 作 洋 平 ( 新 興 ウイルス 研 究 センター) 石 井 英 治 大 門 康 志 宮 﨑 亮 次 秋 山 光 市 郎 吉 谷 亘 平 坂 下 宗 平 何 あゆみ 明 後 尚 美 山 形 優 太 朗 米 重 大 河 技 術 補 佐 員 佐 野 美 智 代 本 年 は 理 学 研 究 科 大 学 院 生 (D1)として 吉 谷 亘 平 さんが 理 学 研 究 科 大 学 院 生 (M1)とし て 明 後 尚 美 さん 山 形 優 太 朗 さん 米 重 大 河 さ んが 医 学 研 究 科 大 学 院 生 (M1)として 何 あゆ みさんが 新 たに 加 わりました 一 方 博 士 研 究 員 の 田 中 夏 子 さんが 名 古 屋 大 学 に 移 動 して 新 たなテーマのもとで 研 究 を 始 め 又 三 登 一 八 さん 水 野 慎 也 さん 椋 野 翠 さんが 修 士 課 程 を 終 了 し 就 職 のため 研 究 室 を 去 りました 附 属 新 興 ウイルス 研 究 センター 特 定 助 教 の 檜 作 洋 平 博 士 とは 引 き 続 き 密 接 な 協 力 の 下 に 研 究 を 行 っています レポーター 系 を 用 いた 分 泌 モニタータンパク 質 VemP C 末 端 保 存 領 域 の 網 羅 的 変 異 解 析 細 菌 のタンパク 質 膜 透 過 には 膜 透 過 チャネル SecYEG 駆 動 因 子 SecA ATPase 膜 透 過 促 進 因 子 SecDF が 主 要 な 役 割 を 果 たしています 当 研 究 室 では SecDF は H + 輸 送 能 と 共 役 した 自 身 の 大 きな 構 造 変 化 により 膜 透 過 基 質 タンパク 質 を 非 細 胞 質 側 に 引 っ 張 り 出 す との 作 業 仮 説 を 提 案 し ています 1 近 年 海 洋 性 ビブリオ 菌 Vibrio alginolyticus が イオン 選 択 性 の 異 なる 2 種 の SecDF を 持 ちそれらの 発 現 が 食 塩 環 境 変 化 に 適 応 する 為 に 巧 妙 に 制 御 されていることを 見 いだしています Na + 駆 動 型 タンパク 質 V.SecDF1 の 発 現 は 恒 常 的 に 起 こるのに 対 して H + 駆 動 型 タンパク 質 V.SecDF2 の 発 現 は 通 常 は 厳 密 に 抑 制 されています 一 方 で 低 食 塩 環 境 下 などのタンパク 質 膜 透 過 能 が 低 下 す

23 る 状 況 において V.SecDF2 の 発 現 が 劇 的 に 上 昇 し 膜 透 過 能 の 維 持 に 働 きます この 発 現 制 御 には V.secDF2 と 同 一 オペロン 上 流 に 存 在 する vemp 遺 伝 子 によりコードされる 分 泌 タンパク 質 VemP (Vibrio export monitoring polypeptide)が 必 須 の 役 割 を 持 っています VemP は 細 胞 のタンパク 質 膜 透 過 能 を 自 身 の 分 泌 能 としてモニターし 分 泌 能 が 低 下 した 際 に C 末 端 近 傍 で 自 身 のタンパク 質 合 成 を 停 止 させ 下 流 の V.SecD2 の 翻 訳 を 促 します 2 この VemP の 翻 訳 停 止 には C 末 端 保 存 領 域 とリボソーム 内 壁 との 特 異 的 相 互 作 用 の 重 要 性 が 示 唆 されていますが 相 互 作 用 に 関 与 するアミ ノ 酸 残 基 の 同 定 を 含 め 詳 細 な 分 子 機 構 は 不 明 です この 問 題 の 解 明 を 目 指 して 多 数 の 変 異 体 を 簡 便 にかつ 効 果 的 にスクリーニング 可 能 な LacZ レ ポーター 系 を 構 築 しました 自 身 の 翻 訳 を 安 定 に 停 止 させるためにシグナル 配 列 を 欠 失 させた ΔSS VemP を LacZ とインフレームで 連 結 することにより C 末 端 保 存 領 域 内 への 変 異 導 入 に 伴 い 生 じる 翻 訳 停 止 能 の 低 下 を LacZ 活 性 の 上 昇 としてモニターすることができる 系 を 作 成 しました( 図 参 照 ) このレポーター 系 を 用 いて VemP C 末 端 領 域 を 構 成 するアミノ 酸 残 基 に 対 して 網 羅 的 なランダ ム 変 異 解 析 を 進 めています 予 備 的 な 結 果 ではありますが 置 換 をほとんど 許 容 しないアミノ 酸 残 基 等 が 見 つかる 等 の 興 味 深 い 知 見 が 得 られつつあります 1)Tsukazaki et al. Nature 474, 235(2011); 2)Ishii et al. PNAS 112, E5513(2015) ( 坂 下 秋 山 森 )

24 II. Second Group 本 年 度 はスタッフの 酒 井 柳 川 それに 加 えてサポートスタッフとして 工 学 部 の 坂 口 くんが 参 加 してくれています HPV 生 活 環 とウイルス 発 がん 機 構 の 解 明 HPV 感 染 症 は 代 表 的 な STD(Sexually Transmitted Disease: 性 感 染 症 )であり 広 く 蔓 延 している ことが 知 られています また 近 年 ではその 感 染 が 若 年 層 に 広 がっていることが 問 題 となっていま す HPV 感 染 は 発 がんと 関 連 することが 知 られていて 特 に 子 宮 頚 癌 では,ほとんどの 発 症 例 で HPV の 感 染 が 確 認 されており,HPV 感 染 が 子 宮 頚 癌 発 症 の 主 要 なリスクファクターであると 考 え られています HPV 感 染 によるがん 化 を 防 ぐためには,HPV の 感 染 複 製 を 抑 制 することが 効 果 的 であると 考 えられます しかし HPV の 複 製 遺 伝 子 発 現 の 制 御 は, 上 皮 細 胞 の 分 化 に 強 く 依 存 していて, 通 常 の 組 織 培 養 では HPV の 生 活 環 を 再 現 できないので,これまでその 制 御 機 構 はほと んど 分 かっていませんでした 私 たちは 既 に 皮 膚 モデル 培 養 系 を 用 いて,HPV の 複 製 を 組 織 培 養 下 で 再 現 しています この 系 をさらに 発 展 させるべく, 独 自 の HPV レプリコンを 構 築 し, 効 率 よく HPV の 複 製 遺 伝 子 発 現 機 構 を 解 析 する 手 法 を 検 討 しています ( 酒 井 ) LRP6 結 合 蛋 白 Krtap13 による Wnt シグナル 伝 達 経 路 活 性 化 のマウス 個 体 での 解 析 柳 川 は Wnt の Co-receptor である 一 回 膜 貫 通 型 蛋 白 LRP6 の 細 胞 質 ドメインに 結 合 する 蛋 白 とし て Keratin associated protein 13(Krtap13)を 見 いだした Wnt 非 存 在 下 Krtap13 を 強 制 発 現 させるだけで Wnt 経 路 の 著 しい 活 性 化 が 生 じた Krtap13 は 細 胞 膜 上 で LRP6 および Dvl と 共 に 凝 集 体 を 形 成 するが それは 通 常 の Wnt 経 路 を 活 性 化 の 際 に 生 じる LRP6 Signalosome の 代 わりをしていると 考 えられた Krtap13 による Wnt 経 路 の 活 性 化 が 与 える 影 響 を in vivo で 解 析 する 為 公 汎 な 組 織 での 発 現 が 可 能 な CAG プロモーターとヒト Krtap13 の cdna の 間 に lox-polya-lox 配 列 を 挿 入 した Trans gene (Tg)を 作 成 した この Tg マウスと 種 々の Cre マウスを 交 配 する 事 より recombinant Tg(R-Tg) 生 じさせ 組 織 特 異 的 に Krtap13 高 発 現 させる 事 が 出 来 た CAG-Cre マウスとの 交 配 によっては R Tg を 持 つマウスは 5%しか 誕 生 しなかったが そのうちの 25%のマウスは 週 齢 を 経 ると 悪 性 リンパ 腫 / 白 血 病 を 発 症 した 名 古 屋 大 学 生 体 反 応 病 理 学 の 豊 国 先 生 に 協 力 頂 き 解 析 中 である ( 柳 川 )

25 Department of Viral Oncology Laboratory of Cell Regulation Members Professor Assistant Professor Assistant Professor Graduate Student Masahiko Sugita Daisuke Morita Tatsuaki Mizutani Satoru Murata, Yukie Yamamoto, Ayumi Miyamoto, Yoshiharu Takama, Yuya Yoshioka, Toshiaki Ano, Eri Sakurai, Yoko Shima Introduction Presentation of protein-derived peptide antigens (Ags) by major histocompatibility complex (MHC)- encoded class I and class II molecules has been a central dogma in modern immunology. Peptide Ags bound to MHC molecules are recognized by T cells bearing alpha/beta T-cell receptors (TCRs). However, the paradigm that Ag-specific T cell activation only involved recognition of peptide Ags turned out to be incorrect. T cells bearing alpha/beta TCRs are now known to recognize lipid Ags in a group 1 CD1 (CD1a, -b, and -c)-dependent manner. Thus, the Ag-specific adaptive immune system comprises two separate pathways, one directed against peptide Ags (mediated by MHC molecules) and the other directed against lipid Ags (mediated by group 1 CD1 molecules). These two pathways function cooperatively to achieve highest levels of Ag-specific host defense. Both MHC and CD1 pathways are equally important; however, only several laboratories, including ours, appear to focus intensely on the latter pathway. This is primarily due to the fact that mice and rats that are highly useful for immunological studies have deleted genes for group 1 CD1 family, and thus, lack the lipid recognition system that is comparable to that in humans. Therefore, we have attempted to develop three distinct but complementary animal models; namely, human CD1 transgenic (Tg) mice, guinea pigs, and rhesus monkeys. The human CD1A genome-tg mice were established, in which the two major cell types, immature thymocytes and epidermal Langerhans cells, specifically expressed human CD1a proteins. Alternatively, we found guinea pigs invaluable for lipid immunity research as the animals have evolved the CD1 system that is equivalent to that in humans. Finally, our laboratory has made enormous efforts to set up lipid immunity research using non-human primates, such as rhesus macaques. As described below, rhesus monkeys have now been analyzed extensively in our laboratory for lipid immunity to mycobacteria and SIV, resulting in the identification of lipid-based vaccine candidates against tuberculosis and the discovery of viral lipopeptide-specific CTL responses.

26 Topics 1) Lipid-specific innate and adaptive immunity in tuberculosis: T. MIZUTANI, A. MIYAMOTO, S. MURATA, T. ANO, D. MORITA and M. SUGITA Mycobacteria, such as Mycobacterium tuberculosis and M. avium complex, possess highly lipid-rich cell walls that are critical not simply for their acid-fast properties but also for their survival and replication. The cell wall contains mycolic acids (MAs), an alpha-alkyl-beta-hydroxy fatty acid with extremely long carbon chains (~C 80 ), which are densely aligned in covalent association with the underlying arabinogalactan sugar layer. Arabinogalactan-linked MAs extend outward and interact non-covalently with carbon chains of the surface exposed mycolyl lipids, thereby forming the hydrophobic cell wall architecture that is unique to mycobacteria. For the past several years, our research has focused on the immunobiology of glucose monomycolate (GMM), a mycolyl glycolipid presented by human CD1b and rhesus CD1b/CD1c molecules. Pathogenic mycobacteria biosynthesize this glycolipid species by utilizing host-derived glucose as a competitive substrate for their mycolyltransferases, and thus, GMM is a marker lipid for mycobacteria that sustain active metabolism in the host (J. Biol. Chem. 283: , 2008). Furthermore, the host response to GMM is associated with skewed production of TH1 cytokines (J. Biol. Chem. 286: , 2011) that occurs at the site of infection (Infect. Immun. 81: , 2013). We have continued evaluating the potential of GMM as a lipid-based vaccine in the guinea pig and rhesus monkey models, resulting in the demonstration of the protective immunity conferred by the administration of GMM in liposomes (unpublished). The innate immune recognition of mycolyl lipids has also been addressed in our laboratory. We previously found that glycerol monomycolate (GroMM) functioned as a potent ligand for human, but not mouse macrophage inducible C-type lectin, Mincle (J. Biol. Chem. 289: , 2014). This year, we detected the granulomatogenic activity of GroMM, and, by generating neutralizing anti-guinea pigs Mincle monoclonal antibodies, we are now evaluating directly how Mincle functions impact on the formation of grauloma, a hallmark of tuberculosis pathology (unpublished). 2) Lipopeptide-specific immunity in AIDS: D. MORITA, Y. YAMAMOTO, Y. YOSHIOKA, Y. TAKAMA, Y. SHIMA, E. SAKURAI, T. MIZUTANI and M. SUGITA By taking full advantage of IVR s superb research environments, we have been encouraged to address a fundamental and potentially important question as to how lipid immunity functions in host defense against viral infections. Given that some of the viral proteins require modification with host-derived fatty acids for their critical functions, we hypothesized that the host immunity might be able to detect lipidated viral proteins (lipoproteins). Indeed, we previously found that rhesus macaque monkeys infected with the simian immunodeficiency virus (SIV) mounted cytotoxic T lymphocyte responses to N-myristoylated SIV Nef 5-mer

27 lipopeptide (C14nef5) (J. Immunol. 187: , 2011; J. Virol. 87: , 2013). This year, the molecular mechanisms underlying the lipopeptide presentation were finally elucidated. Despite our initial prediction, CD1 molecules are not required for the lipopeptide presentation; instead, the MHC class I-encoded molecule, termed Mamu-B*098, was identified as a critical element for lipopeptide presentation, being capable of binding C14nef5 and presenting it to specific T cells. The crystal structure of the MHC class I:C14nef5 was determined, detecting a unique groove structure suitable for accommodating lipopeptides rather than long peptides. These findings now challenge the well known paradigm for antigen presentation that MHC class I molecules mediate the presentation of 8-10mer peptides (Nat. Commun. 7: 10356, 2016). List of Publications Morita, D and Sugita, M.: "Discovery of a lipopeptide Ag-presenting molecule: its molecular identity and X-ray crystallographic structure", The 10th International Symposium of the Institute Network, Sapporo, July, Morita, D and Sugita, M.: "Discovery of lipopeptide Ag-presenting molecules: its molecular identity and X-ray crystallographic structure", The 44th Annual Meeting of The Japanese Society for Immunology, Sapporo, Nov, 杉 田 昌 彦 : 脂 質 免 疫 : 結 核 菌 やエイズウイルスに 対 抗 する 新 しい 獲 得 免 疫 システム 第 89 回 日 本 感 染 症 学 会 総 会 京 都 2015 年 4 月 16 日

28 がんウイルス 研 究 部 門 細 胞 制 御 研 究 分 野 Department of Viral Oncology Laboratory of Cell Regulation 教 授 助 教 特 定 助 教 杉 田 昌 彦 森 田 大 輔 水 谷 龍 明 大 学 院 生 邑 田 悟 山 本 侑 枝 宮 本 歩 己 高 間 義 晴 吉 岡 佑 弥 阿 野 敏 明 櫻 井 絵 理 嶋 燿 子 MHC 分 子 は タンパク 質 断 片 であるペプチドを 結 合 し T 細 胞 に 抗 原 提 示 する これによって 活 性 化 したタンパク 質 抗 原 特 異 的 T 細 胞 は 標 的 細 胞 の 傷 害 やさまざまなサイトカイン 産 生 を 通 し て 有 効 な 獲 得 免 疫 を 成 立 させる 一 方 私 たちの 研 究 室 では 脂 質 免 疫 を 切 り 口 として タン パク 質 免 疫 と 対 峙 する 獲 得 免 疫 経 路 の 研 究 を 展 開 してきた ヒトグループ 1CD1 分 子 が 結 核 菌 由 来 の 脂 質 を 結 合 し 脂 質 特 異 的 T 細 胞 応 答 を 誘 起 することは これまでも Annual Report の 紙 面 で 紹 介 してきた 通 りである つまり 獲 得 免 疫 はタンパク 質 を 標 的 とした MHC 依 存 的 経 路 と 脂 質 を 標 的 とした CD1 依 存 的 経 路 の 総 和 として 成 立 するという 発 想 であった 今 回 旧 来 の MHC 概 念 だけ でなく 私 たちが 描 く MHC/CD1 両 立 パラダイムすら 修 正 が 必 要 となる 新 しい 発 見 があった ウイルス 感 染 防 御 における 脂 質 免 疫 の 存 在 や 意 義 を 考 え 始 めたのは 2005 年 頃 であったと 記 憶 し ている ウイルスには 固 有 の 脂 質 などない したがって 脂 質 免 疫 は 存 在 しない と 誰 もがそう 考 え ていた しかし たとえばエイズウイルス Nef タンパク 質 が 免 疫 抑 制 機 能 を 発 揮 するためには 脂 質 修 飾 (ミリスチン 酸 修 飾 )を 受 けることは 必 須 である 脂 質 修 飾 を 受 けたタンパク 質 の 断 片 す なわちリポペプチドが 新 たな 獲 得 免 疫 のターゲットになったら 面 白 いのでは と 考 えたのであっ た さっそくアカゲザルエイズモデルを 用 いた 検 証 作 業 に 入 る Nef リポペプチド 特 異 的 CD8 陽 性 T 細 胞 が 樹 立 できた 簡 単 に CD1 拘 束 性 が 示 せるかと 思 ったが どうやってもポジティブな 結 果 が 得 られない いまから 思 うと 少 し 落 とし 穴 があって MHC 拘 束 性 も 見 えなかった 新 しい 抗 原 提 示 分 子 の 存 在 を 確 信 し リポペプチド 特 異 的 T 細 胞 応 答 を 阻 害 するモノクローナル 抗 体 を 多 数 得 て そこから 抗 原 提 示 分 子 を 認 識 する 抗 体 を 探 すことになる 結 果 MHC クラス 1 分 子 を 認 識 す るモノクローナル 抗 体 が 得 られてきたのは なんとも 遠 回 りで 皮 肉 であるが これも 研 究 の 面 白 さ だろう アカゲザル MHC は 複 雑 であり 候 補 遺 伝 子 の 単 離 に 難 渋 したが ようやく full-length cdna が 単 離 できた リコンビナントタンパク 質 を 得 cell-free アッセイで TCR による 特 異 的 認 識 を 実 証 できた 時 点 で MHC 分 子 がリポペプチドを 提 示 する 確 信 を 得 た

29 最 終 段 階 は リポペプチドを 結 合 した MHC クラス 1 分 子 の 結 晶 構 造 を 解 き 明 かすことである 結 晶 化 の 条 件 を 決 定 するだけでも 1 年 近 くを 要 した 苦 労 は 大 きかったが 得 られた 結 晶 構 造 に 息 をのんだ リガンドのミリスチン 酸 部 分 がきれいに 折 り 畳 まれて 本 来 アンカーアミノ 酸 が 収 納 さ れる B ポケットに 納 まっている 嵩 のある 疎 水 性 のアシル 鎖 を 収 納 すべく この MHC クラス 1 分 子 の B ポケットの 壁 面 底 面 には 小 さな 側 鎖 を 持 つアミノ 酸 や 疎 水 性 アミノ 酸 が 程 よく 配 置 され ていた 逆 に F ポケットは 小 さく ミリスチン 酸 修 飾 にエッセンシャルなアミノ 酸 であるセリン をアンカー 残 基 として 収 納 していた( 図 参 照 ) まさに ミリスチン 酸 修 飾 リポペプチドを 提 示 す るために 進 化 してきた MHC クラス 1 アリルと 言 って 過 言 ではない リポペプチド 免 疫 パラダイムの 確 立 に 向 けた 第 一 歩 が 踏 み 出 されたと 思 う 杉 田 研 らしいコツコ ツとした 努 力 を 積 み 重 ねれば 少 し 時 間 はかかるかもしれないが ゴールが 見 えてくるだろう そ う 確 信 した 1 年 であった 図.リポペプチドの 抗 原 提 示 様 式 A. MHC クラス 1: リポペプチド 複 合 体 の 全 体 構 造 ( 解 像 度 1.76 A ) B. 抗 原 結 合 溝 の 構 造 リポペプチド( 黄 色 スティック)の 両 末 端 ミリスチン 酸 と C 末 端 アミノ 酸 (セリン) 残 基 が 溝 内 に 深 く 収 納 されており アンカーとして 機 能 する( 上 図 ) ミリスチン 酸 は 大 きく 疎 水 性 の 高 い B ポケット( 赤 色 ) C 末 端 アミノ 酸 は 親 水 性 の 小 さな F ポケット( 紫 色 )に 収 納 される( 下 図 ) C. リポペプチド 抗 原 提 示 モデル 両 末 端 が MHC クラス 1 分 子 への 結 合 に 関 わり ペプチド 中 央 の 3 アミノ 酸 が T 細 胞 の 認 識 に 関 わる

30 Department of Viral Oncology Laboratory of Tumor Biogenesis Members Professor Assistant Professor Shin Yonehara Akira Murakami Introduction Apoptosis, or programmed cell death, plays an important role in many biological processes, including embryogenesis, development of immune system, maintenance of tissue homeostasis, and elimination of virus-infected and tumor cells. We found cell surface Fas antigen (Fas), which can directly mediate apoptosis-inducing signals into cells by stimulation with agonistic anti-fas mab or Fas ligand. Our main research project is to understand the intracellular signal transduction mechanism of cell death including apoptosis and caspase-independent novel types of cell death, and the biological significance/physiological role of cell death and cell death-regulating molecules. Investigations of molecular mechanisms and physiological roles of cell death are important for a better understanding of mammalian immune system, embryogenesis and tumorigenesis. Topics 1) Caspase-8 and RIP kinases regulate retinoic acid-induced necroptosis and cell differentiation: M. SOMEDA, S. KUROKI, M. TACHIBANA and S. YONEHARA Caspase family members are involved in execution of apoptosis. Among them caspase-8 (Casp8) is unique with associated critical activities to induce and suppress death receptor-mediated apoptosis and necrosis, respectively. Casp8 inhibits necroptosis, a form of necrosis, through suppressing the function of receptor interacting protein kinase 1 (RIP1 or RIPK1) and RIP3 (RIPK3). Disruption of Casp8 expression causes embryonic lethality in mice at embryonic day (E) 11.5, which is rescued by depletion of RIP3, suggesting that the defect of Casp8-deficient embryos is traced back to its activity to suppress necroptosis. To examine the role of Casp8 in embryogenesis, we established ES cells with tetracyclin/doxicyclininducible (Tet-On) expression system of short hairpin RNA specific for Casp8. Induced knockdown of Casp8 expression was shown to markedly enhance retinoic acid (RA)-induced cell death and differentiation of embryonic stem (ES) cells as well as RA-induced gene expression. Interestingly, expression levels of RIP1, RIP3 and MLKL (an execution molecule of necroptosis) were markedly increased by treatment with RA in the absence of Casp8, suggesting that the enhancement of RA signaling enhances sensitivity to necroptosis.

31 The marked enhancement of RA signaling was dependent on RIP1 and RIP3 but independent of MLKL. Knockdown of Casp8 expression induced nuclear transportation of RIP3 and complex formation of retinoic acid receptor (RAR) to RIP1 and RIP3 in nucleus. RA treatment induced binding of the complex to RA response element (RARE) at the promoter region of RA-responsible genes. Furthermore, RA-dependent gene expression was strengthened in Casp8-deficient mouse embryos around E Administration of RA antagonist to pregnant mice significantly suppressed the lethality of Casp8-deficient embryos at E 11.5, but did not at E12.5. Thus abnormality of Casp8-deficient embryo, which is dependent on necroptosis mediated by RIP1, RIP3 and MLKL, is regulated by RIP1/RIP3-mediated abnormal stimulation of RA signaling in the absence of Casp8. 2) Caspase-10 plays an essential role in survival of human cancer cells: Y. MORI and S. YONEHARA Stimulation of Fas (CD95) with FasL in human cells induces the formation of death-inducing signaling complex (DISC), containing FADD, cflip, Caspase-8 and Caspase-10. Caspase-8 is activated in the DISC, leading to initiation of apoptosis. Activation of Caspase-8 was also reported to be involved in non-apoptotic signaling pathways, such as activation of ERK, NF-κB and Akt pathways. In contrast to Caspase-8, physiological roles of Caspase-10 in apoptotic and non-apoptotic pathways have been poorly understood. The reason for the lack of understanding is that Caspase-10 cannot be examined in mouse system owing to the deletion of Caspase-10 gene in mice. To reveal the functions of Caspase-10, we utilized Doxycycline (Dox)- inducible Caspase-10 knockdown system in various types of human cells. Downregulation of Caspase-10 expression was shown to induce cell death in human cancer cell lines, such as Jurkat, U937, HCT116 and U2OS cells. Interestingly, knockdown of Caspase-10 expression did not show any effects in an untransformed diploid fibroblast, WI-38. In Jurkat cells, downregulation of Caspase-10 expression increased the number of apoptotic cells with cleaved Caspase-3. Treatment of the cells with either zvad-fmk (a pan-caspase inhibitor) or zlehd-fmk (a Caspase-9-specific inhibitor) inhibited the cell death induced by Caspase-10 knockdown. Thus Caspase-10 was shown to always inhibit apoptosis in human cancer cells. In addition, we find that the inhibition of the apoptosis in Caspase-10 knockdown cancer cells triggered induction of another type of necrosis-like cell death. Taken together, Caspase-10, which is involved in the apoptosis-inducing signal via death receptors, always inhibits both Caspase-9/Caspase-3-dependent apoptosis and a novel type of necrotic cell death in human cancer cells. 3) A novel function of FLASH/casp8ap2 in regulation of nonapoptotic cell death: A. KAKO and S. YONEHARA Programmed cell death is involved in maintenance of homeostasis, and regulation of morphogenesis in developmental stage. The failure of cell death results in a multiple of disease, such as cancer and autoimmune disease. Thus, better understanding the mechanism of cell death is important for therapeutic development of

32 incurable disease. Programmed cell death is mainly composed of apoptosis and necroptosis, and both are regulated by caspase-8: caspase-8 is at an initiator of Fas-mediated apoptosis and an inhibitor of necroptosis. FLASH (FLICE-associated huge protein)/casp8ap2 was originally identified as a caspase-8-associated protein, and has been shown to play a role in multiple cellular processes including regulation of apoptosis, cell cycle progression, processing histone mrna, and transcriptional control. In various types of cell lines derived from carcinoma and sarcoma, downregulation of FLASH expression was clearly shown to inhibit cell cycle progression in the S-phase; however, in several cancer cell lines from leukemia, we found that FLASHknockdown does not affect cell cycle progression. Then, we analyzed effects of FLASH-knockdown on apoptosis and necroptosis in human histiocytoma-derived U937 cells. In U937 cells, FLASH knockdown enhanced sensitivity to not only apoptosis but also necroptosis induced by TNF-α stimulation. These results indicate that FLASH can regulate the two types of programmed cell death, apoptosis and necroptosis, independently on its effects on cell proliferation. 4) A role of Wnt signals in the mesodermal differentiation of mouse ES cells: A. MURAKAMI ES cells are induced to differentiate into cells at the mesoderm lineage under culture conditions forming embryoid bodies. Among many signaling pathways or factors involved in the process, we are currently interested in a Wnt signaling pathway. An inhibitor of Wnt signals completely blocks the mesoderm induction. So far, Wnt3 and Wnt8a have been identified to play a role in the mesoderm induction through an activation of Brachyury expression, one of key factors. In addition, several other Wnt family members are expressed at earlier stages, suggesting their role in the differentiation. From the earlier stages of the differentiation, embryoid bodies are covered with a layer of visceral endoderm. Our current hypothesis is that the visceral endoderm is induced via Wnt signals and then involved in the mesoderm induction. An inhibitor of Wnt signals, IWP-2, inhibited expression of visceral endoderm markers including Gata6, a key factor of visceral endoderm induction. Knockdown of Gata6 expression resulted in down regulation of Wnt3 and Wnt8a expression, and suppressed the mesoderm induction as well. Among the Wnt family members, Wnt1 seems to play a role in the visceral endoderm formation, as knockdown of Wnt1 expression suppressed expression of visceral endoderm markers as well as those of the mesoderm. Thus, Wnt signals seem to function at two stages of the mesoderm induction. One is for the induction of visceral endoderm and the other is for the direct induction of mesoderm through an activation of Brachyury expression. List of Publications Chalabi-Dchar M, Cassant-Sourdy S, Duluc C, Fanjul M, Lulka H, Samain R, Roche C, Breibach F, Delisle MB, Poupot M, Dufresne M, Shimaoka T, Yonehara S, Mathonnet M, Pyronnet S, and Bousquet C. (2015). Loss of somatostatin receptor subtype 2 promotes growth of KRAS-induced pancreatic tumors in mice by

33 activating PI3K signaling and overexpression of CXCL16. Gastroenterology 148, Yonehara S: Caspase-8 and RIP Kinase Regulate Retinoic Acid-Induced Cell Differentiation. Japan Australia Meeting on Cell Death, Melbourne, October 21-23, 米 原 伸 : 招 待 講 演. 生 命 科 学 からみた 老 化 と 寿 命 国 際 高 等 研 究 所 老 いを 考 える 第 6 回 研 究 会 木 津 川 市 ( 京 都 府 ) 1 月 24 日 米 原 伸 :Caspase-8 と RIP キナーゼが 制 御 する 細 胞 死 と 細 胞 分 化, 第 24 回 日 本 Cell Death 学 会 学 術 集 会 シンポジウム I 細 胞 死 とミトコンドリア Hippo pathway 吹 田 市 ( 大 阪 府 ) 7 月 11 日 米 原 伸 : 特 別 講 演. 細 胞 の 死 が 支 える 生 体 の 生 と 機 能 ~ 自 爆 するための 細 胞 表 層 レセプターの 発 見 から 多 様 なプログラム 細 胞 死 の 解 析 について~ 洛 友 会 東 京 支 部 秋 の 講 演 会 東 京 11 月 10 日 Sakaguchi S, Kuroki S and Yonehara S: Novel types of programed necrosis induced by IFN-γ in wild-type and caspase-8 KO mouse embryonic fibroblasts. Short-Talk session. The 13th International Student Seminar, Kyoto, 3-4 February Kako A and Yonehara S: Analysis of the function of FLASH/casp8ap2 in regulation of apoptotic and nonapoptotic cell death. Poster session. The 13th International Student Seminar, Kyoto, 3-4 February 加 古 彩 華 米 原 伸 :FLASH/casp8ap2 の 非 アポトーシス 性 細 胞 死 制 御 という 新 規 機 能 第 38 回 日 本 分 子 生 物 学 会 年 会 神 戸 市 2015 年 12 月 1-4 日. 森 勇 貴 米 原 伸 :Caspase-10 はヒトがん 細 胞 の 生 存 維 持 に 寄 与 する 第 38 回 日 本 分 子 生 物 学 会 年 会 神 戸 市 2015 年 12 月 1-4 日.

34 がんウイルス 部 門 生 体 発 がん 機 構 研 究 分 野 Department of Viral Oncology Laboratory of Tumor Biogenesis 教 授 助 教 米 原 伸 村 上 昭 当 研 究 分 野 は 生 命 科 学 研 究 科 に 所 属 しているが 米 原 はウイルス 研 生 体 発 がん 機 構 研 究 分 野 を 併 任 し 村 上 はウイルス 研 に 所 属 している 平 成 27 年 の 4 月 に 生 命 科 学 研 究 科 の 修 士 課 程 に 大 西 景 子 和 田 柚 季 そして 台 湾 から 江 佳 臻 が 入 学 した 生 命 科 学 研 究 科 修 士 課 程 を 3 月 に 修 了 した 学 生 では 加 古 彩 華 が 博 士 後 期 課 程 に 進 学 し 田 畑 祐 貴 と 鈴 木 雄 太 は 就 職 した また 中 国 からの 留 学 生 である 黄 達 度 と 董 晟 璐 は 9 月 に 修 士 課 程 を 終 了 し 新 たな 道 に 進 んだ 修 士 課 程 を 終 了 後 も 在 籍 していた 山 本 那 由 と 博 士 後 期 課 程 に 在 籍 していた 胡 暁 恬 も 巣 立 っていった 研 究 費 の 経 理 を 初 めとする 研 究 室 の 秘 書 業 務 は 中 橋 直 子 が 執 り 行 い 研 究 室 の 円 滑 な 運 営 が 行 われている また 生 命 科 学 研 究 科 とウイルス 研 究 所 が 共 催 する 国 際 学 生 セミナーの 秘 書 として 西 村 美 穂 が 参 加 し 国 際 学 生 セミナー 学 生 実 行 委 員 会 の 活 動 を 支 え ている 本 研 究 分 野 では 米 原 が 発 見 命 名 したアポトーシス 誘 導 レセプター 分 子 Fas の 研 究 を 出 発 点 と し アポトーシスやそれ 以 外 の 新 しい 細 胞 死 に 関 する 研 究 細 胞 死 関 連 分 子 の 多 様 な 生 物 活 性 に 関 する 研 究 を 行 っている 各 個 人 の 研 究 内 容 について 簡 単 に 紹 介 する 1)caspase-8 と RIP キナーゼが 調 節 する 多 様 な 細 胞 死 と 細 胞 分 化 Fas が 媒 介 するアポトーシスでは 開 始 caspase として caspase-8 の 活 性 化 が 必 要 不 可 欠 である ア ポトーシスの 誘 導 では Fas を 中 心 にアダプター 分 子 である FADD と caspase-8 前 駆 体 が 複 合 体 を 形 成 し その 中 で caspase-8 前 駆 体 が 隣 接 した casapase-8 前 駆 体 を 切 断 し 活 性 化 する 活 性 化 した caspase-8 は 下 流 の 実 行 caspase である caspase-3 の 前 駆 体 を 切 断 活 性 化 し 活 性 化 caspase-3 が 様 々 な 細 胞 内 の 基 質 タンパク 質 (death substrates)を 切 断 することによってアポトーシスが 実 行 される 一 方 Fas などの Death receptor 遺 伝 子 の KO マウスは 個 体 発 生 の 異 常 は 認 められないのに 対 し 下 流 の FADD や caspase-8 の KO マウスは 胎 生 致 死 である FADD や caspase-8 は Fas を 介 するアポトー シス 以 外 の 機 能 を 有 する 可 能 性 が 考 えられたが その 機 能 は 計 画 的 ネクローシスの 一 種 であるネク ロプトーシス(caspase-8 が 抑 制 し RIP キナーゼ 1 と 3 が 媒 介 する)の 抑 制 であることが 示 され caspase-8 KO マウスの 胎 生 致 死 という 表 現 型 はネクローシスの 亢 進 によると 考 えられている この

35 ような 状 況 のもと ES 細 胞 を 用 いて 遺 伝 子 の 発 現 や 発 現 抑 制 を 誘 導 する 系 を 用 いて 染 田 真 孝 は caspase-8 の 発 現 抑 制 を 誘 導 すると 分 化 誘 導 に 重 要 なレチノイン 酸 シグナル 伝 達 系 が RIPK1 と 3 依 存 的 に 強 く 増 強 されるという 現 象 を 見 いだした そして レチノイン 酸 シグナルが RIPK 依 存 的 に ネクローシスを 強 く 誘 導 することが caspase-8 KO マウスの 胎 生 初 期 での 死 亡 に 関 与 することを 明 らかにしている また 当 研 究 室 では γ 型 インターフェロンが caspase-8 の 発 現 や 活 性 が 阻 害 された 条 件 下 で RIPK3 に 依 存 した 計 画 的 ネクローシスを 誘 導 するという 新 しい 系 を 見 いだしている 阪 口 翔 太 は caspase-8 KO マウス 由 来 細 胞 と caspase-8 の 活 性 が 阻 害 された 細 胞 では γ 型 インターフェロンがネクローシ スを 同 じように 誘 導 するが その 分 子 機 構 が RIPK1 の 必 要 性 とネクローシスの 実 行 段 階 におけるミ トコンドリアの 必 要 性 の 両 方 において 異 なっていることを 見 いだし 解 析 を 行 っている 陳 建 成 は γ 型 インターフェロンが 誘 導 するネクローシスでは 細 胞 死 に 先 立 ち 細 胞 膜 のホスファティジルセ リンの 露 出 が 誘 導 されるという 新 しい 現 象 を 見 いだし その 分 子 機 構 を 解 析 している ヒトには caspase-8 と 類 似 した caspaes-10 が 存 在 するが マウスには caspase-10 は 存 在 しない 森 勇 貴 は casepae-10 の 発 現 抑 制 誘 導 系 を 立 ち 上 げ 様 々なヒト 細 胞 株 における 効 果 を 解 析 し casepaes-10 の 発 現 抑 制 によって 多 くの 腫 瘍 由 来 細 胞 株 ではアポトーシスが 誘 導 されるが 正 常 細 胞 では 細 胞 死 は 誘 導 されないという 興 味 深 い 結 果 を 見 いだし この 活 性 には caspase-10 の 二 種 類 の アイソタイプが 必 要 であることを 示 している また 大 西 景 子 はマウス caspase-8 とヒト caspae-8 お よび caspase-10 の 相 互 関 係 について 解 析 を 進 めている 2) 細 胞 死 細 胞 増 殖 関 連 分 子 の 多 様 な 生 理 病 理 機 能 の 関 係 我 々が Fas シグナルとの 関 連 で 見 いだした 巨 大 分 子 FLASH は 癌 腫 や 肉 腫 由 来 細 胞 株 の 細 胞 周 期 S 期 の 進 行 に 必 要 不 可 欠 であるが 正 常 細 胞 造 血 系 腫 瘍 細 胞 株 や ES 細 胞 では 細 胞 増 殖 に 必 要 ではない この 細 胞 種 の 特 異 性 を 解 明 するために Akila Ram は 正 常 細 胞 に 発 現 する 責 任 遺 伝 子 の 同 定 を 目 指 している 加 古 彩 華 は FLASH の 発 現 抑 制 が 細 胞 周 期 進 行 を 阻 害 するだけでなく caspase-8 発 現 条 件 下 でもネクロプトーシス 細 胞 死 を 誘 導 すること また 細 胞 種 が 異 なればその 感 受 性 を 増 強 することを 見 いだし そのメカニズムを 解 析 している 松 本 礼 美 は FLASH が 細 胞 周 期 特 異 的 ヒストンバリアントの 発 現 に 関 わることから FLASH 発 現 抑 制 が 細 胞 内 のヒストンバリア ントの 種 類 を 変 化 させることが 細 胞 増 殖 制 御 に 関 連 するかを 解 析 し FLASH 発 現 抑 制 時 に 発 現 す るノンカノニカルヒストン H1 の 一 つの 分 子 種 が 細 胞 周 期 S 期 進 行 を 抑 制 する 活 性 を 見 いだしてい る 和 田 柚 季 は FLASH の 細 胞 周 期 進 行 に 必 要 な 新 しいドメインとその 機 能 の 研 究 を 行 っている 齊 藤 圭 亮 と 南 美 都 里 は 当 研 究 室 で 開 発 されたレンチウイルスベクターと shrna 発 現 誘 導 系 を 用 いることにより がん 治 療 の 標 的 分 子 として 開 発 が 進 んでいる Caprin-1 について 研 究 を 行 ってい る 興 味 深 いことに Caprin-1 の 発 現 抑 制 を 誘 導 すると 細 胞 増 殖 が 抑 制 されるが がん 細 胞 株 では

36 新 しいタイプの 未 知 の 細 胞 死 が 誘 導 される 一 方 正 常 細 胞 では 細 胞 死 は 一 切 誘 導 されない 結 果 を 取 得 し 解 析 を 行 っている また 武 田 仁 紀 は 分 裂 期 の 染 色 体 凝 縮 を 担 うコンデンシンのサブユ ニットである Smc-2 の 発 現 抑 制 を 誘 導 することによって がん 細 胞 株 では 細 胞 死 が 誘 導 され 正 常 細 胞 では 細 胞 老 化 に 類 似 した 表 現 型 が 誘 導 される 系 の 解 析 を 行 っている 3)B 細 胞 からの IgE 産 生 を 増 強 させる Fas-expressing natural helper(f-nh) 細 胞 当 研 究 室 では Balb/c の 遺 伝 的 背 景 下 の Fas KO マウスが 高 IgE 産 生 を 伴 うアレルギー 炎 症 を 発 症 することを 見 いだし このマウスを 用 いて B 細 胞 からの IgE 産 生 を 強 く 誘 導 する 新 しい 細 胞 種 を 同 定 し Fas-expressing natural helper(f-nh) 細 胞 と 命 名 している その 実 態 と 機 能 を 明 らかにする ために 大 嶋 夏 美 が F-NH 細 胞 の 増 殖 機 構 などの 解 析 を 行 っている 4)マウス 初 期 発 生 における Wnt シグナルの 解 析 村 上 は マウスの 胚 発 生 初 期 に 内 中 外 胚 葉 が 誘 導 される 機 構 を 胚 性 幹 細 胞 (ES 細 胞 )を 用 いて 解 析 している 特 に 中 胚 葉 への 分 化 の 誘 導 に 関 与 している Wnt シグナルに 焦 点 を 当 ててい る 近 年 は 内 胚 葉 からのシグナルによる 中 胚 葉 の 誘 導 過 程 に どのような Wnt シグナルが 如 何 に 関 与 しているのかを 明 らかにしたいと 考 えている